氣相色譜-質(zhì)譜對天然釀造醬油與配制醬油香氣成分的分析比較

張鳳英，胡繼紅，劉延嶺，李俊儒，張彩，王靜雯

(四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830)

醬油最早是從醬演變而來的，在周朝就有記載[1]，是我國傳承已久的調(diào)料，隨著釀造技術(shù)的發(fā)展和改進，其在全世界范圍內(nèi)都是各國餐桌上必不可少的調(diào)味品[2]。中國人常用的清淡調(diào)味的生抽、老抽；日本人喜歡的鮮魚調(diào)配成的魚露等[3-5]。進入21世紀(jì)，醬油在調(diào)味品中除了起到佐餐的作用，隨著人們生活水平的提高，逐漸地加入了某些強化營養(yǎng)物質(zhì)，形成了很多特種醬油如兒童醬油、鐵強化醬油等[6，7]。在人們烹飪過程中，使得食材香味濃郁，滿足人們的飲食需要，天然發(fā)酵的釀制醬油具有高鹽稀態(tài)、低鹽態(tài)、常溫半固態(tài)醬油生產(chǎn)種類，醬油按照國標(biāo)可以分為多個等級，氨基酸態(tài)氮含量最低都要超過0.4 g/dL[8]。在生產(chǎn)過程中會因發(fā)酵條件產(chǎn)生一些生物胺類物質(zhì)如酪胺(對羥基苯乙胺)、組胺(不新鮮的魚含量最多)等[9]，這兩種物質(zhì)都有刺激性，導(dǎo)致人體過敏，散發(fā)不悅的氣味，大量使用會導(dǎo)致人體中毒，會對人體健康造成不利的影響，但都可以通過微生物強化改善醬油中這些生物胺類物質(zhì)的含量[10]，減少不良氣味，提高醬油風(fēng)味。配制醬油在制作過程中，將釀造醬油進一步稀釋，其中的營養(yǎng)價值較低。

根據(jù) GB/T 18186—2000的定義，釀造醬油是由黃豆為主要原料，輔以少量小麥粉、麩皮或稻殼等其他原料經(jīng)過米曲霉制曲、制醅、粗鹽封池，經(jīng)過微生物后期發(fā)酵，淋油產(chǎn)生具有特殊鮮、咸口感和特殊風(fēng)味的醬油。SB 10336—2000中定義的配制醬油是指：產(chǎn)品中以釀造醬油為主要成分，向其中加入酸水解植物蛋白漿、再加入少量食品添加劑配制而成的液體調(diào)味品，其中以全氮含量為標(biāo)準(zhǔn)，釀造醬油的含量不得少于50%。配制醬油的口感和香氣效果無法與釀造醬油相比，部分商家為謀取私利，將配制醬油改成釀造醬油標(biāo)簽，有些商家盡管標(biāo)注配制醬油，但是質(zhì)量參差不齊，找到對兩種醬油進行鑒別的最佳方式指標(biāo)是目前研究者努力的方向。《預(yù)包裝食品通則》中對于產(chǎn)品標(biāo)簽有著嚴(yán)格的要求，如：必須注明使用轉(zhuǎn)基因仍然沒有比較明確的指標(biāo)，有通過醬油感官狀態(tài)、氨基酸態(tài)氮、氯丙醇和乙酰丙酸等物質(zhì)的含量來區(qū)分釀造醬油和配制醬油的[11-14]。但不同制作工藝、手段都會導(dǎo)致這些物質(zhì)含量出現(xiàn)浮動甚至可以通過化學(xué)手段降低或提高這些指標(biāo)的含量，因此現(xiàn)有鑒別方法無法有效識別。本試驗基于此，欲通過氣相色譜-質(zhì)譜法對兩種類型的醬油進行分析，探討香氣成分，比較醬油質(zhì)量，以期得到較準(zhǔn)確的指標(biāo)來判定醬油質(zhì)量。

1 氣相色譜-質(zhì)譜試驗

準(zhǔn)備無水乙醚及無水硫酸鈉等物質(zhì)，將不同自然釀造工藝的醬油及配制醬油樣品(避免污染)，利用GC-MS儀檢測不同樣品中的揮發(fā)性組分。

樣品處理：在分液漏斗中加入150 mL醬油標(biāo)本及等量的去離子水，再向其中添加100 mL重蒸無水乙醚，經(jīng)過不少于2 h的連續(xù)萃取，乙醚相中會與醬油中大部分揮發(fā)性小分子物質(zhì)互溶。萃取后的溶劑使用無水硫酸鈉進行干燥處理后，在冰箱中冷凍1 d，將溶液進行過濾除去顆粒雜質(zhì)，在40 ℃環(huán)境中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶液中的乙醚溶劑去除，最終獲取1 mL顏色略黃的液體。儀器設(shè)置：選用彈性石英毛細管色譜柱內(nèi)徑在0.25 mm，載氣流速設(shè)定為0.6 mL/min，保持色譜柱的初始溫度在40 ℃以上，初始時間為5 min，保持5 ℃/min的速度升溫，最高溫度設(shè)定在220 ℃，最高溫度將持續(xù)15 min，實驗過程無需分流處理，進樣口溫度保持在250 ℃，進樣量為1 μL。質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)定：離子源及電子能量保持在75 eV，發(fā)射電流為220 μA，設(shè)定電子倍增器壓力值為360 V，離子源溫度設(shè)定在210 ℃，對30～450 u范圍進行質(zhì)量檢測。

2 試驗結(jié)果

使用氣相色譜-質(zhì)譜儀對不同類型的自然釀造醬油和配制醬油中的揮發(fā)性成分進行測定后，對相關(guān)指標(biāo)進行聚類分析統(tǒng)計，總體上看來，不同工藝釀制的醬油及配制醬油中具有不同的香氣成分，但釀制醬油香氣成分種類、單體物質(zhì)更多；由圖1的質(zhì)譜圖可知，3種自然釀造醬油化學(xué)物質(zhì)中酚類物質(zhì)，醇類物質(zhì)、酸類物質(zhì)含量較多，可以判定這些物質(zhì)為自然釀造醬油中的主要香氣成分，而揮發(fā)性組分中醇類含量最高。

圖1 不同類型醬油揮發(fā)性物質(zhì)比較Fig.1 Comparison of volatile compounds in different types of soy sauce

由圖1可知，通過將不同揮發(fā)性組分圖譜進行對照，以及通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對儀器進行校正，RSD(%)水平都在可靠的線性范圍內(nèi)，說明本次試驗結(jié)果準(zhǔn)確。鄧岳等使用氣質(zhì)聯(lián)用法對傳統(tǒng)工藝的自然釀造醬油(樣品選自非物質(zhì)文化遺產(chǎn)——先市醬油)中的風(fēng)味成分進行了測定，共檢測出接近70種揮發(fā)性組分物質(zhì)，包括醇、酸、酮、酯以及雜環(huán)類共計十大類化合物，對比本文的研究結(jié)果，先市醬油的酸類物質(zhì)含量更高，醇類次之[15]。Zhao M M等采用氣相色譜-質(zhì)譜儀/嗅覺測定儀(GC-M/O)結(jié)合頂空-固相微萃取法(HS-SPME)對醬油的香氣成分進行了分析,共分離了109種揮發(fā)性化合物，并用GC-MS進行了鑒定[16]。其中醇類含量最高(75.82%)，其次是醛、酯、酸和呋喃。其研究結(jié)果與本試驗的結(jié)果比較符合，可以說明不同類型的自然釀造醬油可能和地域有關(guān)。試驗將測定結(jié)果中主要的14種含量最多的物質(zhì)進行羅列，見表1。

表1 不同加工工藝醬油揮發(fā)性香氣成分氣相色譜-質(zhì)譜儀器分析結(jié)果Table 1 Analytical results of volatile aroma components of soy sauce by gas chromatography-mass spectrometry with different processing process

Feng Y等建立了一種以同時蒸餾萃取(SDE)和氣相色譜法相結(jié)合的方法——質(zhì)譜/嗅覺(GC-M/O)測定來分析醬油中的揮發(fā)性特征指紋圖譜，其使用的萃取操作條件如下：100 mL醬油加100 mL飽和鹽水、50 mL二氯甲烷萃取，確定了88種揮發(fā)性化合物。其中，由GC-O檢測到26種芳香族活性化合物，包括3-(甲基硫)丙醛、2-甲氧基4-乙烯基酚、2-甲氧基酚、2-甲基丁烯酸、2,3-丁二酮、苯乙醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基-1-丁醇2-甲基-1-丁醇(在高鹽液態(tài)發(fā)酵醬油和低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油中均存在較高濃度[17]。這說明不同類型的自然釀造醬油生產(chǎn)工藝也會導(dǎo)致?lián)]發(fā)性組分出現(xiàn)明顯差異。

圖2 不同類型醬油的主要揮發(fā)性化合物圖譜Fig.2 Main volatile compounds graphs of different types of soy sauce

通過對不同種類型的醬油的質(zhì)譜儀進行測定，對其中的醇、酚、醛、酮等化合物進行含量比較，見圖2。釀造型醬油中醇含量最高，而配制醬油中由于使用酸水解蛋白會產(chǎn)生氯丙醇，因此不同品牌的配制醬油中都檢測出少量的氯丙醇類物質(zhì)(1,3-二氯丙二醇、3-一氯丙二醇)[18]。Crews C等設(shè)計并測試了一種新的自動頂空 GC-MS技術(shù)，用于分析醬油和類似產(chǎn)品中的1,3-二氯丙二醇(1,3-dcp)[19]。該方法結(jié)合了低溫誘捕技術(shù)在40種醬油中的10個中檢測到1,3-dcp，所有的都含有3-一氯丙二醇，這說明配制醬油中一個重要的指標(biāo)體現(xiàn)在氯丙醇相關(guān)物質(zhì)。Yanfang Z等使用高效液相色譜法對不同類型的醬油中游離氨基酸和揮發(fā)性化合物進行了分析，其檢測出超過80種揮發(fā)性化合物，除了同本試驗以及前面介紹的成果中的醇、酸、酯、醛、酮、酚、雜環(huán)化合物，還檢測到痕量的炔烴和苯的同系物[20]。姬曉悅使用氣質(zhì)聯(lián)用儀測定了4種不同品牌和類型的醬油(包括2種生抽和自然釀造醬油)，其共同特征是醇類、酯類和酚類物質(zhì)為主要的揮發(fā)性組分，其研究結(jié)論同本試驗結(jié)果相近[21]，本文使用氣質(zhì)聯(lián)用儀測定不同類型醬油中的主要物質(zhì)比例見表2。

表2 不同類型醬油香氣化合物成分含量對比Table 2 Comparison of aromatic chemical composition content of different types of soy sauce

2.1 醇類化合物含量對比

醇類化合物香氣成分，與酵母菌發(fā)酵作用存在主要的關(guān)系，醇類物質(zhì)可經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)后，轉(zhuǎn)換為酯類物質(zhì)，使人感受到濃郁香氣，本試驗測得的醇類物質(zhì)總計檢測11類，配制醬油只是釀造醬油的1/3，醇類化合物含量在化合物中占比最高，可散發(fā)出酒香。2-甲基丙醇及苯乙醇有花草及水果的香味，高獻禮測定高鹽稀態(tài)自然發(fā)酵醬油中確認了這兩種化合物為主要的醇類揮發(fā)性物質(zhì)[22]。甲硫基丙醇在釀造醬油中含量不足，但是在醬油中含有較強的揮發(fā)性，即使?jié)舛容^低，也能夠散發(fā)較為強烈的肉湯或蘑菇(1-辛烯-3-醇)香氣，這些化合物的存在使醬油具有特色香氣。配制醬油中醇類物質(zhì)含量不高，但與其中樟腦氣味的丁醇的衍生物具有一定聯(lián)系。釀造醬油在制作過程中香氣濃郁，配制醬油將釀造醬油作為基礎(chǔ)，成分勾兌后，較為不均，醇類物質(zhì)香氣不自然。

2.2 酚類化合物含量對比

酚類化合物可散發(fā)出釀造型醬油的典型香氣，且鼻部細胞對酚類物質(zhì)香氣具有較強的敏感性，豐富的酚類物質(zhì)可以使人感覺到醬油香氣更加濃郁。4-乙基愈創(chuàng)木酚是豆醬、醬油中含量最多、最典型的揮發(fā)性組分，是醬油典型的標(biāo)志性物質(zhì)，在烹飪或者調(diào)味過程中，醬油受熱揮發(fā)中會散發(fā)出一種獨特的典型的咸、醬香氣味 ，使得菜肴具有獨特的口感，酚類是微生物通過復(fù)雜的作用機理，通過自然發(fā)酵方式形成的化合物，對釀造過程中加鹽量進行調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)其在常溫半固態(tài)醬油中占據(jù)較高的比例[23]，本試驗檢測的配制醬油中的酚類含量占比遠低于3種釀造醬油。

2.3 醛酮化合物含量對比

醛、酮類化合物含量最多是在醬油發(fā)酵初期，高純度、具有刺激性氣味，而含有少量這類物質(zhì)的醬油，在烹飪過程中具有調(diào)和作用。酮自身并非風(fēng)味物質(zhì)，但含量較少的羥基化合物會散發(fā)果味香氣，或者表現(xiàn)為焦糖香氣。熊芳媛等使用GC-MS測定醬油中香氣成分發(fā)現(xiàn)，對老抽醬油香氣貢獻最大的風(fēng)味物質(zhì)是3,8-二羥基-2-甲基色酮，本試驗中測定的釀造醬油中的主體香味為醇類以及典型的4-乙基-2-甲氧基苯酚[24]。姬曉悅測定的4種市售醬油中，醛類物質(zhì)的比例同本試驗結(jié)果相差不大，說明自然釀造的醬油揮發(fā)性物質(zhì)比例相同。本試驗測定的釀造醬油中檢測出配制醬油中所不具備的香草醛，其在香草及土豆皮植物中存在，是香草豆散發(fā)香氣的主體成分。

2.4 酸類化合物含量對比

酸類化合物在醬油發(fā)酵中占據(jù)重要地位，是耐鹽乳酸菌主要的代謝產(chǎn)物[25]，是醬油風(fēng)味中的主要物質(zhì)，與其他物質(zhì)反應(yīng)后產(chǎn)生乙酸乙酯化合物，醬油經(jīng)過后期的持續(xù)發(fā)酵，風(fēng)味進一步提升。3種不同類型的自然釀造醬油的酸類物質(zhì)含量具有明顯差異性，配制醬油中酸類物質(zhì)含量最低。

2.5 酯類化合物含量對比

自然釀造醬油中，曲霉及酵母菌在其中發(fā)揮著重要作用，氨基酸在經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)后，與其他化合物進一步重合，組成新型有機物，主要類型為乙酸乙酯。利用氣相色譜-質(zhì)譜儀檢測釀造醬油，結(jié)果顯示有數(shù)量可觀的酯類物質(zhì)，配制醬油經(jīng)過檢測后，其中并未發(fā)現(xiàn)亞油酸乙酯及十六酸乙酯等化合物。此類物質(zhì)的產(chǎn)生與豆類物質(zhì)經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生的物質(zhì)存在聯(lián)系，發(fā)酵后會產(chǎn)生一定的果味香氣，保障醬油釀造后香氣更加濃郁，具有協(xié)調(diào)感。

2.6 雜環(huán)類化合物含量對比

利用氣相色譜-質(zhì)譜儀檢測不同生產(chǎn)工藝的醬油后，在其中觀察到多種雜環(huán)類化合物，呋喃類化合物及糠醛在微生物作用下會產(chǎn)生一定的化學(xué)反應(yīng)，使反應(yīng)物產(chǎn)生谷物香氣及咖啡香氣，雜環(huán)類化合物的揮發(fā)性交叉，而糠醇是釀造醬油中的特殊香氣成分，吡嗪化合物及二甲基吡咯化合物等成為醬油生產(chǎn)中的特殊物質(zhì)，吡嗪化合物在生產(chǎn)過程中呈現(xiàn)烤香氣味，配制醬油中雖然也有這些氣味，但與焦糖色素存在聯(lián)系。釀造醬油及配制醬油區(qū)分過程中，雜環(huán)類物質(zhì)的檢測較為重要。

3 結(jié)論

釀造醬油與配制醬油的鑒別是我國食品安全檢測的重點方向，醬油是我國的傳統(tǒng)調(diào)味品，在日常生活中具有重要地位，醬油不僅能夠改善食物的風(fēng)味和口感，而且有利于滿足機體鉀鈉平衡。通過本試驗對不同類型醬油的測定，結(jié)果表明：生產(chǎn)工藝不同，釀造醬油中主要揮發(fā)性組分物質(zhì)含量不同，但因自然釀造的成品醬油發(fā)酵周期長導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)含量均高于配制醬油中的同類化合物含量，酸類物質(zhì)作為釀造醬油中的重要組分，是醬油香氣中的重要物質(zhì)，釀造醬油中酸類化合物含量明顯高于配制醬油酸類物質(zhì)含量。釀造醬油中含有特殊香氣成分的乙醇及甲硫酸基丙醇、苯乙醇等，這些化學(xué)成分在配制醬油中無法被檢測出，說明其中并未含有這些物質(zhì)。本試驗測定的不同地域和品牌醬油中的香氣成分：低鹽固態(tài)釀造醬油中含有雙鍵的烯醇類物質(zhì)等超過5種是其獨有的；而高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中醇類物質(zhì)及酯類物質(zhì)含量較高，酚類及醛酮類、酸類、雜環(huán)類物質(zhì)相對較少，有7種物質(zhì)是高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油所特有的。釀造醬油中含有的痕量或者獨有的香氣揮發(fā)性物質(zhì)在配制醬油中相對較少甚至沒有。配制醬油中含有大量的烤香味吡嗪化合物，與向其中增加一定量焦糖色素原料存在聯(lián)系。經(jīng)過試驗測定，初步明確釀造醬油與配制醬油風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)含量之間的關(guān)系，以及不同生產(chǎn)工藝，有利于鑒別不同類型醬油。