人胃腸上皮組織類器官的構(gòu)建與保藏操作指南

·中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)·

生物醫(yī)藥行業(yè)已成為當(dāng)今發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域之一。高水平生物醫(yī)藥的發(fā)展，尤其是腫瘤的診斷與治療對于研究模型的需求日益增加。傳統(tǒng)常用的細(xì)胞系模型經(jīng)歷了體外長期培養(yǎng)中基因組變異壓力的選擇，導(dǎo)致有些細(xì)胞系已難以反映原始腫瘤的生物學(xué)行為和對藥物治療的反應(yīng)。因此出現(xiàn)采用癌細(xì)胞系進(jìn)行的藥物篩選體外治療有效，但在后續(xù)臨床研究中失敗的案例，究其原因至少有一部分是因?yàn)榧?xì)胞系不能代表來源腫瘤的生物學(xué)特征。動物實(shí)驗(yàn)是癌癥研究中的另外一種傳統(tǒng)模型，比如免疫缺陷小鼠動物模型和病人源性異種移植瘤模型（patient-derived xenograft，PDX）。但移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)的腫瘤組織盡管在一定程度上反映腫瘤的基因型與表型特征，在發(fā)病機(jī)制、新型分子靶點(diǎn)研究或者臨床前治療藥物敏感性評價(jià)中發(fā)揮了一定作用，但此類模型存在生長體系內(nèi)缺乏完整免疫系統(tǒng)的不足。此外，PDX 模型相對昂貴并且擴(kuò)增周期較長。2009 年問世的類器官（organoid）作為新型實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可以?shí)現(xiàn)對多種組織的體外培養(yǎng)、低溫保藏和復(fù)蘇再傳代操作。類器官模型較好地保留了起源組織的形態(tài)表型、組織細(xì)胞功能、生物學(xué)行為以及基因組變異譜特征，可以滿足眾多的生物醫(yī)藥研究需求。2017 年，類器官被國際著名期刊評選為生命科學(xué)領(lǐng)域年度技術(shù)。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化外科研究所在國內(nèi)較早開展胃腸腫瘤生物樣本庫建設(shè)，收集各類生物樣本逾 3000 例。類器官作為一種保持細(xì)胞活力的可再生生物樣本，被譽(yù)為“活組織庫”（living biobank），是新一代生物樣本庫建設(shè)的重點(diǎn)領(lǐng)域。上海瑞金醫(yī)院于穎彥教授作為中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會組織生物樣本庫分會常委，自 2018 年起依托上海瑞金醫(yī)院胃腸道腫瘤患者多、生物樣本資源豐富、冷凍設(shè)備齊全、技術(shù)輔助人員操作熟練等諸多優(yōu)勢，率先啟動了胃腸道黏膜組織與腫瘤組織類器官的構(gòu)建研究，該項(xiàng)工作的起步幾乎與國際同領(lǐng)域同步，2020 年取得上海市科委的專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)支持，2021 年以胃癌類器官模型為基礎(chǔ)篩選免疫檢查點(diǎn)多靶點(diǎn)聯(lián)合抑制劑相關(guān)研究成果發(fā)表于國際癌癥研究權(quán)威刊物。

為了進(jìn)一步推動中國胃腸道組織尤其是胃腸道腫瘤類器官活組織庫建設(shè)，針對生物樣本采集、類器官培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇、類器官質(zhì)量控制、類器官生長狀態(tài)鑒定等多個(gè)環(huán)節(jié)，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院與生物芯片上海國家工程研究中心自 2020 年 2 月著手起草《人胃腸上皮組織類器官的構(gòu)建與保藏操作指南》。2020 年 4 月在中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會的標(biāo)準(zhǔn)工作專家委員會視頻會議上審定該項(xiàng)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)草案，進(jìn)一步明確了本標(biāo)準(zhǔn)起草的總體思路。起草小組根據(jù)專家提出的建議對標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行修訂，2020 年12 月在中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會組織生物樣本庫分會內(nèi)以函評形式廣泛征求領(lǐng)域內(nèi)專家意見，起草小組根據(jù)反饋意見予以修改。2021 年 4 月又進(jìn)一步邀請到領(lǐng)域內(nèi) 10 位專家對草案進(jìn)行會議審議，起草小組根據(jù)專家建議進(jìn)行修改完善。2021 年 11 月，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)工作專家委員會組最終審定并通過了該項(xiàng)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)在終審階段還由中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會組織生物樣本庫分會秘書處邀請了國內(nèi)數(shù)個(gè)從事該領(lǐng)域工作的單位，就本標(biāo)準(zhǔn)提出的關(guān)鍵技術(shù)操作流程進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，委托三家大型機(jī)構(gòu)所做的重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證均較好地實(shí)現(xiàn)了胃腸道上皮類器官的構(gòu)建。在此，向參與類器官重復(fù)構(gòu)建驗(yàn)證的單位與研究人員一并致謝，他們是：復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院夏凡課題組；廣州中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院陳偉課題組和生物芯片上海國家工程研究中心亓垚課題組。我們相信，通過制訂人胃腸上皮組織類器官的構(gòu)建與保藏操作指南，可為全國開展胃腸腫瘤類器官研究的單位和科研人員提供技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)參考。本操作指南將填補(bǔ)我國在胃腸道上皮組織類器官研究及應(yīng)用領(lǐng)域的一個(gè)空白，對于其他種類組織和腫瘤類器官構(gòu)建和應(yīng)用研究也具有重要的借鑒作用。

人胃腸上皮組織類器官的構(gòu)建與保藏操作指南

中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會

T/CMBA 017—2022

目 次

前言……………………………………………………………………………………………………………… 470

1 范圍………………………………………………………………………………………………………… 471

2 規(guī)范性引用文件…………………………………………………………………………………………… 471

3 術(shù)語和定義………………………………………………………………………………………………… 471

4 通則………………………………………………………………………………………………………… 472

5 操作流程…………………………………………………………………………………………………… 472

5.1 組織獲取和類器官構(gòu)建………………………………………………………………………………… 472

5.2 類器官的傳代與凍存…………………………………………………………………………………… 473

5.3 類器官的復(fù)蘇…………………………………………………………………………………………… 473

5.4 廢棄類器官處置………………………………………………………………………………………… 473

6 質(zhì)量控制…………………………………………………………………………………………………… 473

附錄 A（資料性） 胃腸上皮類器官培養(yǎng)用主要試劑材料與操作要點(diǎn)…………………………………… 474

A.1 主要試劑材料…………………………………………………………………………………………… 474

A.2 類器官構(gòu)建流程………………………………………………………………………………………… 475

A.3 胃腸上皮類器官培養(yǎng)操作要點(diǎn)………………………………………………………………………… 475

附錄 B（資料性） 胃腸上皮類器官鑒定…………………………………………………………………… 477

B.1 類器官顯微鏡下狀態(tài)評估……………………………………………………………………………… 477

B.2 單細(xì)胞懸液細(xì)胞定量評估……………………………………………………………………………… 477

B.3 細(xì)胞活力評估…………………………………………………………………………………………… 477

B.4 類器官的形態(tài)學(xué)及免疫標(biāo)記鑒定……………………………………………………………………… 477

附錄 C（資料性） 類器官的核酸與蛋白質(zhì)提取…………………………………………………………… 478

C.1 DNA 提取………………………………………………………………………………………………… 478

C.2 RNA 提取………………………………………………………………………………………………… 478

C.3 蛋白質(zhì)提取……………………………………………………………………………………………… 479

參考文獻(xiàn)………………………………………………………………………………………………………… 480

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前 言

本文件按照 GB/T 1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

本文件由中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會組織生物樣本庫分會提出。

本文件由中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會歸口。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件起草單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、生物芯片上海國家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司。

本文件主要起草人：于穎彥、向臻、臧潞、燕然林、楊蕊馨、關(guān)穎欣、朱正綱、郜恒駿、張小燕。

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人胃腸上皮組織類器官的構(gòu)建與保藏操作指南

1 范圍

本文件描述了從人胃腸道上皮活組織及其上皮起源的病變活組織提取上皮細(xì)胞構(gòu)建類器官的原理、實(shí)驗(yàn)方法、傳代、儲存以及復(fù)蘇方法。

本文件適用于科研用胃腸道上皮活組織及其上皮起源的病變活組織類器官的培養(yǎng)、類器官傳代、類器官儲存和復(fù)蘇。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T 38736-2020 人類生物樣本保藏倫理要求

T/NAHIEM 6 醫(yī)學(xué)研究倫理委員會通用要求

3 術(shù)語和定義

GB/T 38736-2020 界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

胃腸道上皮或上皮來源的病變活組織類器官 organoids of gastrointestinal epithelium and epithelial lesions

由正常胃腸道上皮組織或由上皮來源的病變組織中的上皮干細(xì)胞或者多能干細(xì)胞通過體外誘導(dǎo)分化而來的，在細(xì)胞成分、組織架構(gòu)及功能上與胃腸道正常上皮或者上皮來源病變組織具有相似性的 3D 微小活組織結(jié)構(gòu)。

3.2

胃腸道類器官培養(yǎng)基 culture medium of gastrointestinal organoid

可以實(shí)現(xiàn)體外模擬胃腸道上皮組織細(xì)胞生長所需微環(huán)境，能誘導(dǎo)胃腸道干細(xì)胞和多能干細(xì)胞分化為各種類型的胃腸道上皮細(xì)胞，同時(shí)能夠持續(xù)維持胃腸道干細(xì)胞和多能干細(xì)胞的特性，實(shí)現(xiàn)體外胃腸道活組織類器官的長期存活的培養(yǎng)介質(zhì)。

3.3

3D 培養(yǎng)基質(zhì)膠 matrigel matrix

由層黏連蛋白、IV 型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等組成，加入有生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶。3D 培養(yǎng)基質(zhì)膠在室溫條件下能夠聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)和功能，能夠?yàn)槲改c道黏膜上皮細(xì)胞的生長提供支架。

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3.4

傳代 passage

將培養(yǎng)狀態(tài)良好的類器官采用物理吹打和化學(xué)酶消化方法使其解離為單細(xì)胞懸液，再重新接種于與原培養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)體系內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行類器官培養(yǎng)。新一代類器官與原來類器官具有相同的形態(tài)功能特征。

3.5

凍存 cryopreservation

使暫時(shí)不需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的類器官脫離生長狀態(tài)，但又可以保持其細(xì)胞組成、形態(tài)和功能特征的低溫冷凍過程。

3.6

復(fù)蘇 thawing

將處于深低溫凍存的類器官取出恢復(fù)其繼續(xù)生長狀態(tài)的過程。

3.7

知情同意 informed consent

與組織細(xì)胞提供者簽署書面的合法有效的知情同意書，包括但不限于合適條件下潛在研究應(yīng)用、研究成果潛在的商業(yè)應(yīng)用及其他問題所適用的內(nèi)容。

注：倫理要求與隱私保護(hù)見 GB/T 38736-2020第 3.7 條。

4 通則

4.1 胃腸道上皮類器官采集與處理應(yīng)獲得倫理委員會審批。

4.2 組織采集前應(yīng)簽署知情同意書，應(yīng)在充分告知、尊重提供者權(quán)利的前提下簽署知情同意書。

4.3 組織的處理宜采用可操作性強(qiáng)、成功率高、結(jié)果穩(wěn)定的方法。

4.4 胃腸道上皮類器官采集與處理應(yīng)由接受過專業(yè)培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員/工作人員進(jìn)行。

5 操作流程

5.1 組織獲取和類器官構(gòu)建

5.1.1 組織的獲取

腫瘤組織切取時(shí)應(yīng)避開有明顯壞死的區(qū)域，且組織塊應(yīng)不小于 5 mm × 5 mm。新鮮組織應(yīng)在離體30 min 內(nèi)切取。

5.1.2 組織的清洗

切取的組織應(yīng)進(jìn)行振蕩清洗，去除污濁。

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5.1.3 類器官的構(gòu)建

可采用酶消化法將人胃腸道上皮組織或者上皮來源的病變組織酶解分散為單個(gè)細(xì)胞懸液，再將上皮細(xì)胞與基質(zhì)膠混合后形成 3D 培養(yǎng)空間結(jié)構(gòu)，加入適用于胃腸道上皮細(xì)胞生長的類器官培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從而使其分化長成與胃腸道上皮組織結(jié)構(gòu)及功能類似的胃腸道活組織類器官。相關(guān)耗材和操作方法見附錄 A。

5.2 類器官的傳代與凍存

5.2.1 類器官傳代

應(yīng)選擇合適的類器官進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)或傳代，一般為生長 2 周左右，達(dá)到一定數(shù)目和體積的類器官。

5.2.2 類器官凍存

暫不使用的類器官應(yīng)按相關(guān)規(guī)程處理，加入凍存液后移入低溫環(huán)境凍存。

5.3 類器官的復(fù)蘇

類器官復(fù)蘇遵循速融原則。使用 37 ℃水浴令其盡快融化，選擇合適的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、傳代。

5.4 廢棄類器官處置

類器官構(gòu)建和傳代過程中產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)嚴(yán)格按照生物樣本處置與管理規(guī)范操作。對于不合格的或者污染的類器官細(xì)胞應(yīng)遵循生物醫(yī)療廢棄物處理規(guī)范丟棄到指定地點(diǎn)。

6 質(zhì)量控制

類器官的質(zhì)量控制有別于傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)，其內(nèi)容包括但不限于類器官小球生長活力評估、類器官細(xì)胞懸液數(shù)量評估、類器官單細(xì)胞懸液活力評估以及類器官免疫學(xué)標(biāo)記物的表達(dá)評估等。類器官培養(yǎng)狀態(tài)鑒定見附錄 B。類器官相關(guān)實(shí)驗(yàn)用核酸與蛋白質(zhì)提取操作見附錄 C。

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附 錄 A（資料性） 胃腸上皮類器官培養(yǎng)用主要試劑材料與操作要點(diǎn)

A.1 主要試劑材料

A.1.1 培養(yǎng)基主要構(gòu)成

表 A.1 胃腸道上皮類器官培養(yǎng)基的主要成分表

中文名稱英文名稱 Wnt-3a*Wnt-3a* 頭蛋白*Noggin* 表皮生長因子*EGF* Wnt 信號通路激活劑*R-spondin1* 纖維母細(xì)胞生長因子 10*FGF10* 胃泌素 I*Gastrin I* 培養(yǎng)基*Advanced DMEM/F12* N-乙酰半胱氨酸*N-acetylcysteine* 丙氨酸和 L-谷氨酰胺縮合二肽培養(yǎng)基*GlutaMAX* 細(xì)胞培養(yǎng)無血清添加劑*Serum-free B27* 青霉素/鏈霉素Penicillin/streptomycin 原代細(xì)胞抗生素Primocin 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液HEPES TGFβ抑制劑TGFβ inhibitor A83-01 ROCK 抑制劑ROCK inhibitor Y-27632

注：*胃腸道上皮類器官培養(yǎng)基核心成分，其余試劑可視情況加減。

A.1.2 類器官培養(yǎng)3D 支架材料

3D 基質(zhì)膠提取自基底膜的基質(zhì)，主要由層黏連蛋白、IV 型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等組成，還包含生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等?；|(zhì)膠在室溫條件下聚合形成具有生物學(xué)活性的三維支架，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能。該結(jié)構(gòu)不僅有利于體外細(xì)胞的培養(yǎng)和分化，而且能夠?yàn)槲改c道上皮細(xì)胞的生長提供支架?；|(zhì)膠在零度以下低溫環(huán)境呈液態(tài)，故凡是涉及基質(zhì)膠的實(shí)驗(yàn)操作皆應(yīng)置冰盒操作。

A.1.3 組織消化酶

胃腸上皮組織消化中涉及的消化酶主要有 IV 型膠原酶（collagenase IV）與透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase）。其作用是水解結(jié)締組織中的基質(zhì)和膠原蛋白成分，從而使胃腸道上皮細(xì)胞從組織中充分分離出來，以利于制備為單細(xì)胞懸液或細(xì)胞團(tuán)。

A.1.4 類器官凍存液

類器官凍存液為無血清凍存液，一般宜含有 10% 的二甲基亞砜（DMSO）。

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A.2 類器官構(gòu)建流程

A.2.1 組織塊的清洗

將組織塊用不少于 5 ml 含有抗生素的 PBS 緩沖液浸泡，每隔 5 ～ 10 分鐘在振蕩器上振蕩清洗一次，棄污濁清洗液，加入前述清洗液繼續(xù)振蕩清洗，此步驟不少于 4 次，總計(jì)時(shí)長不少于 30 min。

A.2.2 組織細(xì)胞的消化

用組織剪將組織剪碎至 0.5 mm × 0.5 mm 大小，加入適量 IV 型膠原酶和透明質(zhì)酸酶置于 37 ℃水浴鍋中消化。在胃腸上皮類器官構(gòu)建中，通常是加入 1 ml 的 IV 型膠原酶（1.5 mg/ml）和透明質(zhì)酸酶（20 μg/ml），然后置于 37 ℃水浴鍋中消化適當(dāng)時(shí)間（一般在 2 h 以內(nèi)）。

A.2.3 組織細(xì)胞消化物的過濾

選用 70 ～ 100 μm 的細(xì)胞過濾器進(jìn)行過濾，去除組織液內(nèi)的殘?jiān)?。收集過濾液至 15 ml 無菌離心管，離心（200 ×，5 min）組織細(xì)胞消化物，棄上清，保留沉淀物。

A.2.4 重懸離心沉淀物

加入 80 μl 的 Advanced DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸沉淀物?？梢罁?jù)沉淀物的量適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基的量。

A.2.5 類器官種板培養(yǎng)物制備

將細(xì)胞重懸液與 3D 培養(yǎng)基質(zhì)膠按照 1:1 混合。

A.2.6 類器官培養(yǎng)物接種細(xì)胞培養(yǎng)板

吸取適量種板培養(yǎng)物（一般在 80 ～ 100 μl）滴加至 24 孔培養(yǎng)板中，根據(jù)種板培養(yǎng)物的量做 2 ～ 3 復(fù)孔種板。然后將 24 孔板置 37 ℃培養(yǎng)箱孵育 20 ～ 30 min，待基質(zhì)膠充分凝固后向每孔加入類器官培養(yǎng)基 500 ～ 800 μl。

A.3 胃腸上皮類器官培養(yǎng)操作要點(diǎn)

A.3.1 類器官污染的處置

胃腸上皮類器官培養(yǎng)過程中應(yīng)定期觀察、拍照。一般在第 2 天于倒置顯微鏡下可以觀察到類器官小球，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，類器官小球逐漸增多、增大。定期觀察有利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染。如果在培養(yǎng) 3 d 內(nèi)出現(xiàn)基質(zhì)膠渾濁，提示可能有真菌和細(xì)菌污染，應(yīng)及時(shí)做丟棄處理。在類器官培養(yǎng)過程中也有可能出現(xiàn)支原體污染。支原體在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)團(tuán)狀、小球狀生長，容易與類器官混淆，但支原體在顯微鏡下觀察不到上皮的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)。若發(fā)現(xiàn)可疑支原體污染，可加入支原體去除劑進(jìn)行挽救，支原體去除劑可以抑制并消除支原體的生長，若仍不能去除支原體污染則做丟棄處理。

A.3.2 類器官培養(yǎng)物接種注意事項(xiàng)

將獲取的細(xì)胞懸液與 3D 基質(zhì)膠按照 1:1 混勻吹打，吹打過程中切忌產(chǎn)生大量氣泡，以免影響后續(xù)培養(yǎng)物接種。24 孔板可提前于 37 ℃培養(yǎng)箱預(yù)熱 30 min，以加速 3D 基質(zhì)膠的凝固。24 孔板在培養(yǎng)物接種后可向周圍多余空白孔內(nèi)加入適量 PBS 緩沖液，以減少類器官培養(yǎng)基孵育過程中的液體揮發(fā)，保持一定濕度。

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A.3.3 類器官傳代注意事項(xiàng)

胃腸上皮類器官可以連續(xù)傳代超過 10 代或持續(xù)培養(yǎng) 6 個(gè)月以上。與類器官有關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究宜在連續(xù)傳代 10 代以內(nèi)或者持續(xù)培養(yǎng) 6 個(gè)月內(nèi)進(jìn)行。

A.3.4 類器官凍存注意事項(xiàng)

凍存前將類器官吸至試管內(nèi)，加入 1 ml 無動物源性重組胰蛋白酶，使其消化成單細(xì)胞懸液（1 ～ 2 h），200 ×離心 5 min。棄上清后加入適量類器官凍存液混勻（1 ml 左右），分裝于 500 μl 低溫凍存管中，放入程序性凍存盒內(nèi)于–80 ℃深低溫冰箱過夜保存，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。

A.3.5 類器官復(fù)蘇注意事項(xiàng)

從液氮罐中取出的類器官凍存管應(yīng)快速放入 37 ℃水浴鍋中令其盡快融化。吸出類器官凍存物移至 15 ml 無菌離心管中，再加入 10 倍體積的 Advanced DMEM/F12 培養(yǎng)基混勻。之后操作同前述的類器官傳代培養(yǎng)過程。

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附 錄 B（資料性） 胃腸上皮類器官鑒定

B.1 類器官顯微鏡下狀態(tài)評估

將類器官培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下，在 20 倍視野下計(jì)數(shù)類器官數(shù)目。類器官數(shù)目不少于 60 個(gè)/視野表明類器官生長狀態(tài)良好。生長活力好的類器官平均直徑為 160 ～ 200 μl。若個(gè)別類器官體積過大（可達(dá) 1000 μl）則提示類器官趨向衰老，應(yīng)盡早傳代，以防止衰老的類器官影響傳代。

B.2 單細(xì)胞懸液細(xì)胞定量評估

在類器官傳代前應(yīng)用重組胰酶消化成單細(xì)胞懸液。可使用自動化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。將離心后的細(xì)胞沉淀用 Advanced DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸（約 100 μl），經(jīng)吹打混勻后吸取 10 μl 細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以活細(xì)胞比例 > 90% 表示制備的細(xì)胞活力良好。類器官單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)不宜低于 1.5 × 105/ml。

B.3 細(xì)胞活力評估

在缺乏全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀時(shí)，可采取臺盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。將離心后的細(xì)胞沉淀用 Advanced DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸（約 100 μl），經(jīng)吹打均勻后吸取 18 μl 置于 1.5 ml 的 EP 管，向 EP 管中加入2 μl 的 0.4% 的臺盼藍(lán)染液充分混勻，染色 3 min，取 10 μl 細(xì)胞懸液加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在倒置顯微鏡 10 × 物鏡下計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)四大格中未染成藍(lán)色和染成藍(lán)色的細(xì)胞總數(shù)。利用如下公式計(jì)算每 100 μl 中細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞存活率：

活細(xì)胞比率應(yīng) > 90% 可用于類器官細(xì)胞培養(yǎng)。

B.4 類器官的形態(tài)學(xué)及免疫標(biāo)記鑒定

B.4.1 胃黏膜上皮形態(tài)學(xué)與免疫學(xué)標(biāo)記鑒定

胃黏膜上皮或者胃癌類器官成功構(gòu)建后，通過制備冰凍切片或者石蠟包埋切片，蘇木素/伊紅染色（H&E）進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，通過免疫熒光或者免疫組化染色進(jìn)行生物標(biāo)志物檢測，從而確定類器官是否來自腺上皮細(xì)胞。正常胃上皮可以不同程度地表達(dá) CDH1、MUC5AC、MUC6、H+/K+ATPase、PGC 和 GKN1；胃腺癌可以不同程度地表達(dá) CEA、CK19、CDH1、PCNA 和 Ki67。SMA 為肌源性標(biāo)志物，胃上皮類器官與胃癌類器官不表達(dá) SMA。

B.4.2 腸黏膜上皮形態(tài)學(xué)與免疫學(xué)標(biāo)記鑒定

腸黏膜與腸癌類器官構(gòu)建成功后，通過制備冰凍切片或者石蠟包埋切片，蘇木素/伊紅染色（H&E）進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，通過免疫熒光或者免疫組化染色進(jìn)行生物標(biāo)志物檢測。正常腸上皮可不同程度地表達(dá)CK20、CDX1、MUC2、TFF3 和 CDH1；腸腺癌可不同程度地表達(dá) CEA、CDX2、CK20、PCNA 和 Ki67。SMA 為肌源性指標(biāo)作為內(nèi)部參照，腸上皮類器官與腸癌類器官不表達(dá) SMA。

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附 錄 C（資料性） 類器官的核酸與蛋白質(zhì)提取

C.1 DNA 提取

a) 類器官需要先消化制備為細(xì)胞懸液，然后 11 200 ×離心 1 min，棄上清，加 200 μl 懸浮細(xì)胞緩沖液 GA，振蕩使細(xì)胞徹底懸浮；

b) 加入 20 μl 蛋白酶 K（proteinase K）溶液，混勻；

c) 再加入 200 μl 核酸與蛋白分離緩沖液 GB，充分顛倒混勻，70 ℃放置 10 min，溶液應(yīng)當(dāng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

d) 加入 200 μl 無水乙醇，充分振蕩混勻 15 s，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

e) 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中），13 400 ×離心 30 s，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 放回收集管中；

f) 向吸附柱 CB3 中加入 500 μl 去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)緩沖液 GD（已按照說明加入無水乙醇），13 400 ×離心 30 s，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 放入收集管中；

g) 向吸附柱 CB3 中加入 600 μl 去鹽漂洗液 PW（已按照說明加入無水乙醇），13 400 ×離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 放入收集管中；

h) 重復(fù)操作步驟 g)；

i) 將吸附柱 CB3 放回收集管中，13 400 ×離心 2 min，倒掉廢液。將吸附柱 CB3 置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

j) 將吸附柱 CB3 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50 ～ 200 μl 的DNA 洗脫緩沖液 TE，室溫放置 2 ～ 5 min，13 400 ×離心 2 min，將溶液收集到離心管中。

C.2 RNA 提取

a) 收集細(xì)胞：待類器官長到一定的數(shù)量后，將 24 孔板中的培養(yǎng)基去除，加入 1 ml 的 PBS 清洗

1 遍。去除 PBS 后，加入 1 ml 的無動物源性重組胰酶，并用 1 ml 量程的移液槍將基質(zhì)膠打散，以利于消化酶與類器官進(jìn)行充分的接觸與消化。30 min 后，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至 RNase-Free 的離心管中離心（300 ×，5 min），收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清；

b) 裂解處理：輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散，加入適量裂解液 RL（350 μl），旋渦振蕩；

c) 將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱 CS 上（過濾柱 CS 放在收集管中），13 400 ×離心 2 min，收集濾液；

d) 向?yàn)V液中加入 1 倍體積 70% 乙醇（通常為 350 μl 或 600 μl），混勻（此時(shí)可能會出現(xiàn)沉淀），得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱 CR3 中（吸附柱 CR3 放入收集管中），13 400 ×離心 30 ～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR3 放回收集管中；

e) 向吸附柱 CR3 中加入 350 μl 去蛋白液 RW1，13 400 ×離心 30 ～ 60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR3 放回收集管中；

f) DNase I 工作液的配制：取 10 μl DNase I 儲存液放入新的 RNase-Free 離心管中，加入 70 μl 去除 DNA 緩沖液 RDD，輕柔混勻；

g) 向吸附柱 CR3 中央加入 80 μl 的 DNase I 工作液，室溫放置15 min；

h) 向吸附柱 CR3 中加入 350 μl 去蛋白液 RW1，13 400 ×離心 30 ～ 60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR3 放回收集管中；

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i) 向吸附柱 CR3 中加入 500 μl 漂洗液 RW（按照說明加入乙醇），室溫靜置 2 min，13 400 ×離心 30 ～ 60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR3 放回收集管中；

j) 重復(fù)步驟 i)；

k) 離心（13 400 ×，2 min），倒掉廢液。將吸附柱 CR3 置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

l) 將吸附柱 CR3 轉(zhuǎn)入一個(gè)新的 RNase-Free 離心管中，加入 30 ～ 100 μl RNase-Free ddH2O 室溫放置 2 min，離心（13 400 ×，2 min），得到 RNA 溶液。

C.3 蛋白質(zhì)提取

a) 收集細(xì)胞：待類器官長到一定的數(shù)量后，將 24 孔板中的培養(yǎng)基去除，加入 1 ml 的 PBS 清洗

1 遍。去除 PBS 后，加入 1 ml 的無動物源性重組胰酶，并用 1 ml 量程的移液槍將基質(zhì)膠打散，以利于消化酶與類器官進(jìn)行充分的接觸與消化。30 min 后，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至 RNase-Free 的離心管中離心（300 ×，5 min），收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清；

b) 裂解處理：輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散，加入適量裂解液 RIPA（50 μl/孔）及蛋白酶抑制劑，旋渦振蕩，將其轉(zhuǎn)移至 EP 管中，置于冰上裂解 30 min；

c) 蛋白收集：離心（4 ℃，12 000 ×，15 min），收集上層蛋白溶液；

d) 蛋白定量：使用 BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量；

e) 蛋白變性：加入適量上樣緩沖液，金屬浴 100 ℃，15 min，使蛋白變性；

f) 蛋白儲存：短期內(nèi)使用蛋白可置于–20 ℃儲存，長期儲存置于–80 ℃。

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[1] Seidlitz T, Merker SR, Rothe A, et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut, 2019, 68(2):207-217.

[2] Nanki K, Toshimitsu K, Takano A, et al. Divergent routes toward Wnt and R-spondin niche independency during human gastric carcinogenesis. Cell, 2018, 174(4):856-869, e17.

[3] Bartfeld S, Bayram T, van de Wetering M, et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology, 2015, 148(1):126-136, e6.

[4] van de Wetering M, Francies HE, Francis JM, et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell, 2015, 161(4):933-945.

[5] Sachs N, de Ligt J, Kopper O, et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell, 2018, 172(1-2):373-386, e10.

[6] Yan HHN, Siu HC, Law S, et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell, 2018, 23(6):882-897, e11.

[7] Barker N, Huch M, Kujala P, et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell, 2010, 6(1):25-36.

[8] Almeqdadi M, Mana MD, Roper J, et al. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. Am J Physiol Cell Physiol, 2019, 317(3):C405-C419.

[9] Xiang Z, Zhou Z, Song S, et al. Dexamethasone suppresses immune evasion by inducing GR/STAT3 mediated downregulation of PD-L1 and IDO1 pathways. Oncogene, 2021, 40(3):5002-5012.

[10] Engel RM, Chan WH, Nickless D, et al. Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment. J Clin Med, 2020, 9(1):128.

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.013