miR-221與宮頸鱗狀細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所生物治療室(110001)

蔣 濤△ 李 妍 孟凡東 隋承光

【提 要】 目的 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探討宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者血清中miR-221聯(lián)合CEA、CD109及SCCA檢測在臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 UALCAN數(shù)據(jù)庫獲取miR-221和CD109在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系；采集患者外周血，提取血清，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析血清中miR-221和CD109的表達(dá)；免疫化學(xué)發(fā)光法檢測血清中CEA和SCCA的表達(dá)水平；logistic多因素回歸分析miR-221、CEA、CD109及SCCA的診斷價(jià)值；Pearson相關(guān)性分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性；分析單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度。結(jié)果 miR-221、CEA、CD109及SCCA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者中均呈高表達(dá)狀態(tài)(P<0.05)；logistic多因素回歸分析顯示miR-221、CEA、CD109及SCCA均對宮頸鱗狀細(xì)胞癌具有診斷價(jià)值(P<0.05)；Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，各指標(biāo)之間均具有顯著的相關(guān)性(P<0.01)；聯(lián)合檢測的靈敏度均高于各項(xiàng)指標(biāo)的單項(xiàng)檢測結(jié)果，準(zhǔn)確度高于miR-221和CD109的單獨(dú)檢測結(jié)果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 聯(lián)合CEA和SCCA檢測能夠更有效提高宮頸鱗狀細(xì)胞癌的早期檢出率，在臨床診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

宮頸鱗狀細(xì)胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一[1]，其死亡原因主要是腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。早期診斷對于宮頸癌的治療及預(yù)后改善極為重要。腫瘤標(biāo)志物在正常人的體內(nèi)含量極低，但在腫瘤患者體內(nèi)的含量卻較高，因其檢測操作簡便，易于被患者接受，廣泛應(yīng)用于腫瘤的篩查和診斷中。但單個(gè)腫瘤標(biāo)志物對于疾病的診斷往往靈敏度較低，為提高早期診斷率和治療效果，臨床通常聯(lián)合檢測腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平預(yù)測癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力，為腫瘤患者的早期治療提供有利時(shí)機(jī)。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細(xì)胞內(nèi)具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。miRNA可通過在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控促癌或抑癌相關(guān)基因的表達(dá)而廣泛參與惡性腫瘤進(jìn)程[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-221可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，尤其在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)是具有相對較高特異性的一種抗原標(biāo)志物，是診斷宮頸鱗癌的首選腫瘤標(biāo)志物。有研究表明，檢測SCCA可以用于監(jiān)測宮頸癌患者的病情改變情況，也是制定輔助治療方案的參考依據(jù)[5]。miR-221聯(lián)合多種抗原標(biāo)志物檢測宮頸鱗狀細(xì)胞癌，將有效提高患者的早期診斷率。

材料與方法

1.一般資料

選取2017年1月至2020年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科和婦科CSCC患者70例作為患者組。70例宮頸息肉患者作為疾病對照組。篩選70例健康志愿者作為健康對照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理及影像學(xué)診斷確診的患者；年齡大于18歲；健康對照組人群均為經(jīng)過血液及超聲等相關(guān)檢查符合健康人群標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有心理及精神疾病的患者；患有心腦血管疾病的患者；患有免疫系統(tǒng)疾病者；合并其他腫瘤患者；接受過放化療的患者；妊娠及哺乳期女性。

2.臨床數(shù)據(jù)及標(biāo)本的采集方法

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(http：//ualcan.path.uab.edu/)獲得miR-221和CD109在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者中的表達(dá)數(shù)據(jù)及生存分析圖譜。所有研究對象均采集清晨空腹靜脈血5ml，離心，3000 r/min，留取上層血清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.檢測方法

應(yīng)用羅氏全自動(dòng)分析儀，采用免疫化學(xué)發(fā)光法檢測所有研究對象血清中CEA和SCCA的表達(dá)水平。正常參考值：CEA<5μl/L；SCCA<2.5μg/L。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清中miR-221和CD109的相對表達(dá)水平。miR-221的引物序列上游：5′-GGACCACCGCTCATCGCTAA-3′，下游：5′-GTTACTATATGCCAAGCCCTAG-3′；CD109得引物序列上游：5′-ACATGATCTCAATCATGTGG-3′，下游：5′-ACACTGAAGCATCTTGGG-3′；內(nèi)參U6的引物序列上游：5′-CTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游：5′-AAAATATGGAACGCTTCACG-3′。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-221、CD109的相對表達(dá)量。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。樣本不滿足正態(tài)性檢驗(yàn)，選擇Mann-Whitney U檢驗(yàn)。應(yīng)用R軟件包ggplot2分析數(shù)據(jù)庫中樣本的差異。采用單因素方差分析法進(jìn)行組間的差異性比較，兩組間的差異比較應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。多因素分析采用logistic回歸模型。應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析各指標(biāo)的相關(guān)性。計(jì)算單獨(dú)診斷及聯(lián)合診斷的敏感度和特異度：敏感度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%；特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%；準(zhǔn)確度=(真陽性+真陰性)/(真陽性+假陽性+真陰性+假陰性)×100%，聯(lián)合檢測時(shí)任意陽性結(jié)果為陽性。P<0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.miR-221在CSCC患者中的表達(dá)

miR-221在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平(398.041±38.429)/million明顯高于正常對照組(241.956±29.623)/million(P<0.01)，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中miR-221的表達(dá)水平(503.474±49.189)/million也高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(381.157±43.292)/million及健康對照組(241.956±29.623)/million，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.CD109在CSCC患者中的表達(dá)

CD109在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平(11.913±3.492)/million明顯高于正常對照組(9.468±2.439)/million，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中CD109的表達(dá)水平(12.491±3.128)/million明顯高于健康對照組(9.468±2.439)/million，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.各組血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表達(dá)情況

CSCC患者組和疾病對照組患者血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表達(dá)水平均高于健康對照組(P<0.05)，且CSCC患者組高于疾病對照組(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表達(dá)水平

4.CSCC的診斷因素

以腫瘤是否發(fā)生為因變量，以CESC患者組和健康對照組為對象，logistic多因素回歸分析顯示miR-221、CEA、CD109及SCCA均對宮頸鱗狀細(xì)胞癌的診斷有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 CSCC診斷因素的logistic回歸分析

5.血清miR-221、CEA、CD109及SCCA表達(dá)水平之間的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析得出，血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表達(dá)水平之間均具有顯著的相關(guān)性(P<0.01，表3)。

表3 血清miR-221、CEA、CD109及SCCA表達(dá)水平之間的相關(guān)性

6.血清miR-221、CEA、CD109、SCCA單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測對CSCC診斷的價(jià)值分析

從血清miR-221、CEA、CD109及SCCA單獨(dú)檢測的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度分析，CEA和SCCA的準(zhǔn)確度均高于miR-221和CD109的單獨(dú)檢測結(jié)果(表4)。因此選擇CEA和SCCA聯(lián)合檢測(并聯(lián)檢測)，探討聯(lián)合檢測對CSCC的診斷價(jià)值。

表4 血清miR-221、CEA、CD109、SCCA單項(xiàng)檢測對CSCC的診斷價(jià)值

CEA和SCCA聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度分別為94.29%、77.14%和85.71%，其靈敏度和準(zhǔn)確度均高于單項(xiàng)檢測結(jié)果，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

宮頸癌是威脅全球女性健康的主要疾病之一，其發(fā)病率日漸增高，全球每年約有50萬女性被確診為宮頸癌，且5年內(nèi)生存率不足50%[6]，病因復(fù)雜，其中高危型人類乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是主要致病因素。近年來隨著篩查技術(shù)的發(fā)展及HPV疫苗的應(yīng)用，已有效控制及治療部分患者，宮頸癌根治手術(shù)及同步放化療技術(shù)也日趨成熟，但多數(shù)局部晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者并無法受益，仍有多數(shù)腫瘤患者發(fā)展成為晚期癌癥。因此，尋找更多的癌前病變指標(biāo)及早期診斷指標(biāo)，探討宮頸癌不同病理類型間的表達(dá)差異對臨床診斷及治療具有重要意義。

近年有研究[7]顯示，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，miRNA可通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，參與信號通路，發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。幾乎全部腫瘤細(xì)胞中均可檢測到miRNA的異常表達(dá)，基于miRNA的靶向治療也已成為近年來腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。目前在宮頸癌患者中已發(fā)現(xiàn)許多異常表達(dá)的miRNA參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[8]。miR-221可通過對GHR、PUMA、Bmf、DDIT4等癌基因的調(diào)控影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。本文通過數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者組織中，miR-221的表達(dá)明顯高于正常健康人群，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-221表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者和健康對照組人群。本實(shí)驗(yàn)檢測了宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者血清中miR-221的水平，分析發(fā)現(xiàn)血清中miR-221的表達(dá)水平明顯高于宮頸息肉患者的表達(dá)水平。說明miR-221有可能作為癌基因在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮作用。

白細(xì)胞分化抗原109(CD109)是一種細(xì)胞表面抗原，屬于α2-巨球蛋白家族成員，在鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展中屬于具有高風(fēng)險(xiǎn)性的分子標(biāo)志物。在膠質(zhì)瘤、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞樣乳腺癌等多種腫瘤中均呈高表達(dá)狀態(tài)[9]。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CD109在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者血清中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，CSCC患者血清中CD109的水平明顯高于宮頸息肉患者，可見，CD109可作為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的特異性標(biāo)志物。

CEA為一種特異性胚胎抗原酸性蛋白，可通過促進(jìn)癌細(xì)胞DNA分裂途徑，增加癌細(xì)胞浸潤風(fēng)險(xiǎn)，也是腫瘤患者常見的檢測標(biāo)志物[10]。血清鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)作為一種特異性較好的宮頸癌標(biāo)志物，能參與細(xì)胞基因調(diào)控、基質(zhì)降解，特異性反映細(xì)胞增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移情況[11]，已廣泛應(yīng)用于宮頸癌的診斷中。但單獨(dú)檢測CSCC患者血清SCCA水平，對于診斷宮頸癌的靈敏度較低，不利于宮頸癌的有效檢出。由于早期宮頸癌患者無明顯臨床癥狀，且發(fā)病緩慢，癥狀一旦出現(xiàn)，往往錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，嚴(yán)重影響了患者的治療效果及預(yù)后。研究表明，CSCC患者血清中SCCA水平的增高，與患者的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度及腫瘤大小等均存在一定的相關(guān)性，而且SCCA的水平還會隨著患者宮頸癌肌層浸潤深度的不斷加深而逐漸增高[12]。

通過相關(guān)性分析得出，血清中各指標(biāo)的表達(dá)水平之間存在顯著的相關(guān)性，因此，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合檢測CSCC患者血清中CEA和SCCA的水平，發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合檢測的靈敏度均高于各項(xiàng)指標(biāo)的單項(xiàng)檢測結(jié)果，準(zhǔn)確度高于miR-221和CD109的單獨(dú)檢測結(jié)果?？梢?，聯(lián)合檢測CSCC常見的腫瘤標(biāo)志物檢測提高了宮頸鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷效率，也為臨床上早期診斷CSCC提供了一定的理論數(shù)據(jù)。