熟地黃治療阿爾茨海默病作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析＊

王 斌，吳紅彥，曾慶濤，王雅樂(lè)，黃 海，宋婷婷

（廣東省深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，深圳 羅湖 518000）

熟地黃屬于玄參科植物類，性：甘、微溫；歸肝、腎經(jīng)；功效：補(bǔ)血滋陰，益精填髓?，F(xiàn)代研究揭示，熟地黃主要含有梓醇、地黃苷、地黃素、氨基酸等多種成分，可提高人體的免疫能力，具有抗氧化、提高機(jī)體記憶力、延緩機(jī)體衰老等作用，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理挖掘該藥潛在的藥用價(jià)值[1]。

阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一種神經(jīng)性、退行性、不可逆轉(zhuǎn)性神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，主要以大腦皮質(zhì)層慢性退化為主要病變，以記憶力衰退、情感障礙、抽象思維力等臨床特征為主。目前，美國(guó)已將AD納入無(wú)法預(yù)防、無(wú)法治愈的十大死亡病種之一[2]。據(jù)報(bào)道，全球約4 680萬(wàn)AD患者，中國(guó)AD患者占比已超全球l/4，而我國(guó)老齡化人口每年在遞增，同時(shí)AD患者也在遞增[3]。但AD發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，當(dāng)前研究AD發(fā)病可能與β-淀粉樣蛋白沉積、過(guò)度磷酸化Tau蛋白有不可分割的聯(lián)系，包括神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元死亡、特異性神經(jīng)遞質(zhì)減少和相關(guān)突觸的丟失等相關(guān)的病理過(guò)程有關(guān)聯(lián)[4]。目前治療該病的藥物主要以膽堿酯酶抑制劑為主[5]，如多奈哌齊、茴拉西坦、美金剛等，療效欠佳，不良反應(yīng)頗多。鑒于這種情況，探尋高效低毒、長(zhǎng)期服用，防治AD的新型藥物具有重大意義[6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要集中藥藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)、生物分子信息等為主的研究方法[7]，多層次、多途徑、全方位的揭示熟地黃治療AD的作用機(jī)制[8-10]。繪制藥物-靶點(diǎn)-AD的網(wǎng)絡(luò)分析圖，進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析[11]；揭示了熟地黃治療AD的核心靶點(diǎn)、通路及作用機(jī)制，為更深層次的研究AD提供新的思路、新的方法[12]。

1 材料與方法

1.1 熟地黃活性成分及作用靶點(diǎn)的獲得和篩選

利用TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）計(jì)算機(jī)生物系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“熟地黃”為關(guān)鍵詞，檢索出所有活性成分，依據(jù)ADME參數(shù)，OB≥30、DL≥0.18為篩選指標(biāo)[13]。在梳理相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[14]，篩選出主要有效活性成分。將藥物主要成分上傳到UniProt中找對(duì)應(yīng)名稱，對(duì)名稱進(jìn)行矯正[15]。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

以“AD”為檢索詞，英文名為“Alzheimer Disease”；從OMIM、GeneCards庫(kù)中檢索AD的靶點(diǎn)基因，將兩庫(kù)篩選的靶點(diǎn)全部合并，剔除重復(fù)靶點(diǎn)735個(gè)，取得AD靶點(diǎn)。利用R軟件，將藥物主要活性成分和AD靶點(diǎn)取交集，獲取熟地黃治療AD的靶點(diǎn)，繪制呈韋恩圖。

1.3 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析

將熟地黃的主要活性成分和AD靶點(diǎn)取交集，獲取靶點(diǎn)即為熟地黃治療AD的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)。下載Cytoscape 3.7.1軟件，安裝JAVA軟件，將藥物、靶點(diǎn)和疾病的文本導(dǎo)入軟件中，繪制“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。節(jié)點(diǎn)（Node）代表藥物靶點(diǎn)，邊（Edge）代表成分、靶點(diǎn)、疾病之間的連接。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖呈現(xiàn)藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病之間的關(guān)聯(lián)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖可以深入探究熟地黃治療AD的作用機(jī)制。

1.4 構(gòu)建PPI（Protein-ProteinInteraction）

將藥物和疾病的靶點(diǎn)文本，導(dǎo)入STRING中，將篩選條件設(shè)置為“Multiple Proteins”，物種篩選設(shè)置為“Homo Sapiens”，設(shè)置最低閾值，設(shè)為“medium confidence”，將離散游離的靶點(diǎn)隱藏，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，用txt將文件保存。上傳至Cytoscape 3.7.1 軟件，設(shè)置相關(guān)參數(shù)使連接節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺反映度值大小，邊的粗、細(xì)反映結(jié)合率分值的高低，構(gòu)建PPI圖。

1.5 GO注釋及KEGG通路分析

運(yùn)用Bioconductor生物包，安裝R軟件之后安裝生物包，分析GO注釋信息，KEGG通路分析。通過(guò)以上軟件，將篩選條件設(shè)置為P＜0.05，進(jìn)行通路分析，同時(shí)將通路分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分篩選

通過(guò)TCMSP篩選到藥物有效活性成分共78個(gè)，以O(shè)B≥30和DL≥0.18為篩選條件，篩選出活性成分2個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 熟地黃活性成分表

2.2 熟地黃治療AD的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

從TCMSP中篩選到藥物活性成分共78個(gè)，主要活性成分2個(gè)。運(yùn)用GeneCards、OMIM基因庫(kù)中獲取AD靶點(diǎn)，并合并刪去735個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)。運(yùn)用R軟件，安裝相應(yīng)的“VennDiagram”程序包，獲取交集靶點(diǎn)，同時(shí)繪制韋恩圖（圖1），得到共同靶點(diǎn)10個(gè)，揭示了熟地黃可通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)治療AD。

圖1 藥物治療AD靶點(diǎn)交集圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將藥物與基因靶點(diǎn)上傳至Cytoscape3.7.1中，繪制網(wǎng)絡(luò)作用圖。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖呈現(xiàn)藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病之間的關(guān)聯(lián)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖可以深入探究熟地黃治療AD的作用機(jī)制。見(jiàn)圖2。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 熟地黃治療AD形成的關(guān)鍵靶點(diǎn)

將藥物與疾病的靶點(diǎn)上傳至STRING，輸入藥物治療AD形成的靶點(diǎn)，將篩選條件設(shè)置＞0.9，將游離蛋白予以隱藏，繪制熟地黃對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖3），邊表示靶點(diǎn)作用關(guān)系；邊數(shù)越多，表示該節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。揭示了CHRM1、ADRA1A、CHRM3、PGR、CHRM2、GABRA1等蛋白度值高，表明上述蛋白在疾病中的作用顯著，這些蛋白將成為聯(lián)系其他蛋白的紐帶。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO生物功能及KEGG通路分析

在R軟件中安裝Bioconductor生物包，整合GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析。GO注釋揭示了核心靶點(diǎn)與G蛋白偶聯(lián)胺、乙酰膽堿、神經(jīng)遞質(zhì)、G蛋白偶聯(lián)5-羥色胺、血清素、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)等受體活性有關(guān)聯(lián)，闡釋了熟地黃可通過(guò)調(diào)控的生物細(xì)胞分子、基因、抑制轉(zhuǎn)錄進(jìn)程來(lái)治療AD（圖4）。通過(guò)KEGG通路富集分析，獲取6個(gè)通路圖，通過(guò)設(shè)置篩選條件為q-value＜0.05，p-value＜0.05，KEGG通路分析，獲取1條主要信號(hào)通路，結(jié)果見(jiàn)表2。富集分析圖顯示，主要集中在鈣離子（4個(gè)基因）等信號(hào)通路上（圖5）。

圖5 熟地黃對(duì)AD作用靶點(diǎn)在鈣信號(hào)通路中的作用位置

表2 KEGG 代謝通路

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因生物功能注釋信息

3 討論

AD是癡呆病中常見(jiàn)病、多發(fā)病之一，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中仍亟須解決的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。隨著全球老齡化人口逐年的遞增，AD患者也在同步遞增，給老齡人的生活質(zhì)量和生命周期構(gòu)成了極其嚴(yán)重的威脅，相應(yīng)地也給全球的醫(yī)療資源帶來(lái)了極其嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在治療AD的方劑中熟地黃出現(xiàn)的頻次較多[16]。熟地黃性甘，微溫。歸肝、腎經(jīng)。具有補(bǔ)血滋陰，益精填髓之功。該藥可降低Aβ神經(jīng)毒性起到保護(hù)神經(jīng)的作用[17]。大劑量熟地黃（雌激素）可以抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為熟地黃可代替雌激素作為另一種方法抑制Aβ的神經(jīng)毒性作用[18]。

1987年生理學(xué)家Kha-chaturian[19]最早提出鈣失調(diào)的有關(guān)假說(shuō)，但最初未引起科學(xué)家們的關(guān)注。近些年，科學(xué)家們提供了充分的證據(jù)證明AD早期的病理改變與機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂有關(guān)聯(lián)，該假說(shuō)于2017年被正式提出并對(duì)現(xiàn)階段的諸多疑問(wèn)做了簡(jiǎn)單的概述[20]。而AD的Ca2+假說(shuō)也不是單獨(dú)存在，與其他假說(shuō)有一定關(guān)系，鈣信號(hào)通路的傳導(dǎo)異?？善茐摩?淀粉樣蛋白（Aβ）的毒性、PS神經(jīng)毒性作用和細(xì)胞器功能紊亂等。鈣離子紊亂與鈣信號(hào)通路表達(dá)異常在AD的發(fā)生、發(fā)展及演變過(guò)程中起重要作用[21]。Aβ是經(jīng)γ分泌酶剪切而成的。PS成為了γ分泌酶的催化中心，因此，F(xiàn)AD的變異影響到γ分泌酶的相關(guān)功能[22]。但是，可以通過(guò)調(diào)節(jié)γ分泌酶的相關(guān)活性從而影響Notch的產(chǎn)生，可為治療AD提供新的思路[23]。有研究表明參與腎虛AD的相關(guān)差異基因的表達(dá)主要集中在Ca2+信號(hào)通路以及細(xì)胞黏附分子等信號(hào)通路上，差異基因的相關(guān)表達(dá)主要集中在Ca2+信號(hào)通路上，揭示了Ca2+信號(hào)通路表達(dá)異?？赡苁悄I虛AD潛在的致病機(jī)制。

綜上所述，本次通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理研究，揭示了熟地黃治療AD是通過(guò)“多靶點(diǎn)、多成分、多通路”的調(diào)控發(fā)揮治療作用[24]，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)鈣信號(hào)通路有關(guān)，其機(jī)制可與核心靶點(diǎn)G蛋白偶聯(lián)胺、乙酰膽堿、神經(jīng)遞質(zhì)等受體活性相關(guān)。這為科研實(shí)驗(yàn)療效評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選提供理論依據(jù)[25]。