金鐘花總黃酮提取工藝及抗氧化活性研究*

陳志紅，龔海燕，崔永霞，雷敬衛(wèi)，李偉峰

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

金鐘花(ForsythiaviridissimaLindl.)為木樨科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)落葉灌木，亦稱單葉連翹，迎春條等。其主要分布在江蘇、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南等省，現(xiàn)在多作為城市景觀植物。金鐘花味苦、性涼，花、根、葉和果實(shí)均可入藥，具有解毒、散結(jié)的功效，在江蘇、安徽和浙江等地廣泛使用，主要治療感冒發(fā)熱和目赤腫痛等[1-2]。

金鐘花與連翹同科同屬，研究表明連翹屬植物中主要含黃酮類、萜類和苷類等成分，黃酮類化合物廣泛存在于植物體內(nèi)，具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗癌等多種生物活性[3-6]。近年來金鐘花受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。江月鋒[7]將金鐘花研制成保健酒治療腰椎間盤突出并取得不錯(cuò)的經(jīng)濟(jì)效益；王桃云等[8]對(duì)金鐘花黃色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究；蔣本國等[9]和劉會(huì)超等[10]從金鐘花花瓣中提取花色素與花色苷作為一種天然色素廣泛應(yīng)用于食品和化妝品等行業(yè)；有關(guān)金鐘花有效成分[11-12]和生藥學(xué)鑒定方面[13-14]的研究較多，但對(duì)金鐘花中總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性研究鮮少報(bào)道。超聲輔助提取法操作簡單、設(shè)備便宜，具有提取時(shí)間短，溫度易控，提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[15]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)通過超聲輔助提取結(jié)合響應(yīng)面法，考察不同要素對(duì)金鐘花總黃酮得率的影響，對(duì)金鐘花中總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測定金鐘花總黃酮提取液清除DPPH自由基的能力[16]，為金鐘花資源的合理開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器金鐘花采自河南中藥植物園，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室王利麗副教授鑒定為金鐘花(ForsythiaviridissimaLindl.)。將金鐘花鮮品，去除枝葉，陰干打粉，過80目篩，密封保存至干燥器中備用。

蘆丁對(duì)照品購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：Y06J8S 37439；抗壞血酸(Vc)購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，純度≥99.7%，批號(hào)：MBIC105；DPPH(2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基)購自羅恩試劑，批號(hào)：R051727-100；Al(NO3)3、NaNO2、NaOH、無水乙醇均為分析純，購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；超純水實(shí)驗(yàn)室自制。

UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津；Spectra Max iD3型酶標(biāo)儀：美谷分子儀器(上海)有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JP-100A型高速多功能粉碎機(jī)：永康市久品工貿(mào)有限公司；AB135-S十萬分之一分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；FA2004B 萬分之一分析天平：上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；超純水機(jī) ELGA Centra R200：UK；100～1000 μL移液槍：艾本德中國有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備稱取干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品305.26 mg，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，即得0.01 mol·L-1蘆丁對(duì)照品溶液。精密移取此溶液0.65 mL于20 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，混勻，得0.2 g·L-1蘆丁對(duì)照品溶液，冷藏，備用。參考文獻(xiàn)[17]和預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定以510 nm作為檢測波長。精密移取蘆丁對(duì)照品溶液0.00 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL，分別置于10 mL容量瓶中，依次加入60%乙醇至3.50 mL，配成一系列濃度梯度的蘆丁對(duì)照品溶液，即濃度為0.00 g·L-1、0.02 g·L-1、0.03 g·L-1、0.04 g·L-1、0.05 g·L-1、0.06 g·L-1、0.05 g·L-1，分別加入5%NaNO20.5 mL，搖勻，靜置 6 min；加10%Al(NO3)30.5 mL，搖勻，靜置 6 min；最后加4%NaOH 5 mL，搖勻，用水定容，避光放置 12 min，以零管為空白，在510 nm處測定吸光度值，以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。得線性回歸方程為：y=13.114x+0.002 5，r=0.999 8(n=6)，結(jié)果表明蘆丁在濃度0.02～0.07 g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。金鐘花總黃酮含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算。

金鐘花總黃酮得率的計(jì)算公式：

總黃酮得率(mg·g-1)=(C×稀釋倍數(shù)×V)/m

式中：C表示供試品溶液稀釋后在510 nm處測得的吸光度值，代入線性回歸方程得到的黃酮濃度；V表示供試品溶液的體積；m表示樣品質(zhì)量。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)精密稱取0.1 g金鐘花粉末，以蘆丁的得率為指標(biāo)，研究乙醇濃度(40%，60%，70%，80%，90%和100%)、料液比(gmL) (120，140，150，160，170和180)和提取時(shí)間(5 min，15 min，20 min，25 min和30 min)對(duì)金鐘花總黃酮得率的影響。

1.2.3 因素和水平設(shè)計(jì)以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇對(duì)金鐘花總黃酮得率有影響的3個(gè)因素，采用響應(yīng)面法中的Design-Expert 11軟件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。以乙醇濃度(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)為自變量，總黃酮得率為響應(yīng)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平及設(shè)計(jì)見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)表

1.2.4 金鐘花總黃酮成分抗DPPH自由基清除率檢測實(shí)驗(yàn)以清除DPPH自由基能力[18]作為測定金鐘花總黃酮抗氧化能力的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)以Vc、蘆丁為對(duì)照，精密配制0.01 g·L-1DPPH溶液，0.102 1 g·L-1Vc溶液，0.200 0 g·L-1蘆丁對(duì)照品溶液，金鐘花樣品溶液濃度為0.01 g·mL-1；分別將金鐘花總黃酮提取液、蘆丁和Vc稀釋為不同濃度待測液。樣品組(A1)：100 μL供試品溶液+100 μL DPPH 溶液；對(duì)照組(A0)：100 μL供試品溶液+100 μL無水乙醇；空白組(A2)：100 μL無水乙醇+100 μL DPPH溶液。避光放置30 min，在酶標(biāo)儀517 nm波長處測定吸光度值。不同濃度待測液和空白均平行3次，取平均值，計(jì)算DPPH清除率及半數(shù)抑制濃度IC50。注：DPPH和Vc現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。

DPPH清除率=[1-(A1-A0)/A2]×100%

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)金鐘花總黃酮得率的影響由圖2可知，在30 ℃，超聲功率為120 W、料液比 1 g30 mL、提取時(shí)間30 min的條件下，隨著乙醇濃度的增加，在90%乙醇濃度下總黃酮得率較高，根據(jù)相似相溶原理，乙醇濃度越大，溶劑極性越小，黃酮類物質(zhì)極性偏低，此時(shí)原料總黃酮化合物容易析出，因此，選取90%乙醇作為總黃酮提取溶液。

圖2 乙醇濃度對(duì)金鐘花總黃酮得率的影響

2.1.2 料液比對(duì)金鐘花總黃酮得率的影響由圖3可知，在30 ℃，超聲功率120 W，90%乙醇(由2.1.1項(xiàng)可知)，提取時(shí)間30 min的條件下，隨著料液比的不斷增大，總黃酮得率不斷增加，但是增加趨勢逐漸緩慢，由于原料的量一定，隨著乙醇的量不斷增加，總黃酮析出基本穩(wěn)定不再增加。基于此，從節(jié)省溶劑的角度考慮，選擇料液比1 g70 mL較為合適。

圖3 料液比對(duì)金鐘花總黃酮得率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)金鐘花總黃酮得率的影響由圖4可知，在30 ℃、超聲功率120 W、90%乙醇、液料比1 g70 mL(由2.1.2項(xiàng)可知)的條件下，提取時(shí)間20 min總黃酮得率最大，提取時(shí)間超過20 min后總黃酮得率逐漸減小，由于超聲產(chǎn)生的空化作用，加速原料中細(xì)胞壁破裂，總黃酮溶出加快，但雜質(zhì)也隨之溶出，影響總黃酮得率下降。因此選擇提取時(shí)間為20 min比較合適。

圖4 提取時(shí)間對(duì)金鐘花總黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果依照表1實(shí)驗(yàn)因素及水平表，以總黃酮得率為響應(yīng)值，對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析設(shè)計(jì)方案，其設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2所示。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 方差分析將表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Design-Expert 11軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表3所示。對(duì)3個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=-1 366.760 63+32.236 13×A+1.215 81×B-1.441 87×C-0.001 363×AB+0.033 275×AC-0.000 950×BC-0.182 875×A2-0.004 637×B2-0.040 950×C2(式中Y表示金鐘花總黃酮得率)

由表3方差分析可知，F(xiàn)=27.84，P=0.000 1<0.01，表明該模型極顯著，說明本次建模有意義；失擬項(xiàng)F=1.76，P=0.292 9>0.05，不顯著，說明實(shí)驗(yàn)誤差較小。模型系數(shù)R2=0.972 8，校正系數(shù)R2adj=0.937 9，說明模型擬合度較好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用該方程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和預(yù)測；模型變異系數(shù)CV=2.72%，顯示實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可靠，能很好地預(yù)測響應(yīng)面。表3各項(xiàng)方差中，一次項(xiàng)B極顯著(P<0.01)，A、C不顯著(P>0.05)；二次項(xiàng)A2極顯著(P<0.01)，C2顯著(P<0.05)，B2不顯著(P>0.05)；交互項(xiàng)BC、AB(F<0.05)，AC(F>0.05)。通過對(duì)ABC三項(xiàng)的F值比較，影響金鐘花總黃酮得率的各因素先后順序?yàn)椋篈>C>B，即乙醇濃度>提取時(shí)間>液料比。

表3 方差分析

2.2.3 響應(yīng)面和等高線圖參考文獻(xiàn)[19]，通過Design-Expert 11軟件分析得到如下兩因素各個(gè)交互的三維圖(圖5-圖7)。兩因素交互項(xiàng)的三維圖越陡峭，等高線呈橢圓則表明這兩因素的交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。反之，等高線近似圓形，則說明兩要素交互作用不明顯，相互影響較小。圖中三維圖的陡峭順序：AC>AB>BC，這與模型的方差分析相一致。

圖5 乙醇濃度、液料比對(duì)總黃酮提取率影響響應(yīng)面圖

圖6 提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率影響響應(yīng)面圖

圖7 提取時(shí)間、液料比對(duì)總黃酮提取率影響響應(yīng)面圖

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用Design-expert 11軟件分析得到3個(gè)單因素的最佳預(yù)測結(jié)果：乙醇濃度為90%，料液比為1 g：88 mL，超聲時(shí)間為20 min，此時(shí)，響應(yīng)值總黃酮提取率為105.726 mg·g-1。按照預(yù)測的最佳結(jié)論進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)與結(jié)果見表4。

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

平行精密稱取5份金鐘花粉末，按照最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算總黃酮得率，由表4可知，RSD為3.26%，說明重復(fù)性較好，可行性高，參數(shù)可靠穩(wěn)定。從表4可以看出，對(duì)于金鐘花中總黃酮的工藝優(yōu)化，實(shí)測值與真實(shí)值絕對(duì)誤差最小值和最大值為0.10 mg·g-1、8.60 mg·g-1，相對(duì)誤差最小值和最大值分別為0.09%、8.13%，平均絕對(duì)誤差為 4.59 mg·g-1，平均相對(duì)誤差為4.34%。根據(jù)RSD和相對(duì)誤差可以說明，此方法對(duì)金鐘花中總黃酮的提取預(yù)測較為準(zhǔn)確，為后期黃酮的提取開發(fā)研究提供參考。

2.4 金鐘花抗DPPH自由基結(jié)果參考文獻(xiàn)[20]，以提取液濃度為橫坐標(biāo)，金鐘花樣品液、Vc、蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除率(%)為縱坐標(biāo)繪制線性關(guān)系圖(見圖8)，并得出其線性方程計(jì)算IC50。由圖8可知，在一定濃度范圍內(nèi)，樣品液、Vc、蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除率均隨濃度增大呈近似線性關(guān)系。金鐘花：y=35.133x+0.111 7，IC50=11.05 mg·L-1；蘆?。簓=24.861x+0.064 3，IC50=17.53 mg·L-1；Vc：y=110.83x+0.139，IC50=3.26 mg·L-1；清除 DPPH 自由基的大小順序?yàn)閂C>金鐘花總黃酮提取液>蘆丁。說明金鐘花具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖8 自由基清除力比較

3 討論

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，由于金鐘花粉碎粒度過細(xì)(80目)，以無水乙醇為提取溶液，發(fā)現(xiàn)提取1遍和2遍金鐘花總黃酮得率相差很小，因此，為消除誤差，選擇提取1遍，平行2份，取平均值。

本實(shí)驗(yàn)在單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化金鐘花總黃酮提取工藝，確定最佳提取工藝為：乙醇濃度90%，料液比1 g88 mL，超聲時(shí)間20 min，在此條件下金鐘花中總黃酮的得率為101.17 mg·g-1，優(yōu)化得到的工藝合理可行。以蘆丁和Vc作對(duì)照，通過對(duì)清除DPPH自由基能力測定[21]，評(píng)價(jià)金鐘花總黃酮抗氧化活性大小，其中VcIC50=3.26 mg·L-1、金鐘花總黃酮IC50=11.05 mg·L-1和蘆丁IC50=17.53 mg·L-1，清除DPPH自由基能力的大小順序?yàn)閂c>金鐘花總黃酮提取液>蘆丁。金鐘花具有較高的抗氧化活性，且其體外抗氧化能力在一定范圍內(nèi)隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增加，可以作為天然抗氧化劑原料。