生脈湯HPLC指紋圖譜的建立及質(zhì)量控制*

李明明，朱志軍，黨曉月，李航飛

河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046

生脈湯源自金代張元素的《醫(yī)學啟源》，書中記載人參、麥冬、五味子3味藥，長流水煎，即得生脈湯。方中人參大補元氣、生津復脈、補脾益肺，佐以麥冬，養(yǎng)陰潤肺、益胃生津，五味子收斂固澀、益氣生津止渴。三藥“一補一潤一斂”，行益氣復脈、斂陰止汗、生津止渴之效，用于治療氣陰兩虛證。臨床研究表明生脈制劑應用廣泛，對心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病、腫瘤等均具有良好的治療作用[1-2]。生脈湯中主要成分為皂苷類、黃酮類、木脂素類、多糖類、有機酸類等[3-4]，具有治療糖尿病[5]、心力衰竭[6]、休克[7]、肺氣腫[8]、支氣管哮喘[9]、肝炎[10]、便秘[11]、心肌病[12]、抑郁癥[13]等多種藥理活性。木脂素類作為生脈方中第二大類有效成分，具有抗病毒、抗焦慮、抗癲癇、抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗衰老、抗腫瘤、護肝、抗菌和保護神經(jīng)細胞，改善記憶力等功效[14-15]。

皂苷類成分水溶性差，并且在高濕熱和偏酸性的條件下易分解[16]，因此采用傳統(tǒng)湯劑的制備方法，皂苷類成分含量較低。有研究表明，生脈方中五味子的木脂素類成分能夠促進人參皂苷類成分的攝入，并降低人參皂苷的排出率，從而使細胞內(nèi)人參皂苷的濃度增加[16]。因此五味子與人參配伍使用能增強人參的藥效，由此可見木脂素類成分在生脈湯中含量較多且作用關(guān)鍵。目前對于該方傳統(tǒng)湯劑的研究主要聚集在臨床方面，其質(zhì)量控制研究較少?；谝陨显颍狙芯恳晕逦蹲哟技追鍨閰⒄辗褰⒘藗鹘y(tǒng)方劑生脈湯的指紋圖譜，確認了13個共有峰，并指認了五味子中3種木脂素類成分，結(jié)合相似度評價、主成分分析、聚類分析和正交偏最小二乘判別分析等化學計量方法，對10批生脈湯的質(zhì)量進行綜合評價，為生脈湯的質(zhì)量控制提供有效的方法依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent Technologies 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)、METTLERAE 240 十萬分之一天平(德國梅特勒公司)、PTHW型調(diào)溫電熱套(鞏義市英峪予華電熱儀器廠)、UPH-II-107優(yōu)普超純水機(成都優(yōu)普超純科技有限公司)、KQ-500 DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)。

1.2 材料對照品五味子醇甲(18022702，純度≥98%)、五味子甲素(18032609，純度≥98%)、五味子乙素(17052105，純度≥98%)，均由四川省維克奇生物科技有限公司提供；人參飲片購于盛實百草藥業(yè)有限公司(A170128001)，麥冬飲片購于浙江桐君堂中藥飲片有限公司(180508)，五味子購于安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司(18042612)；D 101大孔吸附樹脂(天津市光夏精細化工研究所)，甲醇、乙腈均為色譜純(安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?。生脈湯(實驗室自制)生產(chǎn)批號依次為20191025、20191027、20191028、20191030、20191101、20191102、20191104、20191106、20191107、20191109。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Diamonsil C18(L)(4.6 mm×250.0 mm)；流動相：乙腈(A)-水(B)；梯度洗脫(0-10 min，20%→22%A；10-30 min，22%→28%A；30-45 min，28%→40%A；45-75 min，40%→62%A；75-100 min，62%→80%A)；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm[17]。

2.2 對照品溶液的制備分別精密稱取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品，加甲醇定容至 5 mL，配制成濃度分別為0.384 g·L-1、0.040 g·L-1、0.024 g·L-1的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備稱取人參5 g，麥冬10 g，五味子5 g，分別粉碎，混合，加入適量蒸餾水煎煮，過濾，濾液濃縮至50 mL，緩慢加入200 mL無水乙醇，邊加邊攪拌，過濾，濾液濃縮至50 mL，取10 mL濃縮液過D101大孔吸附樹脂柱，用6.6 BV蒸餾水洗雜后，再用5.9 BV 70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，于60 ℃水浴蒸干，加甲醇溶解定容至10 mL，過0.22 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液，備用。

2.4 生脈湯HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 方法學考察

2.4.1.1 精密度實驗取2.3項下生脈湯供試品溶液適量，按2.1項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，以五味子醇甲為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果13個共有峰相對保留時間的RSD值均<0.30% (n=6)，相對峰面積的RSD值均<3.20% (n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.4.1.2 穩(wěn)定性實驗取2.3項下生脈湯供試品溶液適量，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按2.1項下的色譜條件進樣，以五味子醇甲為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果13個共有峰相對保留時間的RSD值均<0.04% (n=6)，相對峰面積的RSD值均<4.60% (n=6)，表明生脈湯供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.1.3 重復性實驗取處方量藥材，按2.3項下方法制備6份生脈湯供試品溶液，按2.1項下的色譜條件進樣，以五味子醇甲為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果13個共有峰相對保留時間的RSD值均<0.09% (n=6)，相對峰面積的RSD值均<4.90% (n=6)，表明生脈湯樣品溶液重復性良好。

2.4.2 指紋圖譜的建立按2.3項下方法制備10批生脈湯供試品溶液，按2.1項下的色譜條件進樣測定，記錄10批生脈湯樣品的色譜圖，然后將10批生脈湯供試品溶液的指紋圖譜數(shù)據(jù)導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)，生成10批生脈湯HPLC指紋圖譜的對照圖譜R，以S1號色譜圖為參考，時間窗寬度設為0.4 min，進行多點校正和自動匹配，建立生脈湯劑的指紋圖譜，結(jié)果如圖1。

圖1 10批生脈湯指紋圖譜

2.4.3 相似度評價將10批生脈湯供試品溶液的指紋圖譜數(shù)據(jù)導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)，計算相似度，結(jié)果見表1。10批生脈湯供試品溶液的指紋圖譜的相似度均≥0.980。表明藥材質(zhì)量均一、穩(wěn)定以及實驗方法穩(wěn)定可靠。

表1 10批生脈湯指紋圖譜相似度評價結(jié)果

2.4.4 共有峰的確定及相關(guān)分析結(jié)合色譜峰分離情況與對照圖譜R，10批樣品共標定了13個共有峰，通過與對照品色譜圖比對，指認出3個成分，分別為2號色譜峰(五味子醇甲)、12號色譜峰(五味子甲素)和13號色譜峰(五味子乙素)，結(jié)果如圖2。以峰面積較大和分離度較好的五味子醇甲色譜峰為參照峰(S)，計算各特征峰的保留時間和保留峰面積與同一圖譜中S1峰的保留時間和保留峰面積的比值，得到10批生脈湯樣品共有峰相對保留時間RSD為0.000%～0.067%，相差較小，相對峰面積RSD為0.000%～4.220%，結(jié)果如表2、表3所示。說明不同批次藥材之間，成分含量稍有差異。

注：a：五味子醇甲；b：五味子甲素；c：五味子乙素圖2 對照品和樣品疊加圖譜

表2 10批生脈湯指紋圖譜共有峰相對保留時間

表3 10批生脈湯指紋圖譜共有峰相對峰面積

2.4.5 聚類分析以13個共有峰的峰面積為變量，導入SPSS26.0軟件，以組間聯(lián)結(jié)法結(jié)合平方歐氏距離進行聚類分析，繪出樹狀圖，結(jié)果如圖3，當分類距離為10時，10批樣品可聚為2類，S1、S3、S8、S10樣品聚為一類，S2、S4、S5、S6、S7、S9樣品聚為一類。說明不同批次之間存在一定的差異性。

圖3 10批生脈湯樣品聚類分析圖

2.4.6 主成分分析運用SPSS26.0 軟件，以10批生脈湯樣品指紋圖譜的13個共有峰峰面積為變量，對其進行主成分分析，提取2個主成分，結(jié)果前兩個主成分的方差貢獻率分別為91.366%、0.359%，累計方差貢獻率達到94.126%，如表4所示。得分系數(shù)矩陣見表5，由結(jié)果可知2號色譜峰(五味子醇甲)、4號色譜峰和9號色譜峰對主成分1的貢獻較大，5號色譜峰、6號色譜峰和13號色譜峰(五味子乙素)對主成分2的貢獻較大。以13個共有峰的峰面積為變量，導入SIMCA-P14.1軟件，建立PCA模型，共提取2個主成分，模型解釋率R2X為0.979，預測力Q2為0.852，均>0.5，說明建立的模型具有較高的穩(wěn)定性和預測率，能夠識別樣品組間差異，PCA得分圖見圖4，其分類結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，10批樣品分為兩類，S1、S3、S8、S10樣品分布在左側(cè)，其余的樣品分布在右側(cè)。

表4 生脈湯主成分特征值及方差貢獻率

表5 生脈湯主成分得分系數(shù)矩陣

圖4 10批生脈湯主成分分析得分圖

2.4.7 正交偏最小二乘判別分析為找出10批樣品的組間差異及差異成分，將10批生脈湯樣品共有峰的峰面積導入SIMCA-P14.1軟件進行正交偏最小二乘判別分析，得分矩陣圖如圖5。結(jié)果表明10批樣品聚為兩類，S1、S3、S8、S10聚為一類，S2、S4、S5、S6、S7、S9聚為一類，與聚類分析和主成分分析結(jié)果一致。通過VIP值篩選出影響生脈湯成分差異的標志性成分，結(jié)果見圖6。以 VIP 值>1為篩選標準，標記出3個貢獻較大的成分，依次為2號峰(五味子醇甲，VIP值為2.473 44)、10號峰(VIP值為1.262 32)、7號峰(VIP值為1.197 69)，以上3種成分對生脈湯成分含量上的差異影響較大，因此在控制生脈湯質(zhì)量時可以此3種成分為參考。

圖5 10批生脈湯樣品正交偏最小二乘判別分析得分圖

圖6 10批生脈湯正交偏最小二乘判別分析VIP值圖

3 討論

本研究在生脈湯指紋圖譜的建立過程中分別考察了提取純化方法(水飽和正丁醇萃取、大孔吸附樹脂純化、70%乙醇超聲)、流動相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液)、柱溫(25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、40 ℃)、流速(0.7 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.9 mL·min-1、1.0 mL·min-1)、進樣量(5 μL、10 μL、15 μL)等影響因素，最終確定以乙腈(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為 30 ℃，進樣5 μL，檢測波長203 nm為色譜條件。在本實驗確定的條件下，指紋圖譜基線平穩(wěn)，分離度和峰形良好，具有較好的重復性和穩(wěn)定性。

對10批生脈湯指紋圖譜進行聚類分析，結(jié)果顯示當分類距離為10時，10批生脈湯樣品可分為兩類；主成分分析結(jié)果顯示2號峰(五味子醇甲)、4號峰、5號峰、6號峰、9號峰和13號峰(五味子乙素)對生脈湯的主要成分影響較大，PCA得分圖結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，將10批生脈湯指紋圖譜分為兩類；正交偏最小二乘判別分析顯示VIP值>1的2號色譜峰(五味子醇甲)、10號色譜峰和7號色譜峰成分為決定生脈湯質(zhì)量的主要差異性成分，其得分矩陣圖的分類結(jié)果與聚類分析一致。將10批生脈湯樣品分為兩類，說明10批樣品之間有相似性的同時也具有一定的差異性。

人參和麥冬中均有皂苷類成分，曾嘗試對該制備方法下的生脈湯指紋圖譜中皂苷類成分進行比對，但由于水溶性差，且在濕熱環(huán)境下不穩(wěn)定[17-18]，易轉(zhuǎn)化為其他成分；并且其轉(zhuǎn)化比率與pH值相關(guān)，在酸性條件下更容易使皂苷發(fā)生水解，在生脈湯處方中，五味子含有大量的有機酸[19-20]和氨基酸[21]類物質(zhì)，使湯劑的整體pH值降低，促進了皂苷類成分水解；《中華人民共和國藥典》中生脈飲的制備方法為用65%的乙醇滲漉，最終只以五味子醇甲的含量作為指標。在本實驗樣品制備的過程中，先后用蒸餾水和70%乙醇對水提液進行洗脫作為生脈湯供試品溶液，與生脈飲的制備方法有相似之處，故可能會導致皂苷類成分的部分流失，使在本實驗的方法條件下制備的樣品中皂苷類成分含量相對較低。

本實驗結(jié)合化學計量學的分析方法建立了10批生脈湯的指紋圖譜，整體均一性良好、質(zhì)量穩(wěn)定，且該方法簡便、可靠，可以通過控制生脈湯指紋圖譜整體相似度和圖譜中2號色譜峰(五味子醇甲)、10號色譜峰和7號色譜峰成分來全面評價生脈湯質(zhì)量，保障生脈湯臨床用藥的有效性。