基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機制*

許博，馬俊福，鄭福增，趙晶晶

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是以患者關(guān)節(jié)活動受限和畸形為主要癥狀的自身免疫性疾病，在中醫(yī)學(xué)中屬“尪痹”范疇。目前，治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的常用藥物分為四大類，即非甾體類抗炎藥(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)、改善病情的抗風(fēng)濕藥(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)、糖皮質(zhì)激素和植物藥[1]。但這些常用治療藥物大多存在不良反應(yīng)且需要長期服用以維持療效，給患者生活帶來較大困擾。

四妙消痹湯由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草、白花蛇舌草、山慈菇、豨薟草、虎杖、白芍、土茯苓和威靈仙組成，方中金銀花清熱解毒、疏散風(fēng)熱，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用[2]；玄參滋陰、降火、生津、涼血、解毒，具有抗炎、抗菌功效[3]；當(dāng)歸補血活血、調(diào)經(jīng)止痛，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化作用[4]；甘草補脾益氣、緩急止痛、緩和藥性、調(diào)和諸藥，具有抑菌、抗腫瘤的作用[5]；白花蛇舌草清熱解毒、利尿消腫、活血止痛，具有抗菌消炎、抗腫瘤作用[6]；山慈菇清熱解毒、化痰散結(jié)[7]；豨薟草祛風(fēng)濕、通絡(luò)利筋骨、益肝腎[8]；虎杖清熱解毒、利濕退黃、散瘀止痛、化痰止咳[9]；白芍平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗[10]；土茯苓祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、解毒、鎮(zhèn)痛、抗菌[11]；威靈仙祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，止痛，消骨鯁[12]，諸藥共用，起到利濕通痹、柔筋利節(jié)、清熱解毒、活血止痛的功效。

四妙消痹湯在臨床常被用來治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，但其作用機理鮮有研究，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行討論分析，旨在探索四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的具體作用機制，為后續(xù)藥物治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 四妙消痹湯組方中藥活性成分及其作用靶點篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)進(jìn)行檢索并以化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得四妙消痹湯中11味中藥的有效成分及其相關(guān)靶點，再通過uniprot數(shù)據(jù)庫對藥物有效成分相關(guān)靶點進(jìn)行名稱規(guī)范，并獲得其簡稱。

1.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病靶點及四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎潛在靶點的獲取通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫、藥物基因組學(xué)知識庫(pharmacogenomics knowledgebase，PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org/)、藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//go.drugbank.com/)搜索類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病靶點，將5個數(shù)據(jù)庫獲得的靶點信息導(dǎo)入R語言，排除重復(fù)靶點。利用R語言將藥物有效成分相關(guān)靶點與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點進(jìn)行映射，得到的重復(fù)靶點即為四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點，并據(jù)此繪制Venn圖。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)將四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點導(dǎo)入STRING(https：//cn.string-db.org/)在線分析平臺，蛋白種類種屬設(shè)置為“Homo sapiens”并設(shè)置最低相互作用閾值>0.95，其他設(shè)置保持默認(rèn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選得到核心靶點。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析利用R語言和BiocManager中的數(shù)據(jù)包將四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點轉(zhuǎn)換為基因ID。再使用R軟件中的數(shù)據(jù)包和相關(guān)函數(shù)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析，并將富集分析結(jié)果中前20條進(jìn)行可視化。

1.5 分子對接根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)查閱，選取3個核心靶點及3個藥物有效成分進(jìn)行分子對接。在PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中搜索藥物有效成分2D結(jié)構(gòu)，再利用ChemBio3D Ultra 14.0軟件轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)；通過PDB(RCSB PDB：Homepage https：//www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載核心靶點的蛋白結(jié)構(gòu)并利用PyMOLWin軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行簡化。將藥物有效成分3D結(jié)構(gòu)和核心靶點蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)導(dǎo)入AutoDockTools-1.5.6軟件得到活性口袋數(shù)據(jù)，通過R語言運用Vine進(jìn)行分子對接并利用PyMOLWin.exe軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 四妙消痹湯組方中藥活性成分及其作用靶點篩選通過TCMSP檢索獲得四妙消痹湯中11味中藥的有效成分190個，其中白花蛇舌草7個、白芍13個、當(dāng)歸2個、甘草92個、虎杖10個、金銀花23個、山慈菇3個、土茯苓15個、威靈仙7個、豨薟草9個、玄參9個。通過TCMSP檢索190個有效成分的相關(guān)靶點，去重后共得到215個。

2.2 四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點通過GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD及DrugBank數(shù)據(jù)庫搜索類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病靶點，刪除重復(fù)靶點后共得到2 971個類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點，如圖1。利用R語言將藥物有效成分相關(guān)靶點與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點進(jìn)行映射，得到重復(fù)靶點151個，即為四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點，如圖2。

圖1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點信息

圖2 四妙消痹湯與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎共同靶點

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)將四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點導(dǎo)入STRING在線分析平臺，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖3。同樣將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0得到圖4A。利用Cytoscape3.8.0中的CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，依?jù)Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC、Network 6個參數(shù)的中位值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到關(guān)鍵靶點，見圖4B。以相同的標(biāo)準(zhǔn)對關(guān)鍵靶點進(jìn)行再次篩選后得到核心靶點基因11種，包括JUN、MAPK1、FOS、TP53、ESR1等，圖4C。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

注：A：PPI網(wǎng)絡(luò)；B：關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)；C：核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖4 核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能富集分析與KEGG信號通路富集分析采用R語言對四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點進(jìn)行GO功能富集分析，其中包括生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分。生物學(xué)過程主要包括對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、對金屬離子的反應(yīng)(response to metal ion)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)等；細(xì)胞組分主要包括膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(transcription regulator complex)、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物(transferase complex)、蛋白激酶復(fù)合物(protein kinase complex)等；分子功能包括DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)等，如圖5。采用R語言對四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，根據(jù)P<0.05，篩選出172條信號通路，主要為脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)-AGE受體(the receptor of AGE，RAGE)信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎(hepatitis B)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等，如圖6。

圖5 GO富集分析氣泡圖

圖6 KEGG富集分析氣泡圖

2.5 分子對接結(jié)果根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾跋嚓P(guān)文獻(xiàn)，選取HSP90AA1、JUN及RELA 3個核心靶點與山柰酚(kaempferol)、毛地黃黃酮(luteolin)及槲皮素(quercetin)3個藥物有效成分進(jìn)行分子對接發(fā)現(xiàn)，藥物有效成分與核心靶點之間能相互結(jié)合并有較好的親和力。見圖7、表1。

注：A：HSP90AA1與kaempferol；B：HSP90AA1與luteolin；C：HSP90AA1與quercetin；D：JUN與kaempferol；E：JUN與luteolin；F：JUN與quercetin；G：RELA與kaempferol；H：RELA與luteolin；I：RELA與quercetin圖7 藥物有效成分與核心靶點分子對接示意圖

表1 藥物有效成分與核心靶點分子對接結(jié)果 (kcal·mol-1)

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見慢性疾病，其活動期癥狀往往表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹變形，嚴(yán)重者會導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，多見于中年女性[13]?！肚Ы鹨健分刑岬健盁岫玖饔谒闹?，歷節(jié)腫痛”，據(jù)此采用清熱解毒、通痹止痛的治療方法，四妙消痹湯具有清熱解毒、活血止痛、通痹利濕的功效，因此，臨床上常采用四妙消痹湯治療活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，具有較好的療效[14]，且不良反應(yīng)較少，具有較高的臨床價值[15]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥理學(xué)機制進(jìn)行研究，篩選出四妙消痹湯主要活性成分為豆甾醇、槲皮素、山柰酚、甘草寧B、β-谷甾醇、芍藥苷、兒茶素、華良姜素、異鼠李素、木樨草素等。研究表明，豆甾醇可通過刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)增生，加強巨噬細(xì)胞能力，從而發(fā)揮抗炎作用[16]。槲皮素可有效抑制分泌多種致炎分子的環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)促進(jìn)子的轉(zhuǎn)錄活性，同時能夠刺激細(xì)胞增殖[17]，還能通過降低中性粒細(xì)胞對炎癥因子的敏感性從而達(dá)到抗炎的作用[18]。山柰酚可以通過抑制炎癥因子一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、COX-2及C-反應(yīng)蛋白 (C-reaction protein，CRP)等的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[19]，且高劑量山柰酚還可通過調(diào)節(jié)鈣離子代謝平衡，促進(jìn)骨膠原生成[20]。研究表明，山柰酚可通過抑制黃嘌呤氧化酶活性減少體內(nèi)黃嘌呤生成尿酸，從而降低高尿酸血癥和痛風(fēng)[21]，還可通過降低氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的B類清道夫受體CD36mRNA表達(dá)保護(hù)低密度脂蛋白的氧化，通過抑制巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白的攝取防止動脈粥樣硬化的發(fā)生[22]。劉慧瓊等[23]通過對豬油的抗氧化實驗發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇是一種良好的抗氧化劑，具有很好的清除自由基的能力，由于自由基與衰老、炎癥、休克、動脈粥樣硬化、藥物及酒精中毒等有關(guān)，β-谷甾醇還可作為外源性氧自由基清除劑。芍藥苷可通過調(diào)節(jié)糖原合成酶激酶3β和核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路降低β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活性從而達(dá)到下調(diào)促炎因子表達(dá)和上調(diào)抗炎因子表達(dá)的效果[24]。曾亮等[25]通過抑菌環(huán)實驗證明了兒茶素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制作用。研究表明，木樨素通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性影響菌體核酸和蛋白質(zhì)合成，具有明顯的抑菌活性，且在0.30～9.75 mg·L-1濃度范圍內(nèi)可明顯抑制柯薩奇B3病毒引起的細(xì)胞病變，具有體外抗柯薩奇B3病毒的作用[26-27]。此外，木樨草的抗炎作用可能與其抑制核內(nèi)NF-κB的表達(dá)和降低DNA結(jié)合活性從而下調(diào)COX-2蛋白的表達(dá)有關(guān)[28]。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治隹芍拿钕詼委燁愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要靶點為CCND1、FOS、MAPK3、ESR1、JUN。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌癌變組織中CCND1呈高表達(dá)，具有促癌作用，沉默CCND1基因表達(dá)可抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展并提高化療敏感性[29]。鮑亮等[30]研究發(fā)現(xiàn)，ESR1基因多態(tài)性與膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病有一定聯(lián)系，ESR1基因突變可能會增加膝骨關(guān)節(jié)炎患病風(fēng)險。核心靶點GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要涉及的通路有脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、IL-17信號通路、TNF信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等。大量實驗和臨床證據(jù)表明，在自身免疫性疾病和炎性病變中都有 IL-17 的參與，且在誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)和炎癥病變的過程中IL-17起到了重要的調(diào)節(jié)因子的作用[31]。姜瑞雪等[32]研究發(fā)現(xiàn)，固本健腦方改善老年健忘大鼠記憶功能的分子機制與AGE-RAGE信號通路密切相關(guān)。JUN家族成員包含c-JUN、JUNB和JUND[33]，研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌NCU116通過c-JUN信號通路促進(jìn)結(jié)腸黏膜穩(wěn)態(tài)和Muc2基因表達(dá)[34]。在分子對接中，一般認(rèn)為配體與受體分子的構(gòu)象穩(wěn)定時，其能量越低，發(fā)生作用的可能性越大，因此根據(jù)分子對接結(jié)果顯示山柰酚、毛地黃黃酮、槲皮素與JUN結(jié)合度最好，山柰酚是一種天然的免疫抑制劑，可減少由于T淋巴細(xì)胞過度活化和增殖所導(dǎo)致的自身免疫病和器官移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，毛地黃黃酮(木樨草素)能通過降低炎癥因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性減少促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[35]，槲皮素能夠通過降低中性粒細(xì)胞對炎癥因子的敏感性達(dá)到抗炎效果[18]，JUN(c-JUN)通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制因子PTEN的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生存[36]。

綜上所述，四妙消痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有多成分、多靶點、多途徑的特點，為臨床應(yīng)用治療提供了科學(xué)依據(jù)，也為探索新的治療方法提供思路。