三種不同血清型肺炎球菌多糖國家參考品的研制

王珊珊，陳瓊，許美鳳，李亞南，徐穎華，葉強

·技術(shù)與方法·

三種不同血清型肺炎球菌多糖國家參考品的研制

王珊珊*，陳瓊*，許美鳳，李亞南，徐穎華，葉強

102629 北京，中國食品藥品檢定研究院，衛(wèi)健委生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室

肺炎球菌感染是導致老年人死亡的主要原因之一，WHO 將其列為 12 種造成嚴重疾病負擔的重點致病菌之一，且耐藥性肺炎球菌的出現(xiàn)對當前臨床治療造成很大的挑戰(zhàn)[1]。大量研究證實疫苗的免疫接種是預防和控制肺炎球菌感染最經(jīng)濟、最有效的措施。當前針對成人肺炎球菌感染的預防性疫苗主要為覆蓋了已報道的 65% ～ 91% 血清型分離菌株的 23 價肺炎球菌多糖疫苗（PPV23）[2-3]。多糖作為 PPV23 中有效組分，與疫苗的免疫原性密切相關(guān)。因此，疫苗中不同血清型多糖的含量是確保 PPV23 質(zhì)量有效、穩(wěn)定的最重要質(zhì)控指標之一[4-5]。

2020 年版《中國藥典》推薦應用特異性速率比濁方法對PPV23 中所含有各型多糖含量檢測[6]，當前有四款PPV23 產(chǎn)品在國內(nèi)上市，使用各自企業(yè)研制的內(nèi)控品進行多糖含量檢測，因此，為了加強不同企業(yè)生產(chǎn)的疫苗中多糖含量的質(zhì)量控制，本研究研制了2、8 和 10A 三種血清型肺炎球菌多糖國家參考品，以期為后續(xù)PPV23 產(chǎn)品質(zhì)量控制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 2、8 和 10A 血清型多糖候選參考品由成都生物制品研究所有限責任公司提供；10 μg/ml 型的肺炎球菌多糖標準品（批號：PN-PV-01Mar2016）、內(nèi)部質(zhì)控品（批號：00118241.0000393）由 Merck Sharp & Dohme Corp. 惠贈；不同血清型因子血清標準品購自丹麥血清研究所；IMMAGE800 緩沖液、IMMAGE800 稀釋液和 IMMAGE800 洗液購自美國 Beckman 公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 免疫化學分析系統(tǒng)（IMMAGE800）購自美國 Beckman 公司；AVANCE-600 型超導核磁共振波譜儀（包括自動進樣器和 TopSpin 工作站）購自德國布魯克公司。

1.2 方法

1.2.1 不同血清型多糖候選參考品的血清型別鑒定 參考文獻[7]方法，采用1H 核磁共振法對不同血清型多糖候選參考品的型別鑒定。采用 zg30 脈沖序列采集1H-NMR 數(shù)據(jù)，脈沖角度為 30°，實驗溫度為 50 ℃，采樣譜寬為 6000 Hz，中心頻率位于 δH3.0，采樣點數(shù)為 64 K 以及采樣次數(shù)為 128 次。

1.2.2 不同血清型多糖候選參考品的質(zhì)量分析 根據(jù)《中國藥典》2020 年版三部的 23 價肺炎球菌多糖疫苗各論對不同血清型多糖候選參考品包括蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)含量檢測、氨基己糖、糖醛酸和（或）甲基戊糖基團含量檢測以及分子大小和內(nèi)毒素含量進行檢測分析。

1.2.3 不同血清型多糖候選參考品分裝均勻性分析 隨機抽取不同血清型候選參考品 50 瓶，應用速率比濁法進行檢測分析，計算不同樣品多糖濃度的相對標準偏差（RSD），評價三種不同血清型多糖候選參考品的分裝均勻性。

1.2.4 不同血清型多糖候選參考品穩(wěn)定性分析 將長期放置–70 ℃冰箱保存的三種血清型候選參考品取出，在室溫 25 ℃反復凍融 3 次，并將候選參考品分別于 2 ～ 8 ℃放置 7、14、28 和 60 d，25 ℃放置 3、7、14、21 和 28 d，37 ℃放置 3、7、14、21 和 28 d，同時與放置–70 ℃冰箱保存的各自候選參考品進行相同稀釋度平行測定，所有樣品均重復測定 3 次，系統(tǒng)評價候選參考品的穩(wěn)定性。

1.2.5 不同血清型多糖候選參考品協(xié)作標定 按照擬定協(xié)作標定方案，組織成都生物制品研究所有限責任公司、北京民海生物科技有限公司及中國食品藥品檢定研究院 3 家實驗室進行候選參考品的多糖含量標定。每個實驗室至少獲得 5 個獨立數(shù)據(jù)，每次實驗有效性前提為標準曲線相關(guān)系數(shù)（2）不小于 0.99，且兩次平行測定值 RSD 應不大于 15%，內(nèi)部質(zhì)控品的多糖含量在 35 ～ 65 μg/ml，最終將所有原始結(jié)果提交中國食品藥品檢定研究院統(tǒng)一分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用 SPSS 20 統(tǒng)計分析軟件對穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，以< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 候選參考品的血清型別鑒定結(jié)果

2、8 和 10A 血清型多糖候選參考品的1H 核磁譜圖端基質(zhì)子區(qū)各峰的化學位移與各自型別肺炎球菌多糖核磁指紋特征圖譜一致[7]，表明這三種候選參考品分別為 2、8 和 10 A 型肺炎球菌多糖（圖 1）。

圖 1 三種不同血清型多糖候選參考品的核磁共振法分析結(jié)果

2.2 候選參考品的質(zhì)量檢測結(jié)果

按照 2020 版中國藥典推薦的方法，對三種不同血清型多糖候選參考品相關(guān)限度質(zhì)量檢測，結(jié)果顯示 2、8 和 10 A 型肺炎球菌多糖各項質(zhì)量檢測項目結(jié)果均符合質(zhì)量標準要求（表 1），表明三種不同血清型多糖候選參考品的質(zhì)量良好。

2.3 分裝均勻性分析結(jié)果

分裝均勻性分析結(jié)果顯示，除 8 型多糖候選參考品偶爾幾個樣品略高一些，其他隨機抽取 50 瓶候選參考品的多糖含量檢測結(jié)果基本維持固定濃度水平（圖 2），50 瓶多糖含量檢測結(jié)果的 RSD（%）分別為 3.9%、9.8% 和 3.5%，均低于 10%，表明這三種不同血清型多糖候選參考品的分裝均勻性較好。

2.4 穩(wěn)定性分析結(jié)果

三種不同血清型多糖候選參考品經(jīng)反復凍融 3 次后，與長期–70 ℃保存的各候選參考品檢測結(jié)果相比，2、8 和 10A 型多糖樣品的 RSD 值分別為 4.2%、1.9% 和 2.2%，均在10% 以內(nèi)，統(tǒng)計學分析均無顯著差異（2、8 和 10A 型多糖樣品比較統(tǒng)計學分析的值分別為 0.079、0.245 和0.317，均大于 0.05）。同時，將各候選參考品分別于 2 ～ 8、25 和37 ℃放置不同時間后，與–70 ℃保存的候選參考品檢測相比較，2、8 和 10A 型多糖候選參考品濃度在不同溫度放置后無顯著性變化（圖 3），差異無統(tǒng)計學意義（2、8 和 10A 型多糖樣品比較統(tǒng)計學分析的值分別為 0.226 ～ 0.505、0.265 ～ 0.641 和 0.245 ～ 0.426，均大于 0.05），2、8 和 10A 型多糖樣品檢測結(jié)果的 RSD 值分別為 4.2%、2.6% 和 5.5%，表明三種不同血清型多糖候選參考品的具有良好穩(wěn)定性。

2.5 多糖含量協(xié)作標定結(jié)果

協(xié)作標定分析結(jié)果 3 個不同實驗室檢測標準曲線相關(guān)系數(shù)（2）均大于 99%，各自使用的內(nèi)部控制品的多糖含量均在規(guī)定范圍之間，符合實驗成立標準。不同實驗室獲得的 2、8 和 10A 型三種不同血清型多糖含量 RSD 分別為 7.6%、9.1% 和 6.1%，平均濃度分別為 465、467 和 509 μg/ml。

3 討論

應用統(tǒng)一的檢測用相關(guān)國家參考品，可促進不同企業(yè)生產(chǎn)疫苗產(chǎn)品質(zhì)量控制的結(jié)果準確性和可溯源性[5]。為了保證研制參考品的質(zhì)量，從標準物質(zhì)原材料制備就開始嚴格按照PPV23 疫苗生產(chǎn)的要求，獲得不同血清型多糖，并應用核磁共振法對 2、8 和 10A 型多糖的型別鑒定，確保所用多糖參考品的血清型別的特異性。同時，按照 2020 年版《中國藥典》推薦的方法，對 2、8 和 10A 型候選參考品的多項質(zhì)量參數(shù)進行驗證分析，結(jié)果均符合《中國藥典》質(zhì)量標準與國家藥品標準物質(zhì)的要求[6, 8]。

表 1 三種不同血清型多糖候選參考品的質(zhì)量分析結(jié)果

注：N/A 表示不適用；*2 和 8 型多糖采用瓊脂糖 CL-2B 凝膠過濾法測定分子大小，10A多糖采用瓊脂糖 CL-4B 凝膠過濾法測定。

圖 2 三種不同血清型多糖候選參考品的均勻性分析結(jié)果

圖 3 三種不同血清型多糖候選參考品的穩(wěn)定性分析結(jié)果（A：–70 ℃保存；B、C、D 和 E 分別代表 2 ～ 8 ℃放置 7、14、28 和 60 d；F、G、H、I 和 J 分別代表 25 ℃放置 3、7、14、21 和 28 d；K、O、P、Q 和 R 分別代表 37 ℃放置 3、7、14、21 和 28 d；S 代表反復凍融 3 次的樣品，所有樣品均平行重復測定 3 次）

作為評價國家標準物質(zhì)的最關(guān)鍵參數(shù)，候選參考品的均勻性和穩(wěn)定性直接與其質(zhì)量密切相關(guān)[8-10]。本研究通過隨機抽取 50 瓶不同血清型候選參考品進行均勻性分析，結(jié)果顯示 2、8 和 10A 型候選參考品含量檢測的 RSD 均低于 10%，表明這三種不同血清型多糖候選參考品的分裝均勻性較好，也進一步支持速率比濁法用于 PPV23 的多糖含量檢測的適用性。同時，參考《國家藥品標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》要求[8]，并綜合考慮未來候選參考品在運輸、分發(fā)以及實際使用過程中存在反復凍融、保存條件等溫度變化等因素，將 2、8 和 10A 型候選參考品反復凍融 3 次，以及分別于 4 ℃、25 ℃、37 ℃放置不同時間后進行檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與–70 ℃保存的樣品分析結(jié)果無顯著性差異，結(jié)果表明這三種不同血清型候選參考品的穩(wěn)定性良好。

免疫速率比濁法是基于抗原抗體特異性結(jié)合反應，形成抗原抗體復合物，增加反應液的濁度，通過與系列稀釋的標準品進行比較，獲得待檢物的含量[11]。由于其快速、特異、靈敏，已被廣泛用于多糖類疫苗的質(zhì)量控制，尤其適合于多種血清群或型疫苗中不同多糖抗原含量檢測[12-13]。然而，當前在國外只有 1 ～ 2 家企業(yè)生產(chǎn) PPV23，且產(chǎn)品原研國也不盡相同，缺乏肺炎球菌多糖的國際標準品，所以這些企業(yè)均采用自行研制多糖參考品進行質(zhì)量控制。在我國前幾年，僅 1 ～ 2 家企業(yè)生產(chǎn)的 PPV23 產(chǎn)品上市時，也是使用企業(yè)自行研制多糖參考品進行質(zhì)量控制，但隨著國內(nèi)生產(chǎn) PPV23 產(chǎn)品的廠家數(shù)量增加，使用統(tǒng)一的多糖參考品用于疫苗關(guān)鍵有效組分的質(zhì)量控制，有利于保持產(chǎn)品質(zhì)量的一致性，促進疫苗監(jiān)管。在本研究中，選用其中一家使用時間長且可溯源的企業(yè)自制參考品作為檢測和協(xié)作標定結(jié)果的參考品，結(jié)果證實速率比濁法檢測多糖含量重復性好，不同實驗室多糖含量 RSD 均小于 10%，符合國家標準物質(zhì)的相關(guān)要求[8]。

綜上所述，本研究研制的 2、8 和 10A 型肺炎球菌多糖國家參考品的各項檢測指標均符合規(guī)定，具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，可用于肺炎球菌多糖疫苗質(zhì)量控制。

志謝 感謝成都生物制品研究所有限責任公司、北京民海生物科技有限公司給予的幫助！

[1] World Health Organization. Pneumococcal conjugate vaccines in infants and children under 5 years of age: WHO position paper-February 2019. Weekly Epidemiol Rec, 2019, 94(8):85-103.

[2] Suzuki M, Dhoubhadel BG, Ishifuji T, et al. Adult Pneumonia Study Group-Japan (APSG-J). Serotype-specific effectiveness of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine against pneumococcal pneumonia in adults aged 65 years or older: a multicentre, prospective, test-negative design study. Lancet Infect Dis, 2017, 17(3):313-321.

[3] Lawrence H, Pick H, Baskaran V, et al. Effectiveness of the 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine against vaccine serotype pneumococcal pneumonia in adults: a case-control test-negative design study. PLoS Med, 2020, 17(10):e1003326.

[4] Chinese Preventive Medicine Association, Chinese Preventive Medicine Association Vaccine and Immunization. Expert consensus on immunization for prevention of pneumococcal disease in China (2017). Chin Prev Med, 2018, 19(3):161-191. (in Chinese)

中華預防醫(yī)學會, 中華預防醫(yī)學會疫苗與免疫分會. 肺炎球菌性疾病免疫預防專家共識(2017版). 中國預防醫(yī)學雜志, 2018, 19(3): 161-191.

[5] Wang JZ. Vaccine quality control and evaluation. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2013:720-734. (in Chinese)

王軍志. 疫苗的質(zhì)量控制與評價. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2013: 720-734.

[6] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Volume 3, 2020. Beijing: China Medical Science Press, 2020:91-94. (in Chinese)

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典. 2020年版三部. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2020:91-94.

[7] Abeygunawardana C, Williams TC, Sumner JS, et al. Development and validation of an NMR-based identity assay for bacterial polysaccharides. Anal Biochem, 2000, 279(2):226-240.

[8] Chen YF, Xiao XY, Li B. Introduction of quality management of international pharmaceutical reference materials and their implication in China. Chin Pharm Aff, 2013, 27(12):1258-1261. (in Chinese)

陳亞飛, 肖新月, 李波. 國外藥品標準物質(zhì)質(zhì)量管理介紹及對我國的啟示. 中國藥事, 2013, 27(12):1258-1261.

[9] Chen YF, Xiao XY, He P, et al. Interpretation of reference material stability investigation requirements and study on expiry date management methods. Chin Pharm Aff, 2018, 32(3):317-322. (in Chinese)

陳亞飛, 肖新月, 何平, 等. 標準物質(zhì)穩(wěn)定性考察規(guī)范解讀和有效期管理方式的研究. 中國藥事, 2018, 32(3):317-322.

[10] Ma LY, Ning BM, Chen GQ, et al. Introduction of general guidance for the national pharmaceutical reference standards. Chin J Pharm Anal, 2010, 30(10):1990-1992. (in Chinese)

馬玲云, 寧保明, 陳國慶, 等. 國家藥品標準物質(zhì)研制技術(shù)要求的介紹. 藥物分析雜志, 2010, 30(10):1990-1992.

[11] Lee CJ. The quantitative immunochemical determination of pneumococcal capsular polysaccharide by light scattering quantitative rate nephelometry. J Biol Stand, 1983, 11(1):55-64.

[12] Li YN, Zhu XG, Mao QQ, et al. Development and verification of immune rate turbidimetric method for quantitative determination of polysaccharide content in groups A and C meningococcus and Haemophilus influenzae type b combined vaccine. Chin J Biol, 2017, 30(6):645-648. (in Chinese)

李亞南, 朱向國, 毛琦琦, 等. AC群腦膜炎球菌與b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗多糖含量免疫速率比濁檢測方法的建立及驗證. 中國生物制品學雜志, 2017, 30(6):645-648.

[13] Jones C, Currie F. Control of components of bacterial polysaccharide vaccines by physical methods. Biologicals, 1991, 19(1):41-47.

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.009

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2018ZX09738006-006）

葉強，Email：qiangyee@nifdc.org.cn；徐穎華，Email：xuyh@nifdc.org.cn

2021-12-16

*共同第一作者