昆明市祿勸縣櫻桃癌腫病病害調(diào)查及病原鑒定

楊康，伍建榕，王瑋瑋

1.貴州林業(yè)勘察設計有限公司，貴州貴陽 550000；

2.西南林業(yè)大學，云南昆明 650224

1 研究區(qū)概況

昆明市祿勸縣位于昆明市北部，距昆明市區(qū)90km，年平均氣溫15.6℃。境內(nèi)氣候垂直分布，最高海拔3000m，最低海拔746m。東西寬69km，南北長105km，總面積4249km2。其中，山區(qū)面積占全縣總面積的98.4%。屬亞熱帶氣候，日照充足，四季如春，氣候宜人，干濕季分明。祿勸縣的中國櫻桃成熟時間一般在4 月上中旬，要比北方產(chǎn)區(qū)提前1～2 個月上市，基本上在雨季到來前就已成熟，不會因為降雨導致裂果或大量落果。因此，適合發(fā)展櫻桃種植業(yè)，種植出來的櫻桃在市場上深受廣大消費群體的喜愛，具有很大的競爭力[1]。

2 研究方法

2.1 病害的調(diào)查

該研究的樣本主要在櫻桃癌腫病病害發(fā)生明顯的樹木枝干部分上進行采集。病害標本采集后，置于黑色塑料袋內(nèi)密封保存，同時記載病害采集日期和地點、采集人姓名。將采集后的標本統(tǒng)一帶回實驗室，并放置于4℃的冰箱內(nèi)保存，以便于接下來對病原菌進行觀察、分離、純化以及病原菌鑒定等步驟。此次調(diào)查采用踏查的方法，于2020 年冬季對病害發(fā)生較為嚴重的昆明市祿勸縣做進一步的了解。采取分級調(diào)查的方式調(diào)查病害的發(fā)生情況，計算發(fā)病率、病情指數(shù)[2]。

2.2 病原菌的鑒定

通過對采集的病害標本進行形態(tài)學觀察、形態(tài)學鑒定、病原菌的分離培養(yǎng)和純化[3]、革蘭氏染色及油鏡鏡檢[4]、病原菌的鑒定等步驟確定病原菌種類。

2.2.1 病害癥狀的觀察

觀察病害時（見圖1），需要注意病害的形狀、色澤等。此外，借助放大鏡和解剖顯微鏡進行病害病癥的觀察，最好對病害癥狀拍攝照片并對其加注簡明而準確的描述。

圖1 野外采集的病害枝干Fig.1 Diseased Branches Collected in the Field Identification

2.2.2 形態(tài)學鑒定

（1）徒手切片：挑選病癥明顯的標本進行切片，好的切片要薄且透明、要有完整的組織結(jié)構(gòu)。

（2）鏡檢：將切好的切片置于載玻片上，滴一滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，先用低倍鏡觀察，看到切片組織后調(diào)到高倍鏡觀察（見圖2）。

圖2 形態(tài)學鑒定Fig.2 Morphological

（3）鑒定：結(jié)合病癥病狀，宏觀與微觀的形態(tài)特征，查閱相關(guān)資料進行分析。

2.2.3 病原菌的分離培養(yǎng)和純化

（1）病原菌的分離：采用分離法對病菌進行分離培養(yǎng)（見圖3），將分離出的病菌放置于LB 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。

圖3 分離培養(yǎng)的菌落Fig.3 Isolated and Cultured Colonies Colonies

（2）病原菌的純化和保存：在37℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3d～5d 后待到培養(yǎng)基長出明顯的單個菌落，在無菌條件下挑選出明顯的單個菌落于LB 平板上劃線進行純化培養(yǎng)（見圖4）。制作試管斜面（見圖5）：配置好的LB 培養(yǎng)液注入試管，約每支管的1/3體積，在滅菌后斜放于超凈工作臺中。在無菌條件下將LB 平板菌株的純菌落中挑取菌落接入試管斜面中劃線保存。實驗完畢后將純化的平板和斜面置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長滿試管的斜面后置于4℃冰箱凍存。

圖4 純化培養(yǎng)的菌落Fig.4 Purified Cultured

圖5 試管斜面Fig.5 In Vitro Cant

2.2.4 革蘭氏染色及油鏡鏡檢

選擇生長試管斜面進行革蘭氏染色反應并在100 倍油鏡下鏡檢（見圖6、圖7）。

圖6 革蘭氏染色反應Fig.6 Gram Staining eaction

圖7 100 倍油鏡下觀察到的染色菌體Fig.7 Chromosome Seen under 100x Oil Lens

2.2.5 病原菌的鑒定

該研究主要以分子鑒定為主。其步驟按照細菌基因組DNA 試劑盒中文說明進行：

（1）將純化培養(yǎng)出來的菌種取1ml～5ml 放入離心管中，向菌體沉淀中加入200μl 緩沖液GA，將離心管放在渦漩儀上振蕩至菌體徹底懸浮。

（2）向管中加入20μl Proteinase K 溶液，混勻。

（3）向上述離心管中加入220μl 的緩沖液GB，振蕩15s，70℃放置10min，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

（4）向上述離心管中加入220μl 的無水乙醇，充分振蕩15s 以混勻?qū)嶒灢牧希舸藭r出現(xiàn)絮狀沉淀，放入離心機中離心30s 以去除管壁內(nèi)的水珠。

（5）將上述所得溶液和絮狀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（～13400×g）離心1min，倒掉廢液，將吸附柱CB3 放入收集管中。

（6）向吸附柱CB3 中加入500μl 緩沖液GD（使用前先檢查是否加入無水乙醇），12000rpm（～13400×g）離心1min，然后倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管。

（7）向吸附柱CB3 中加入600μl 漂洗液PW（使用前先檢查是否加入無水乙醇），12000rpm（～13400×g）離心1min，倒掉廢液，將吸附柱CB3 放入收集管中。

（8）重復操作步驟7。

（9）將吸附柱CB3 放回收集管中，12000rpm（～13400×g）離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3 置于室溫下放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

（10）將吸附柱CB3 轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附模的中間部位懸空滴加50ul 洗脫緩沖液TE，室溫擱置2min～5min，12000rpm（～13400×g）離心2min，將液體收集到離心管中。

注意：洗脫緩沖液體積不應少于50μl，體積過小影響回收率，洗脫液的pH 值對于洗脫效率有很大的影響。若用ddH2O 做洗脫效液應保證其PH 值在7.0～8.5 范圍內(nèi)，pH 值低于7.0 會降低洗脫效率；且DNA 產(chǎn)物應保存在-20℃，以防止DNA 降解。為增加基因組DNA 的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3 中，室溫放置2min，12000rpm（×g）離心2min。

（11）進行PCR 反應[5]，反應體系見表1。

表1 PCR 擴增反應體系Tab.1 PCR Amplification Reaction System

PCR 擴增條件：

（12）電泳：首端BM 2000 DNA Marker，后面樣本，點樣孔朝向負極，各4μl，90v，電流最大，拍照（凝膠：體積25ml，濃度1%（瓊脂糖0.25g，TAE 緩沖液25ml（為防止揮發(fā)加30ml）TAE 緩沖液：1000ml/50倍濃度）（見圖8）。

圖8 PCR 跑膠Fig.8 PCR Run Glue

（13）測序。

（14）比對：測序DNA 序列用序列在NCBI 上進行BLAST 比對。

3 結(jié)果與分析

3.1 病害調(diào)查情況

3.1.1 昆明市祿勸縣櫻桃癌腫病調(diào)查情況昆明市祿勸縣櫻桃樣地調(diào)查情況

表2 櫻桃癌腫病樣地調(diào)查情況Tab.2 Sample Site Investigation of Cherry Wart Disease

發(fā)病率=68.75%

從以上數(shù)據(jù)了解到，調(diào)查的昆明市祿勸縣櫻桃癌腫病發(fā)病率和病情指數(shù)分別為68.75%、28.13%，可以得出結(jié)論，調(diào)查的樣地發(fā)病率和病情指數(shù)都很高。

3.1.2 昆明市祿勸縣櫻桃癌腫病風險評估

通過建立指標遞階層次表，分層構(gòu)造指標判斷矩陣，比較各層組內(nèi)的指標重要性，對各指標數(shù)值進行賦值，選出15 個指標作為林業(yè)有害生物風險評價指標，對櫻桃癌腫病風險評估得出每個指標的權(quán)重如表3。

表3 櫻桃癌腫病風險分析指標體系[6]Tab.3 Index System of Cherry Wart Disease Risk Analysis

目標層準則層Pij有害生物風險綜合評價值R受害寄主經(jīng)濟重要性P4=2.5指標層Pij受害寄主的類P41=0.05受害寄主的分布面積或產(chǎn)量P42=2.0受害寄主的特殊經(jīng)濟價值P43=2.5危險性管理難度P5=2.5333檢疫識別的難度P51=2.0除害處理的難度P52=2.8根除的難度P53=2.8權(quán)重等權(quán)等權(quán)

3.1.3 風險評估指標體系量化計算公式及風險分析等級劃分標準

表4 風險分析指標體系采用的量化計算公式Tab.4 Table of Quantitative Calculation Formulas Adopted by Risk Analysis Index System

表5 櫻桃癌腫病風險分析等級劃分標準Tab.5 Classification Standard for Risk Analysis of Cherry Wart Disease

通過計算得到風險綜合評價值R=2.4367，屬于高度危險程度，需要引起相關(guān)部門的重視，并作出相應的預防治療措施。

3.2 形態(tài)鑒定結(jié)果

觀察病害組織外觀時發(fā)現(xiàn)病癥處粗糙并龜裂，可輕輕將瘤狀物掰掉，瘤狀物呈現(xiàn)環(huán)狀出現(xiàn)在枝干部病，并且病部病癥無霉狀物，結(jié)合病害組織宏觀和微觀特征說明此種病害屬于細菌性畸形病。

3.3 分離培養(yǎng)實驗及植物表面滅菌效果

根據(jù)觀察表6，了解到處理1min 后菌落生長最好，單個菌落數(shù)量最多。2min～3min 菌落生長數(shù)量較多，4min～5min 幾乎無菌落生長。說明處理1min、2min 瘤體消毒效果好的同時又不至于殺死需要的病原菌，在分離病原菌的時候選擇處理1min 和2min 瘤體是最好的，能最大程度下保留想要獲得的病原菌。

表6 分離培養(yǎng)的實驗菌落生長個數(shù)情況Tab.6 Table of Growth Number of Isolated and Cultured Experimental Colonies

3.4 革蘭氏染色和油鏡鏡檢結(jié)果

對菌體進行革蘭氏染色反應后在100 倍油鏡下用光學顯微鏡觀察到菌體呈現(xiàn)為紅色，說明此種病原菌為革蘭氏陰性菌。

3.5 DNA 送檢以及序列比對的結(jié)果

1#送檢后獲得的堿基序列：

1#多重序列對比：經(jīng)過測序公司對送檢樣進行測序，得到的序列在NCBI 上進行BLAST 比對得到結(jié)果如下。

進一步分析致病菌的16S rDNA 序列結(jié)果表明，該菌株與Agrobacterium tumefaciens （登錄號為KP050793.1）同源性最高，并且與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的Agrobacterium tumefaciens（登錄號為KP050793.1）的相似度達到了99%。綜合兩者的結(jié)果進行分析，初步判斷引起祿勸櫻桃癌腫病的病原菌為Agrobacterium tumefaciens。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

綜上所述，引起昆明市祿勸縣櫻桃癌腫病的病原菌是薄壁菌門瘤菌科農(nóng)桿菌屬及致瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）。屬于好氧菌，菌體桿狀，大小1μm～3μm×0.4μm～0.8μm，鞭毛周生，有1～4 根鞭毛，革蘭氏染色陰性，無芽孢，能形成莢膜。只有攜帶Ti 質(zhì)粒的菌株才具有致病性，Ti 質(zhì)粒同時還控制對細菌素的抗感性和寄主范圍。Ti 質(zhì)?？梢杂脽崽幚砘蚱渌蛩貋G失，使細菌失去致病力。

4.2 討論

4.2.1 侵染循環(huán)

據(jù)昆明市祿勸縣癌腫病病害年年發(fā)病并且有增長的趨勢及病原菌的生活習性可知，此病原菌存在侵染循環(huán)（包括初次侵染、再次侵染、傳播媒介、越冬場所）。

（1）初次侵染：病菌主要通過傷口侵入，隨后氣溫的升高和降雨的增多，到6～8 月份開始大面積的發(fā)病。

（2）再次侵染：在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度18℃～22℃時，尤其是在降水偏多的6～8 月份，適合癌瘤的形成和發(fā)展，是病害爆發(fā)的高峰時期。

（3）傳播媒介：癌腫病病菌通過風、雨水、病殘體、蟲類、嫁接工具、作業(yè)農(nóng)具等進行傳播，帶病種苗和種條調(diào)運帶菌是遠距離傳播的重要途徑。

（4）越冬場所：病菌主要在病瘤內(nèi)或土壤和土壤中的寄主殘體內(nèi)越冬。

4.2.2 發(fā)病規(guī)律春季是櫻桃采摘的季節(jié)，采摘過程中造成莖桿的損傷，易導致病菌侵入，而春季病害發(fā)生較少，沒有引起種植戶的重視，一般都沒有進行病害防治，為夏季病害的大爆發(fā)提供了條件。夏季6 月～8 月溫暖潮濕，特別是昆蟲活動頻繁易造成此病大爆發(fā)，病害的傳播速度最快，是一年當中發(fā)病率最高的時期，是病害防治過程中的重點防治時期。秋季櫻桃生長緩慢并趨于停止，抗病能力較強，病害的發(fā)生同樣較少。冬季病原菌在腫瘤內(nèi)越冬，是來年病害發(fā)生的侵染源，然而種植戶冬季并沒有及時進行病株、病葉的清理，是導致來年發(fā)病更嚴重的主要原因。

4.3 綜合防治

通過對櫻桃癌腫病病害的調(diào)查、侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律的研究得出綜合防治方案。在防治時，使用綜合防治方案進行科學的、合理的防治，處理好病害系統(tǒng)中各種因數(shù)之間的相互關(guān)系，櫻桃癌腫病的防治要遵照預防為主，綜合防治為輔的準則：主要包括農(nóng)業(yè)技術(shù)措施、物理機械防治和化學藥劑防治。