白蛋白美登素偶聯(lián)物的制備及其體外抗胰腺癌活性研究

胡尚玖，王瑩，張國寧，朱梅，王明華，王菊仙

·論著·

白蛋白美登素偶聯(lián)物的制備及其體外抗胰腺癌活性研究

胡尚玖，王瑩，張國寧，朱梅，王明華，王菊仙

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所有機合成室

制備人血清白蛋白（HSA）與美登素衍生物 mertansine（DM1）的偶聯(lián)物，評價其體外抗胰腺癌細胞活性。以安絲菌素為原料經(jīng)還原、酯化等反應(yīng)制得美登素衍生物 DM1，以 N-羥基琥珀酰亞胺與馬來酸酐為原料反應(yīng)制得連接子 SMCC，通過連接子 SMCC 將 DM1 與人血清白蛋白偶聯(lián)制得偶聯(lián)物 HSA-DM1，采用 HPLC、MALDI-TOF 對其進行表征并計算平均偶聯(lián)比。采用 CCK-8 法測定偶聯(lián)物對 MIA PaCa-2、PANC-1 和 BxPC-3 三種胰腺癌細胞系的增殖抑制作用；利用流式細胞術(shù)和 Western blot 法測定其對 MIA PaCa-2 和 PANC-1 細胞的促凋亡能力。成功制備偶聯(lián)物 HSA-DM1，其平均偶聯(lián)比為 3.32，對MIA PaCa-2、PANC-1 和BxPC-3 三種細胞系的 IC50值分別為（48.2 ± 6.5）、（55.0 ± 4.7）、（84.0 ± 11.8）nmol/L，同時其對 MIA PaCa-2 和 PANC-1 細胞的促凋亡作用呈劑量依賴。偶聯(lián)物 HSA-DM1 具有顯著抑制胰腺癌細胞增殖的活性，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

人血清白蛋白； 美登素衍生物； 偶聯(lián)物； 胰腺癌

胰腺癌作為最致命的癌癥之一通常在晚期才會被確診，同時它具有極強的侵襲性，導致大多數(shù)患者無法通過手術(shù)實現(xiàn)根除性切除，且對大多數(shù)常規(guī)治療方案具有顯著抗性[1]，這些特性致使胰腺癌患者五年內(nèi)生存率僅有大約 8%[2]。

基因編碼的 Ras 蛋白質(zhì)是一種小型 GTP 酶，是細胞多個調(diào)控過程中的分子開關(guān)[3]。90% 的胰腺癌是胰腺導管癌，而其中 95% 的胰腺導管癌都存在突變[4]。研究表明，突變會增強細胞的巨胞飲作用[5]，這是一種內(nèi)吞作用，其機制是細胞外液經(jīng)細胞膜內(nèi)陷包裹形成囊泡（巨胞飲體）進入細胞內(nèi)，攝入的物質(zhì)會在溶酶體中降解，以支持新陳代謝和大分子的合成。研究證明突變的癌細胞，例如胰腺導管癌細胞會通過巨胞飲作用吞噬白蛋白來獲得谷氨酰胺等氨基酸以維持癌細胞的增殖[5]，通過該方法癌細胞可以繞過一些氧依賴性的關(guān)鍵代謝途徑，以提高在缺氧條件下的生長能力。

Kratz[6]發(fā)現(xiàn)白蛋白及白蛋白相關(guān)藥物會特異性聚集于突變的胰腺癌細胞及組織。實際上不僅是突變的胰腺癌細胞，對于其他實體瘤，白蛋白也會在腫瘤中積累[7]，因此白蛋白能夠作為抗腫瘤藥物的運輸載體，改變有效載荷在體內(nèi)的分布[8]。納米粒白蛋白結(jié)合紫杉醇 Abraxane?在2005 年首次被 FDA 批準用于乳腺癌治療，此后于 2012 年被批準用于治療無法進行化療或治愈性治療的轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者，于 2013 年 6 月被批準與吉西他濱聯(lián)合用于治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌。該結(jié)合物解決了紫杉醇溶解性差的問題并使其能夠靶向作用于腫瘤部位，明顯降低毒性的同時提高了療效[9-11]。

此外，白蛋白作為一種天然的遞藥系統(tǒng)擁有許多其他的優(yōu)點，它是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)；其結(jié)構(gòu)對溫度、pH 的變化穩(wěn)定；具有較長的循環(huán)半衰期（約 19 d）[12-13]，作為遞藥系統(tǒng)時可以改善有效載荷的藥代動力學特征，例如 Levemir?將胰島素與對內(nèi)源性白蛋白具有高結(jié)合親和力的肉豆蔻酸連接，成功延長有效載荷的半衰期[14]。

美登素及其衍生物 DM1 是有效的微管蛋白抑制劑[15]，在有絲分裂期間抑制細胞增殖，它們具有強大的細胞殺傷作用，但狹窄的治療窗口阻礙了這些分子的臨床應(yīng)用[16]。迄今為止，只有曲妥珠單抗與 DM1 的抗體藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）Kadcyla?（T-DM1）被 FDA 批準用于治療乳腺癌。

利用白蛋白對胰腺癌細胞及組織的特異性聚集及其藥代動力學特性，將美登素衍生物DM1 與白蛋白偶聯(lián)有可能獲得新型抗胰腺癌活性的偶聯(lián)物。我們通過不可裂解型接頭 4-（N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯（SMCC）將美登素衍生物 DM1 與重組人血清白蛋白的賴氨酸殘基結(jié)合，合成了偶聯(lián)物 HSA-DM1，并評價了其體外抑制胰腺癌細胞增殖的活性，為靶向抗腫瘤藥物的研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 400 MHz、500 MHz、600 MHz 核磁共振儀購自德國 Bruker 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀套裝（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 B-100、真空泵 V-100、界面 I-100）購自瑞士 Buchi 公司；CF311C 型冷卻水循環(huán)裝置購自日本 Yamato 公司；RCT Basic 磁力攪拌器購自德國 Ika 公司；LS 320A scs 分析天平購自瑞士 Precisa 公司；DHJF-8005 低溫恒溫攪拌反應(yīng)浴購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Quiksep 制備型中高壓層析系統(tǒng)購自北京慧德易科技有限責任公司；Ultimate 3000 UHPLC 購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；MALDI-TOF/TOF 5800 型質(zhì)譜儀購自美國 AB Sciex 公司；Centrifuge 5804 R 離心機購自德國 Eppendorf 公司；KYXY-70 全自動雪花制冰機購自北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司；Amicon Ultra-10K 蛋白超濾管購自美國 Millipore 公司；HisTrap Desalting 凝膠色譜柱購自美國 GE 公司。

1.1.2 主要試劑 束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的安絲菌素由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所武臨專課題組提供；甲基磺酸甲酯、3-巰基丙酸、N-羥基琥珀酰亞胺等試劑均為市售分析純或者化學純；BCA 檢測試劑盒和蛋白分子量標準購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；人重組白蛋白 HSA 購自北京索萊寶科技股份有限公司；CCK-8、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購于東仁化學科技（上海）有限公司；Apoptosis Antibody SamplerKit 購自美國 Cell Signaling Technology 公司；抗b-actin 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.1.3 細胞 人胰腺癌 MIA PaCa-2、PANC-1 和 BxPC-3 細胞系由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 偶聯(lián)物 HSA-DM1 的制備 美登素衍生物 DM1 與連接子 SMCC 的合成路線如圖 1 所示。甲基磺酸甲酯與 3-巰基丙酸為原料反應(yīng)得到中間體 a，在 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）介導下與 N-羥基琥珀酰亞胺酯化得到中間體 b，隨后與 N-甲基-L-丙氨酸發(fā)生縮合反應(yīng)得到中間體 c。三甲基氫化鋁鋰還原安絲菌素得到美登醇 P0，在 N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）介導下與中間體 c 酯化反應(yīng)分離得到 L-DM1-SMe，隨后由二硫蘇糖醇（DTT）還原得到化合物 DM1。反式-4-氨甲基環(huán)己甲酸與馬來酸酐反應(yīng)后，再與經(jīng)三氟乙酸酐活化后的 N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)生成化合物 SMCC。

圖 1 化合物 DM1 與 SMCC 的合成路線

Figure 1 Syntheses of compounds DM1 and SMCC

偶聯(lián)物 HSA-DM1 的合成路線如圖 2 所示，采用“兩步法”策略，連接子 SMCC 的N-羥基琥珀酰亞胺活性酯部分與人血清白蛋白上的賴氨酸殘基反應(yīng)形成酰胺鍵，馬來酰亞胺部分與 DM1 的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)得到偶聯(lián)物 HSA-DM1。

稱取 7.4 mg SMCC 溶于 1 ml 二甲基亞砜得到 22.16 mmol/L SMCC 的二甲基亞砜溶液，稱取4.4 mg 重組人血清白蛋白溶于 4 ml 0.01 mol/L PBS緩沖溶液（pH 7.2 ～ 7.4）。取 45.2 μl 22.16 mmol/LSMCC 的二甲基亞砜溶液稀釋于 900 μl 0.01 mol/L PBS 緩沖溶液（pH 7.2 ～ 7.4），將其滴加至重組人白蛋白溶液中（100 μl × 9 + 45.2 μl，每次間隔10 min），室溫攪拌 20 h。將反應(yīng)液離心（1000 r/min，4 ℃，20 min），離心結(jié)束取上清液用 0.2 μm 濾膜過濾，取濾液超濾離心（10 kD MWCO，3500 ×，4 ℃，20 min），離心完成后取截流液，加入 2 ml0.01 mol/L PBS 緩沖溶液稀釋，重復(fù) 3 次后取截留液，加入 0.01 mol/L PBS 緩沖溶液將反應(yīng)液稀釋至 4 ml。

稱取 3.7 mg DM1 溶于 0.5 ml N,N-二甲基乙酰胺得到 10.04 mmol/L DM1 的 N,N-二甲基乙酰胺溶液，取 32.05 μl 該溶液稀釋于 900 μl 0.01 mol/L PBS 緩沖溶液（pH 7.2 ～ 7.4），將其滴加至反應(yīng)液中（100 μl × 9 + 32.05 μl，每次間隔 10 min），室溫攪拌 5.5 h。將反應(yīng)液用 0.2 μm 濾膜過濾，濾液通過凝膠色譜柱純化，用 0.01 mol/L PBS 緩沖溶液（pH 7.2 ～ 7.4）洗脫產(chǎn)物。收集目標組分超濾離心（10 kD MWCO，3500 ×，4 ℃，20 min 兩次），將截流液用 0.2 μm 濾膜過濾，得 1.550 ml 濾液，用 BCA法測定蛋白濃度。

1.2.2 BCA 法測定樣品濃度 將 2 mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA）標準品用純凈水稀釋得到 BSA 標準溶液 1500、1000、750、500、250、125、25 μg/ml。取上述 8 個濃度的 BSA 標準溶液、純凈水和待測蛋白質(zhì)樣品各 10 μl 加入到微孔板中，向每個孔加入 200 μl 工作液，在振蕩器上振蕩 30 s 后，再將微孔板置于 37 ℃孵育 30 min。孵育結(jié)束后，將微孔板冷卻至室溫，使用酶標儀檢測樣品在570 nm 波長的吸光度。將各個標準溶液和待測樣品在 570 nm 波長的吸光值減去空白溶液在 570 nm 波長的平均吸光值。將 BSA 標準溶液在 570 nm 波長經(jīng)過空白校正的平均吸光值對其濃度作圖，繪制標準曲線。將待測樣品經(jīng)過空白校正的平均吸光值依據(jù)標準曲線換算出待測蛋白質(zhì)樣品的濃度。

1.2.3 HPLC 檢測偶聯(lián)物 HSA-DM1 樣品純度

⑴HPLC 檢測 HSA-DM1樣品中游離的DM1。色譜柱：ACQUITY UPLC Protein BEH SEC Column（200 ? 1.7 μm，4.6 mm × 150 mm）；流動相 A：100 mmol/L 磷酸鈉水溶液，pH 6.8；流動相 B：20% 甲醇水溶液；HSA-DM1 及 DM1 的洗脫條件：初始流動相為流動相 A，15 min 內(nèi)梯度變換至流動相 B，并以流動相 B 繼續(xù)洗脫0 min；流速：0.3 ml/min；檢測波長：230 nm。

⑵HPLC 檢測 HSA-DM1 樣品中蛋白質(zhì)雜質(zhì)占比。儀器：Thermo Scientific Ultimate 3000 UPLC；色譜柱：ACQUITY UPLC Protein BEH SEC Column（200 ? 1.7 μm，4.6 mm × 150 mm）；流動相：100 mmol/L 磷酸鈉水溶液，pH 6.8；流速：0.3 ml/min；檢測波長：280 nm。

圖 2 偶聯(lián)物 HSA-DM1 的合成路線

Figure 2 Syntheses of HSA-DM1 conjugate

1.2.4 MALDI-TOF 測定偶聯(lián)物 HSA-DM1 的分子量與平均偶聯(lián)比 將保存在 PBS 溶液中的偶聯(lián)物 HSA-DM1 脫鹽后與芥子酸飽和溶液 1:1 混合，取 1 μl 點至 384 靶板上，室溫條件下自然晾干，置于 MALDI-TOF/TOF 中檢測分子量。通過測定重組人血清白蛋白和偶聯(lián)物 HSA-DM1 的平均分子量，計算出制備的偶聯(lián)物 HSA-DM1 的藥物白蛋白偶聯(lián)比（DAR），計算公式如下：

1.2.5 CCK-8 法檢測 HSA-DM1 對胰腺癌細胞增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的人胰腺癌MIA PaCa-2、PANC-1 和 BxPC-3 細胞經(jīng) 0.25% 的胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，計數(shù)，稀釋成適宜濃度接種于96 孔板，細胞密度為 4000 個/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h，待細胞貼壁生長后，加入不同濃度的藥物培養(yǎng) 72 h。血清饑餓組細胞接種 24 h 后更換無血清的培養(yǎng)液，然后加入不同濃度的藥物培養(yǎng) 72 h。每孔加入 CCK-8 溶液 10 μl 培養(yǎng) 1 ～ 3 h，酶標儀測定 450 nm 處的吸光值（450）。實驗設(shè)置無藥對照組和無細胞空白對照組，SPSS 軟件計算藥物 IC50值。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI 雙染結(jié)合流式細胞儀分析 HSA-DM1 誘導胰腺癌細胞凋亡作用 取對數(shù)生長期的 MIA PaCa-2 和 PANC-1 細胞計數(shù)后稀釋成適宜濃度接種于 6 孔板， 24 h 后給藥，繼續(xù)培養(yǎng) 24 或 48 h，然后小心收集細胞培養(yǎng)液到離心管內(nèi)備用。0.25% 胰蛋白酶消化細胞，終止消化后細胞懸液與前面收集的上清液混合，1000 r/min離心5 min，棄上清，然后加入 PBS 洗滌 2 次。加入預(yù)先配置好的 Annexin V 結(jié)合緩沖液，制成細胞數(shù)為1 × 106個/ml 的細胞懸液，取出細胞懸液 100 μl 加入到新的 EP 管中，向細胞懸液中加入 Annexin V-FITC 結(jié)合物 5 μl，再加入碘化丙啶（PI）溶液 5 μl，室溫下避光放置 15 min，加入預(yù)先配置好的 Annexin V 結(jié)合緩沖液，制成細胞數(shù)為1 × 106個/ml 的細胞懸液，取出細胞懸液 100 μl 加入到新的 EP 管中，向細胞懸液中加入 Annexin V-FITC 結(jié)合物 5 μl，再加入PI 溶液 5 μl，室溫下避光放置 15 min 后加入 Annexin V 結(jié)合緩沖液 400 μl，用 200 目濾網(wǎng)過濾樣品后上機檢測。FlowJo 軟件繪制并統(tǒng)計實驗結(jié)果。

1.2.7 Western blot 法分析 HSA-DM1 誘導胰腺癌細胞凋亡作用 將對數(shù)生長期的 MIA PaCa-2 和 PANC-1 細胞計數(shù)后稀釋成適宜濃度接種于6 孔板，24 h 后給藥，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。收集細胞，經(jīng) PBS 洗滌 2 次后，加入 150 ～ 250 μl 細胞裂解液，冰上裂解 30 min，離心 15 min（4 ℃，11 000 r/min），收集上清液并用 BCA 法測定樣品中的蛋白濃度。樣品變性處理后進行 SDS-PAGE 電泳，上樣量為 20 μg，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，膜經(jīng)封閉液作用后，與一抗抗體 4 ℃孵育過夜，膜漂洗后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗孵育 60 min，利用 ProteinSimple 凝膠成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果

2.1 DM1 與 SMCC 的合成

合成化合物 DM1 與 SMCC，中間體化合物 c 與化合物 SMCC 經(jīng)過1H-NMR 和 MS 確證，中間體化合物 P0、L-DM1-SMe 與化合物 DM1 經(jīng)過1H-NMR、13C-NMR 和 MS確證，數(shù)據(jù)如下。

2.1.1 (S)-2-(N-甲基-3-(甲基二磺酰基)丙氨基)丙酸（c） 白色固體，收率 29.2%；mp：103.4 ～105.4 ℃；1H-NMR（500 MHz，Chloroform-）δ 5.17（q，= 7.2 Hz，1H），3.00（s，3H），3.00 – 2.95（m，2H），2.85 – 2.75（m，2H），2.41（s，3H），1.44（d，= 7.2 Hz，3H）；HRMS-ESI（m/z）：238.0576（C8H16NO3S2+，[M+H+]，Calc. 238.0566）。

2.1.2 美登醇（P0） 白色固體，收率50.7%；mp：167.2 ～ 169.9 ℃；1H-NMR（400 MHz，Chloroform-）δ 7.07（s，1H），6.80（s，1H），6.46（s，1H），6.41（dd，= 15.2，11.0 Hz，1H），6.13（d，= 10.8 Hz，1H），5.51（dd，= 15.2，9.2 Hz，1H），5.29（s，1H），4.36（t，= 11.0 Hz，1H），3.97（s，3H），3.49 – 3.46（m，1H），3.45（s，1H），3.34（s，3H），3.20（s，3H），3.11（d，= 12.7 Hz，1H），2.58（d，= 9.8 Hz，1H），2.28 – 2.19（m，1H），2.11（d，= 12.4 Hz，1H），1.67（s，3H），1.32 – 1.27（m，4H），1.25（s，3H），0.83（s，3H）；13C-NMR（101 MHz，Chloroform-）δ 172.1，155.7，152.9，142.3，140.3，139.0，133.4，125.2，123.7，118.6，112.8，89.0，81.2，75.8，75.3，66.8，63.3，56.8，56.7，47.1，37.8，36.2，35.7，35.5，15.9，14.7，11.3；HRMS-ESI（m/z）：565.2336（C28H38ClN2O8+，[M+H+]，Calc.565.2311）。

2.1.3 N2'-去乙酰基-N2'-[3-(甲基二硫基)-1-氧代丙基]美登素（L-DM1-SMe） 白色固體，收率40.3%；mp：169 ～ 171 ℃；1H-NMR（600 MHz，Chloroform-）δ 6.81（d，= 1.8 Hz，1H），6.70（d，= 11.1 Hz，1H），6.62（d，= 1.8 Hz，1H），6.45 – 6.39（m，1H），6.34（s，1H），5.65（dd，= 15.4，9.1 Hz，1H），5.39（q，= 6.8 Hz，1H），4.29 – 4.23（m，1H），3.97（s，3H），3.67（s，1H），3.50 – 3.48（m，1H），3.34（s，3H），3.22（s，3H），3.09（d，= 12.8 Hz，1H），3.02 – 3.00（m，1H），2.85（s，3H），2.83 – 2.78（m，2H），2.71 – 2.64（m，1H），2.63 – 2.56（m，1H），2.25（s，3H），2.19 – 2.14（m，1H），1.67（d，= 5.6 Hz，1H），1.62（s，3H），1.56 – 1.52（m，1H），1.30 – 1.26（m，8H），0.79（s，3H）；13C-NMR（151 MHz，Chloroform-）δ（ppm） 170.8，170.7，168.8，155.9，152.4，142.0，141.0，139.3，133.3，127.6，125.3，122.1，118.7，113.1，88.4，80.8，78.1，74.1，67.2，59.9，56.6，56.5，52.4，46.5，38.8，36.1，35.5，33.4，32.4，32.0，30.7，22.5，15.5，14.5，13.3，12.1；HRMS-ESI（m/z）：784.2715（C36H51ClN3O10S2+，[M+H+]，Calc.784.2699）806.2542（C36H50ClN3O10S2Na+，[M+Na+]，Calc.806.2518）。

2.1.4 Mertansine（DM1） 白色固體，收率44.2%；mp：190 ～ 192 ℃；1H-NMR（500 MHz，Chloroform-）δ 6.82（s，1H），6.71（d，= 11.3 Hz，1H），6.67（s，1H），6.43（t，= 13.0 Hz，1H），6.27（s，1H），5.64（dd，= 15.3，9.1 Hz，1H），5.42（q，= 6.4 Hz，1H），4.77（d，= 10.8 Hz，1H），4.29（q，= 11.0 Hz，1H），3.98（s，3H），3.67（d，= 12.7 Hz，1H），3.50（d，= 9.0 Hz，1H），3.36（s，3H），3.21（s，3H），3.11（d，=12.7 Hz，1H），3.02（d，= 9.6 Hz，1H），2.84（s，3H），2.77 – 2.69（m，2H），2.66 – 2.53（m，2H），2.18（d，= 14.9 Hz，1H），1.73 – 1.67（m，1H），1.65（s，3H），1.57（d，= 13.9 Hz，1H），1.50 – 1.41（m，1H），1.30（t，= 8.0 Hz，8H），1.27 – 1.20（m，2H），0.80（s，3H）；13C-NMR（126 MHz，Chloroform-）δ 170.9，170.8，168.9，156.1，152.4，142.3，141.1，139.6，133.5，127.7，125.4，122.4，119.0，113.3，88.7，81.0，78.3，74.3，67.4，60.1，56.8，56.7，52.5，46.7，39.1，37.9，36.3，35.6，32.6，30.8，19.9，15.7，14.7，13.6，12.3；HRMS-ESI（m/z）：738.2857（C35H49ClN3O10S+，[M+H+]，Calc.738.2822）760.2670（C35H48ClN3O10SNa+，[M+Na+]，Calc.760.2641）。

2.1.5 4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯（SMCC） 白色固體，收率52.1%；mp：176.2 ～ 178.2 ℃；1H-NMR（500 MHz，Chloroform-）δ 6.69（s，2H），3.37（d，= 7.0 Hz，2H），2.80（s，4H），2.60 – 2.52（m，1H），2.14（d，= 11.9 Hz，2H），1.77（d，= 13.6 Hz，2H），1.74 – 1.66（m，1H），1.58 – 1.47（m，2H），1.10 – 0.99（m，2H）；MS-ESI（m/z）：357.2000（C16H18N2O6Na+，[M+Na+]，Calc.357.1057）。

2.2 HPLC 檢測偶聯(lián)物 HSA-DM1 樣品純度

2.2.1 HPLC 檢測偶聯(lián)物 HSA-DM1 樣品中游離 DM1 樣品中游離的效應(yīng)分子 DM1 會對后續(xù)藥理學評價造成假陽性結(jié)果，選擇效應(yīng)分子 DM1 的最大吸收波長 230 nm 進行 HPLC 檢測來判斷樣品中是否有游離的 DM1 存在。在尺寸排阻色譜 SEC 中，分子量大的成分在孔穴中滯留時間短，洗脫路徑短；分子量小的成分在孔穴中滯留時間長，洗脫路徑長。圖 3 為游離 DM1 對照組與偶聯(lián)物 HSA-DM1 樣品的色譜圖，對比可得偶聯(lián)物 HSA-DM1 樣品只存在大分子雜質(zhì)。

2.2.2 HPLC 檢測偶聯(lián)物 HSA-DM1 樣品中蛋白質(zhì)雜質(zhì)占比 選擇蛋白質(zhì)分子的特征吸收波長 280 nm 進行 HPLC 檢測來判斷樣品中蛋白質(zhì)雜質(zhì)的占比與樣品的純度。經(jīng)面積歸一化法檢測得偶聯(lián)物 HSA-DM1 樣品純度為 94.52%，蛋白質(zhì)雜質(zhì)占比為 5.48%，結(jié)果如圖 4 所示。

2.3 MALDI-TOF 測定偶聯(lián)物 HSA-DM1 的分子量與平均偶聯(lián)比

人血清白蛋白與偶聯(lián)物 HSA-DM1 的分子量如圖 5 所示。

通過偶聯(lián)物與白蛋白的分子量差值計算得到藥物白蛋白平均偶聯(lián)比為 3.32，處于文獻報道的合理偶聯(lián)比范圍內(nèi)[17]。

2.4 CCK-8 法檢測HSA-DM1 對胰腺癌細胞增殖抑制作用

在正常培養(yǎng)基條件以及血清饑餓條件評估了游離藥物 DM1 和偶聯(lián)物 HSA-DM1對三種人胰腺癌細胞系 MIA PaCa-2、PANC-1 和 BxPC-3 的增殖抑制作用，結(jié)果如圖 6 所示。在兩種培養(yǎng)條件下，偶聯(lián)物 HSA-DM1 均表現(xiàn)出了較高的殺傷腫瘤細胞能力，IC50值均在納摩爾水平，且對三種細胞系的增殖抑制作用強弱體現(xiàn)了一致的趨勢，對MIA PaCa-2 的增殖抑制作用最強，對 BxPC-3 的增殖抑制作用最弱。

圖 3 DM1 與偶聯(lián)物 HSA-DM1 的色譜圖

Figure 3 Chromatogram of DM1 and HSA-DM1 conjugate

圖 4 HSA-DM1 純度

Figure 4 Purity of HSA-DM1 conjugate

圖 5 人血清白蛋白（A）和偶聯(lián)物 HSA-DM1（B）的分子量

Figure 5 Molecular weight of HSA (A) and HSA-DM1 conjugate (B)

圖 6 HSA-DM1 對胰腺癌細胞增殖抑制作用的 IC50值（A：正常培養(yǎng)條件；B：血清饑餓條件）

Figure 6 IC50value of HSA-DM1 on proliferation inhibition of pancreatic cancer cells (A: Normal culture conditions; B: Serum starvation conditions)

2.5 HSA-DM1 可在體外誘導胰腺癌細胞 MIA PaCa-2 和 PANC-1 的凋亡

凋亡實驗結(jié)果如圖 7 所示。在 MIA PaCa-2 和 PANC-1 細胞系中分別檢測了對照、HSA-DM1 0.02 μmol/L 和 HSA-DM1 0.2 μmol/L 三組對細胞凋亡的影響，對比對照組，給藥組的凋亡率有明顯的提高，與給藥濃度呈正相關(guān)，并隨誘導時間的延長而提高。

2.6 HSA-DM1 對胰腺癌細胞 MIA PaCa-2 和 PANC-1 的凋亡信號通路的影響

利用 Western blot 方法檢測了凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9、caspase-7、cleaved caspase-7 及 PARP 在 MIA PaCa-2 和 PANC-1 細胞系中的表達情況，結(jié)果如圖 8 所示。

在 MIA PaCa-2 細胞系中，HSA 0.2 μmol/L 組蛋白中 caspase-9 與 PARP 蛋白的表達略高于溶劑組，其他測定蛋白的表達均與溶劑組無明顯差距；DM1 0.2 μmol/L 組中除了 caspase-7，其他蛋白的表達均高于溶劑組；HSA-DM1 0.02 μmol/L 組和 HSA-DM1 0.2 μmol/L 組中 caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9 與 cleaved caspase-7 的表達明顯高于溶劑組，且體現(xiàn)出劑量依賴；HSA 0.2 μmol/L + DM1 0.2 μmol/L 組中所有測定蛋白的表達均高于溶劑組。

在 PANC-1 細胞系中，HSA 0.2 μmol/L 組蛋白中 caspase-9 的表達略高于溶劑組，其余測定蛋白的表達均與溶劑組無明顯差距；HSA-DM1 0.2 μmol/L 組、DM1 0.2 μmol/L 組和 HSA 0.2 μmol/L + DM1 0.2 μmol/L 組中 cleaved caspase-3、cleaved caspase-7的表達明顯高于溶劑組。

3 討論

白蛋白會在腫瘤組織富集積累這一現(xiàn)象使得其能夠作為抗腫瘤藥物的遞送載體，但目前對該現(xiàn)象的解釋尚無公論。有研究認為這是由于實體瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR 效應(yīng)）造成的被動靶向[18]。正常組織中的微血管內(nèi)皮間隙致密、結(jié)構(gòu)完整，大分子和脂質(zhì)顆粒不易透過血管壁，而實體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差、淋巴回流缺失，造成大分子類物質(zhì)和脂質(zhì)顆粒具有選擇性高通透性和滯留性，促進大分子類物質(zhì)在腫瘤組織的選擇性分布。

同時也有研究認為白蛋白存在主動靶向腫瘤細胞的機制。白蛋白通過轉(zhuǎn)胞吞作用穿過血管內(nèi)皮，與唾液酸糖蛋白（gp60，一種 60 kD 的血管內(nèi)皮受體）結(jié)合，再與細胞內(nèi)蛋白 Cav-1 結(jié)合，然后該結(jié)合物被內(nèi)化并轉(zhuǎn)運到基底外側(cè)膜以完成轉(zhuǎn)胞吞過程，之后白蛋白與 SPARC 蛋白結(jié)合，由 SPARC 介導聚集于腫瘤細胞[19]。

納米顆粒藥物能遞送至腫瘤內(nèi)積累一直被認為是利用 EPR 效應(yīng)，這是此前開發(fā)癌癥納米藥物的基礎(chǔ)，但該解釋目前也受到人們的質(zhì)疑，在 Sindhwani 等[20]的研究中，他們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮間隙與納米顆粒轉(zhuǎn)運至實體瘤并無關(guān)系，高達 97% 的納米顆粒是通過內(nèi)皮細胞的主動轉(zhuǎn)運進入腫瘤。

大獲成功的納米粒白蛋白結(jié)合紫杉醇 Abraxane?證明白蛋白納米顆粒搭載藥物的策略可以實現(xiàn)藥代動力學的改善以及對腫瘤的靶向聚集，它的開發(fā)之初就是基于白蛋白與納米顆粒的 EPR 效應(yīng)，但同樣有研究表明 Abraxane?并不是通過 EPR 效應(yīng)進入腫瘤的，而是通過主動轉(zhuǎn)運并且其轉(zhuǎn)運途徑與內(nèi)源性白蛋白不相同。白蛋白納米顆粒在一定程度上改變了白蛋白的結(jié)構(gòu)，Abraxane?并不通過正常白蛋白的受體 gp60 轉(zhuǎn)運至腫瘤細胞，其轉(zhuǎn)運與變性白蛋白的親和受體 gp30 的相關(guān)性更強[21]，因此白蛋白納米顆粒不能完全發(fā)揮出白蛋白的優(yōu)勢。此外，納米顆粒制劑還存在網(wǎng)狀內(nèi)皮器官（如肝臟和脾臟）的吸收和滯留問題[22]，這會導致非腫瘤器官也可能出現(xiàn)白蛋白納米顆粒的積累，進而造成脫靶毒性。

目前以白蛋白作為遞送載體的研究中大多采用前藥策略[23-26]，以目前處于臨床 II 期實驗階段的 INNO-206 為代表，通過功能化接頭馬來酰亞胺與內(nèi)源性白蛋白的 Cys34 結(jié)合[27]，以達到改善藥代動力學以及富集于腫瘤部位的目的。該前藥在體外的血漿實驗中能在 5 min 內(nèi)選擇性地與內(nèi)源性血清白蛋白結(jié)合[27]，但目前尚不確定其在體內(nèi)生理條件下能否達到這種效果。同時除了血清白蛋白以外，淋巴細胞表面同樣存在游離的巰基[28]，這導致該前藥在體內(nèi)可能會出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。

我們這項工作主要是受到抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的啟發(fā)，利用白蛋白在腫瘤組織和細胞間定向傳遞的特點，來模擬 ADC 藥物的作用機制。ADC 通過連接子將抗體與藥物載荷連接，在進入體內(nèi)后抗體與抗原特異性結(jié)合，將藥物載荷靶向遞送至腫瘤細胞，在細胞中藥物載荷被釋放，進而殺傷腫瘤細胞。雖然 ADC 目前在抗腫瘤領(lǐng)域非常成功，但其也存在一些問題。

MIA PaCa-2 Control 24 h HSA-DM1 0.02 μmol/L 24 h HSA-DM1 0.2 μmol/L 24 h Control 48 h HSA-DM1 0.02 μmol/L 48 h HSA-DM1 0.2 μmol/L 48 h PANC-1 Control 24 h HSA-DM1 0.02 μmol/L 24 h HSA-DM1 0.2 μmol/L 24 h Control 48 h HSA-DM1 0.02 μmol/L 48 h HSA-DM1 0.2 μmol/L 48 h A

Figure 7 HSA-DM1 induces apoptosis of MIA PaCa-2 and PANC-1 pancreatic cancer cells (A: Flow cytometry scatter plots; B: Apoptosis rate)

圖 8 Western blot 法檢測 HSA-DM1 對胰腺癌細胞 MIA PaCa-2 和 PANC-1 的凋亡信號通路的影響

Figure 8 The effect of HSA-DM1 on the apoptosis signaling pathway of MIA PaCa-2 and PANC-1 cells was detected by Western blot

ADC 與單克隆抗體一樣存在“結(jié)合位點屏障”問題[29-30]，雖然 ADC 與腫瘤血管周圍的靶抗原緊密結(jié)合，卻不能穿透整個腫瘤。針對該問題，Cilliers 等[31]給出了一種改善方法，將曲妥珠單抗和 T-DM1 共同給藥能夠提高滲透性，該方法雖然減少了有效載荷的數(shù)量，卻能提高療效。ADC 同樣面臨著耐藥問題，腫瘤細胞中靶抗原較正常細胞的更高表達是其安全性與有效性的必要條件，目前 T-DM1 存在的多種耐藥細胞系中[32]，部分腫瘤細胞的 HER2 呈現(xiàn)低表達水平造成曲妥珠單抗與細胞的結(jié)合率下降[33]，進而導致治療失敗。

我們希望借用 ADC 思路開發(fā)的白蛋白-偶聯(lián)物能擁有類似 ADC 靶向腫瘤細胞的能力，同時具備良好的腫瘤部位的滲透性且不需要依賴特定的抗體與抗原結(jié)合作用。

在這項工作中我們選擇不可裂解型連接子 SMCC 將 DM1 與白蛋白偶聯(lián)，主要是因為其在循環(huán)系統(tǒng)中具有良好的穩(wěn)定性，只有在偶聯(lián)物被溶酶體降解時才會釋放效應(yīng)分子賴氨酸-SMCC-DM1，能最大程度地避免效應(yīng)分子提前釋放的情況并發(fā)揮白蛋白較長體內(nèi)半衰期的優(yōu)勢。有研究表明，采用賴氨酸殘基偶聯(lián)策略制備的 ADC 樣品，其抗體藥物偶聯(lián)比控制在 3 ～ 4 之間比較合理[17]，過低的偶聯(lián)比會導致效力不足，但過高的偶聯(lián)比會導致溶解性變差并產(chǎn)生系統(tǒng)性毒副作用，Kadcyla?就將平均偶聯(lián)比控制為 3.5[34]?；谝陨辖?jīng)驗，我們將偶聯(lián)物 HSA-DM1 的平均偶聯(lián)比控制在 3.32。

通常制備白蛋白偶聯(lián)物會選擇采用與白蛋白上的 Cys34 進行連接，因為白蛋白上僅有一個游離的硫醇基團，這樣制得的偶聯(lián)物能夠保證同質(zhì)均一性，但缺點是無法通過增加效應(yīng)分子來增強偶聯(lián)物的抗腫瘤活性。若要增加白蛋白游離硫醇基團數(shù)目，就必須還原白蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部的其他二硫鍵，但二硫鍵對保持白蛋白的結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要，這樣制得的偶聯(lián)物破壞了二級結(jié)構(gòu)，其活性反而不如只連接一個效應(yīng)分子的偶聯(lián)物[35]。

白蛋白中的賴氨酸殘基較半胱氨酸更為豐富，且通常位于蛋白質(zhì)表面，為此選擇偶聯(lián)賴氨酸殘基的策略可以通過連接復(fù)數(shù)的效應(yīng)分子以得到活性更高的白蛋白偶聯(lián)物。對比Liu 等[35]的研究，偶聯(lián)物 HSA-DM1 的體外的細胞活性實驗結(jié)果也證實了我們的假設(shè)。

我們用 CCK-8 法測定了偶聯(lián)物體外抗胰腺癌細胞活性，在 MIA PaCa-2、PANC-1 與BxPC-3 三種細胞系中，HSA-DM1 均表現(xiàn)出了良好的增殖抑制作用，IC50值均在納摩爾水平。Liu 等[35]通過偶聯(lián)白蛋白上的 Cys34 制備了 MMAE（甲基澳瑞他汀 E，一種微管蛋白抑制劑）與白蛋白的單效應(yīng)分子偶聯(lián)物 ALDC1，并測定了體外活性。MMAE對 MIA PaCa-2 與 PANC-1 細胞系的 IC50值分別為 0.5 nmol/L 與 0.21 nmol/L，較我們測定的游離 DM1 的活性更高，但其偶聯(lián)物 ALDC1 對兩個細胞系的 IC50值均為微摩爾水平，較我們制備的偶聯(lián)物 HSA-DM1 的活性有一定的差距。

在測定的三種細胞系中，游離藥物 DM1 的 IC50均比偶聯(lián)物 HSA-DM1 低，這種活性的差異可能是由 DM1 與 HSA-DM1 不同的內(nèi)化途徑導致的。DM1 是一種親脂性小分子（logP ～ 2.77，計算值），因此在體外可以通過自由擴散和滲透穿過細胞膜進入細胞內(nèi)，而在 DM1 與人血清白蛋白偶聯(lián)后，HSA-DM1 只能通過內(nèi)吞作用內(nèi)化到細胞中，且其降解后的效應(yīng)形態(tài)賴氨酸-SMCC-DM1 同樣無法自由擴散，不能通過旁觀者效應(yīng)殺傷周圍腫瘤細胞[36]。

對比游離藥物 DM1 和偶聯(lián)物 HSA-DM1 對三種細胞系的增殖抑制作用，可以看出游離藥物 DM1 對三種細胞系的增殖抑制作用無選擇性差別，而偶聯(lián)物 HSA-DM1 在兩種條件下對三種細胞系的增殖抑制作用強弱體現(xiàn)出一致的趨勢。對比 BxPC-3 細胞系，偶聯(lián)物 HSA-DM1 對 MIA PaCa-2、PANC-1 細胞系的增殖抑制作用有一定的提高。

三種細胞系中，MIA PaCa-2、PANC-1 細胞系為突變型的胰腺癌細胞，BxPC-3 則為野生型。s 突變會增強癌細胞的巨胞飲作用，增加對白蛋白的吞噬，但實驗結(jié)果并沒有明顯差距。我們推測這可能是由于體外實驗條件與體內(nèi)條件存在差異，在正常培養(yǎng)基條件下，由于培養(yǎng)基中帶有細胞生長所需的各種氨基酸，在營養(yǎng)充足的條件下癌細胞可能會減弱或不需要通過巨胞飲吞噬白蛋白來補充自身生長所需的氨基酸與營養(yǎng)。

綜上所述，本研究利用不可裂解型連接子 SMCC 將微管蛋白抑制劑 DM1 與白蛋白賴氨酸殘基偶聯(lián)，在保持白蛋白自身結(jié)構(gòu)的同時最大程度地避免脫靶毒性并通過連接多個效應(yīng)分子以提高活性，結(jié)果表明偶聯(lián)物 HSA-DM1 具有顯著的抑制胰腺癌細胞增殖活性，該偶聯(lián)策略值得進一步深入研究，為靶向抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了思路。

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Preparation andanti-pancreatic cancer activity study of albumin-maytansine conjugate

HU Shang-jiu, WANG Ying, ZHANG Guo-ning, ZHU Mei, WANG Ming-hua, WANG Ju-xian

Author Affiliation: Organic Synthesis Chamber, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To prepare human serum albumin (HSA)-mertansine derivative (DM1) conjugate and evaluate its anti-pancreatic cancer cells activity.Maytansine derivative DM1 was synthesized by reduction and esterification reaction from ansamitocin. The linker SMCC was synthesized by reaction of N-hydroxysuccinimide and maleic anhydride. HSA-DM1 was prepared by coupling DM1 with human serum albumin through the linker SMCC. HPLC and MALDI-TOF were used to characterize and calculate the average coupling ratio. CCK-8 method was used to detect the inhibitory effect of the conjugate on the proliferation of three pancreatic cancer cell lines: MIA PaCa-2, PANC-1 and BxPC-3. Flow cytometry and Western blot were used to detect its proapoptotic effect on MIA PaCa -2 and PANC-1 cells.Successful preparation of HSA-DM1 conjugate and it’s average coupling ratio was 3.32. The IC50values of HSA-DM1 were (48.2 ± 6.5), (55.0 ± 4.7) and (84.0 ± 11.8) nmol/L for MIA PaCa-2, PANC-1 and BxPC-3 cell lines, respectively. And the proapoptotic effect on MIA PaCa-2 and PANC-1 cells was dose-dependent.The conjugated compound HSA-DM1 has significant inhibitory activity on the proliferation of pancreatic cancer cells and has potential clinical application prospect.

human serum albumin; maytansine derivative; conjugate; pancreatic cancer

WANG Ju-xian, Email: wangjuxian@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.002

中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程（2021-I2M- 1-026）

王菊仙，Email：wangjuxian@imb.pumc.edu.cn

2022-04-01