微塑料-多環(huán)芳烴對農(nóng)用地土壤微生物群落結構和功能的影響

劉沙沙，操江飛，陳顯宇，梁綺彤

（肇慶學院環(huán)境與化學工程學院/廣東省環(huán)境健康與資源利用重點實驗室，廣東 肇慶 526061）

【研究意義】塑料及其制品因具有耐用性、成本低等優(yōu)點而被人們廣泛應用于生產(chǎn)和生活中，但塑料垃圾的不當處理會對環(huán)境造成嚴重污染。大塊塑料經(jīng)過物理、化學和生物作用后逐漸破碎成尺寸更小的細小顆粒，當粒徑小于5 mm時稱為微塑料；微塑料還被應用在原料、藥物和個人護理品等工業(yè)化產(chǎn)品中，這些也是環(huán)境中微塑料的重要來源。陸地環(huán)境是微塑料更重要的“匯”，微塑料含量可能是海洋中的4～23 倍［1］。此外，隨著工業(yè)化進程的加快，環(huán)境中多環(huán)芳烴（PAHs）的含量逐漸增加。2014 年《全國土壤污染狀況調查公報》指出，土壤中PAHs 的點位超標率為1.4%。農(nóng)用地土壤作為人類生存和發(fā)展的重要支撐，其微塑料和PAHs 污染問題應引起足夠重視。

【前人研究進展】微塑料的化學性質穩(wěn)定，在環(huán)境中具有持久性并可沿食物鏈進行富集，在生物體內(nèi)積累產(chǎn)生一定毒性［2］；PAHs 可長期存在于土壤環(huán)境中，具有致畸、致癌和致突變效應［3］。由于微塑料較大的比表面積和強疏水性，其可以與共存的PAHs 發(fā)生相互作用，呈現(xiàn)出對生物體的復合毒性效應［4］。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤養(yǎng)分循環(huán)、肥力保持和土壤功能維持等方面起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，微塑料污染可以改變農(nóng)田土壤的細菌群落結構等［5-6］；PAHs 污染后的土壤微生物群落組成和活性、酶活性（脫氫酶）、降解基因等會發(fā)生變化［7-8］，微生物具有適應性的遺傳機制，會逐漸形成可以降解PAHs 的優(yōu)勢菌群，并可以利用包氣帶土壤中的PAHs 作為碳源或形成共代謝，當PAHs 污染程度較重時，則對微生物產(chǎn)生抑制作用［9-10］。

【本研究切入點】目前微塑料-PAHs 復合污染對土壤微生態(tài)影響的研究尚未見報道，而這對于農(nóng)用地土壤健康風險的評估具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】本研究分別選用聚氯乙烯（PVC）、芘（PY）作為微塑料和PAHs 的代表，進行室內(nèi)土壤培養(yǎng)實驗。利用宏基因組學技術研究PVC-PY 復合污染對農(nóng)用地土壤微生物群落結構和功能的影響，并基于測序數(shù)據(jù)進行基因功能預測分析(PICRUSt)，揭示農(nóng)用地土壤中微塑料和PAHs 污染的潛在微生物生態(tài)效應，為農(nóng)用地土壤中微塑料-PAHs 復合污染的生態(tài)風險評估和治理修復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣品采自廣東省肇慶市高要區(qū)金渡鎮(zhèn)的農(nóng)用地（23°2'58″N，112°30'44″E），采用“S”形布點法采集土樣，采樣深度為0～20 cm，混合均勻后運回實驗室，自然風干，去除粗大的石塊、殘根和凋落物等，過孔徑2 mm 篩混勻，備用。

芘（PY）購自Aldrich 公司，純度為98%；聚氯乙烯（PVC）購自Aldrich 公司，其粒徑在200～250 μm 之間；其他試劑為分析純。

1.2 土壤培養(yǎng)實驗設計

將溶于丙酮的芘加入到土壤中，待丙酮完全揮發(fā)后加入聚氯乙烯微塑料，充分混勻，裝入玻璃燒杯中，土壤含水量保持在田間持水量的60%。具體分組如下：（1）CK，土壤中不加入PVC和PY；（2）PY，土壤中PY 含量為10 mg/kg；（3）PVC，土壤中含0.2%（W/W）PVC；（4）PYPVC，土壤中PY 和PVC 的濃度分別為10 mg/kg和0.2%。每個處理3 次重復。室內(nèi)土壤培養(yǎng)實驗于2019 年6 月開始，在肇慶學院的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)300 d 后取樣，一部分放在-20 ℃冰箱中保存，以供微生物高通量測序分析。

1.3 土壤微生物群落宏基因組測序

采用磁珠法提取土壤總DNA，利用裂解液和蛋白酶進行裂解消化，通過結合液和磁珠吸附凈化DNA，經(jīng)洗滌和洗脫后回收DNA，1%瓊脂糖凝膠（電壓200 V、時間30 min）檢測DNA 完整性，Qubit 定量檢測DNA 樣本濃度，并對樣本進行質檢；使用Covaris 儀器將DNA 進行片段化，經(jīng)DNA 片段末端修復、連接接頭和磁珠分選純化連接產(chǎn)物后進行PCR 擴增富集，并進一步經(jīng)文庫純化和質檢合格后，完成文庫構建；采用Illumina HiSeq 平臺進行高通量測序，對測序的原始數(shù)據(jù)進行質量評估以獲得有效數(shù)據(jù)，對優(yōu)質reads 進行拼接組裝，使用Prodigal 對拼接的contigs 進行ORF 預測，根據(jù)NCBI 的微生物分類學信息數(shù)據(jù)庫，獲得基因的物種分類注釋信息，并在各個分類學水平上統(tǒng)計物種的結構和相對豐度；進行Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫比對分析微生物群落的生物學功能，結合Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫對微生物群落的代謝通路進行預測，將基因集蛋白序列與Carbohydrate Active Enzymes (CAZy)數(shù)據(jù)庫進行比對，得到其對應的碳水化合物活性酶注釋信息。

2 結果與分析

2.1 聚氯乙烯/芘污染對土壤微生物群落結構的影響

本研究在土壤中檢測出2 055 個屬分類學水平上的微生物，CK、PY、PVC 和PY-PVC 4 組樣品中不同屬的菌所占比例具有一定差異（圖1）。Huang 等［11］研究表明，低濃度的聚乙烯（PE）微塑料對土壤中細菌群落多樣性沒有影響，但提高了群落的豐富度；費禹凡［5］發(fā)現(xiàn)PE 的存在顯著改變了菌落結構，PVC 對一些細菌的相對豐度有增強作用；在土壤中添加PVC、高密度聚乙烯（HDPE）和聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)后，細菌群落未發(fā)生明顯變化［12］。Li 等［13］研究指出微塑料的存在對土壤微生物多樣性的影響不明顯，但顯著增加了微生物數(shù)量。這說明微塑料與土壤微生物群落之間的關系十分復雜，可能與土壤的理化性質、微塑料的種類和濃度等有關。但目前關于添加微塑料和PAHs 后，土壤微生物群落結構的變化還未見報道。

圖1 PY-PVC 對屬水平上微生物群落相對豐度的影響Fig.1 Effects of PY-PVC on relative abundance of microbial communities at genus level

PY 和PVC 污染脅迫下，Acidobacteria（酸桿菌）、Betaproteobacteria（β-變形菌）、Nitrososphaera（亞硝化球菌屬）、Gemmatimonas（芽單胞菌）、Gemmatirosa、Pyrinomonas、Acidobacteriaceae（酸桿菌科）、Cand_Candidatus_Entotheonella（棒狀桿菌）、Bradyrhizobium（慢生根瘤菌）、Nitrospira（硝化螺旋菌）、Deltaproteobacteria（δ-變形菌）、Gammaproteobacteria（γ-變形菌）、Rhodoplanes（紅游動菌屬）、Acid_Candidatus_Koribacter（嗜酸菌）、Geobacter（桿菌）、Crenarchaeota（泉古菌）、Sorangium（纖維堆囊菌）、Pedosphaera、Bryobacter（苔蘚桿菌）、Anaeromyxobacter（厭氧粘細菌）、Burkholderia（伯克霍爾德菌）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Myxococcus（粘球菌）、Flavisolibacter（黃色土源菌）、Edaphobacter（土壤桿菌）、Paenibacillus（類芽孢桿菌）、Chloracidobacterium等菌屬的相對豐度低于CK，說明PY 和PVC 對這些菌屬產(chǎn)生抑制作用。PY 和PVC 可增強Sphingomonas（鞘氨醇單胞菌）、Nocardioides（諾卡氏菌）、Lysobacter（溶桿菌屬）、Chlorof lexi（綠彎菌門）、Marmoricola（火山巖海球菌）、Streptomyces（鏈霉菌）、Phycicoccus、Solirubrobacter（土壤紅桿菌屬）、Conexibacter（束縛菌屬）、Methylibium、Gaiella、Mesorhizobium（根瘤菌屬）、Mycobacterium（分枝桿菌）、Sphingopyxis（鞘脂單胞菌屬）、Sphingobium（鞘脂菌屬）、Novosphingobium（新鞘脂菌屬）、Variovorax（貪噬菌屬）、Luteimonas（藤黃單胞菌）等菌屬的相對豐度。

2.2 聚氯乙烯/芘存在下土壤中微生物菌群的功能預測

2.2.1土壤中微生物群落的生物學功能分析 根據(jù)GO 數(shù)據(jù)庫，對CK、PY、PVC 和PY-PVC 土壤中微生物的生物學功能進行分析，結果見圖2。土壤中添加PY 和PVC 后，Binding（結合）、Biological regulation（生物調節(jié)）、Cell（細胞）、Developmental process（發(fā)育過 程）、Enzyme regulator activity（酶活性調節(jié)）、Locomotion（運動）、Macromolecular complex（大分子復合物）、Metabolic process（代謝過程）、Molecular function regulator（分子功能調節(jié)）、Organelle（細胞器）、Reproduction（繁殖）、Structural molecule activity（結構分子活性）和Transporter activity（轉運活性）功能的豐度呈升高趨勢。但Biological adhesion（生物附著）、Cellular process（細胞進程）、Electron carrier activity（電子載體）、Extracellular matrix（細胞外基質）、Membrane（細胞膜）、Molecular transducer activity（分子傳感器活性）、Response to stimulus（刺激反應）和Signaling（信號）功能的豐度降低。

圖2 基于GO 的微生物群落主要功能分類Fig.2 Functional classification of microbial communities based on GO

2.2.2KEGG 代謝途徑差異分析 從圖3 可以看出，PY 和PVC 參與到Aging（衰老）、Amino acid metabolism（氨基酸代謝）、Biosynthesis of other secondary metabolites（次級代謝產(chǎn)物合成）、Cell growth and death（細胞生長和死亡）、Cell motility（細胞運動）、Cellular community（細胞群落）、Circulatory system（循環(huán)系統(tǒng)）、Energy metabolism（能量代謝）、Environmental adaptation（環(huán)境適應）、Excretory system（排泄系統(tǒng)）、Folding sorting and degradation（折疊分選與降解）、Lipid metabolism（脂類代謝）、Membrane transport（細胞膜轉運）、Metabolism of cofactors and vitamins（輔助因子和維生素代謝）、Metabolism of terpenoids and polyketides（萜類和聚酮類代謝）、Nucleotide metabolism（核苷酸代謝）、Replication and repair（復制和修復）、Signal transduction（信號轉導）、Transcription（轉 錄）、Translation（翻 譯）、Transport and catabolism（轉運和分解代謝）和Xenobiotics biodegradation and metabolism（外源化學物的生物降解和代謝）等代謝通路的比例都呈現(xiàn)升高趨勢。

圖3 基于KEGG 的代謝通路分析Fig.3 Metabolic pathway analysis based on KEGG

2.2.3碳水化合物活性酶（CAZy）分析 將基因序列輸入CAZy 數(shù)據(jù)庫進行比對，得到碳水化合物活性酶的注釋信息，包括輔助氧化還原酶(AAs)、碳水化合物結合結構域（CBM）、碳水化合物酯酶（CEs）、糖苷水解酶類（GHs）、糖基轉移酶（GTs）和多糖裂解酶（PLs），見圖4。

圖4 碳水化合物活性酶的分類統(tǒng)計Fig.4 Classification and statistics of carbohydrate active enzymes

3 討論

酸桿菌作為土壤環(huán)境pH 的調節(jié)者，在維持土壤微生物群落的組成和穩(wěn)定方面具有重要作用，可以參與反硝化作用，與土壤中的氮素循環(huán)相關，參與磷轉化并可保持土壤中有效磷的含量［14-16］。變形菌具有固氮作用，是氨氧化作用的重要參與者，從而影響土壤中的氮素轉化，能增強養(yǎng)分恢復和能量的產(chǎn)生［17-18］。芽單胞菌的相對豐度與土壤的理化特性（pH、總氮、速效磷和溶解性有機碳）和酶活性（過氧化氫酶、錳過氧化物酶、脲酶和過氧化物酶）顯著相關，參與了碳氮循環(huán)和磷轉化。一些前人研究也得出了與本研究結果相似的規(guī)律，例如，Hou 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，添加PE 和PVC 微塑料后，土壤中酸桿菌科的相對豐度顯著降低。酸桿菌、變形菌門和芽單胞菌門在地膜微塑料污染土壤中的相對豐度要低于對照組土壤［16］。亞硝化球菌屬和硝化螺旋菌可能是酸土壤硝化作用的重要驅動者，在氮循環(huán)中起到重要作用［20-21］。Treusch 等［22］和Venter 等［23］利用環(huán)境基因組學方法研究發(fā)現(xiàn)泉古菌中含有氨氧化關鍵功能基因（amoA）。伯克霍爾德菌是在農(nóng)田土壤中常見的一種解磷菌，可水解有機磷轉化為無機磷酸鹽，供環(huán)境中的生物利用［24］。厭氧粘細菌具有很好的聚磷效果［25］；假單胞菌進行硝化和反硝化的能力很強［26］。本研究中，在土壤中添加PY 和PVC 后，上述這些菌屬的相對豐度均降低，說明PY-PVC 污染可能會通過抑制這些微生物的生長和繁殖過程來影響它們在氮磷循環(huán)和轉化過程中的作用，從而降低了土壤中氮和磷的含量。通過測定PY 和PVC 存在下土壤中速效氮和有效磷的含量發(fā)現(xiàn)，與CK相比，添加PY-PVC 后速效氮和有效磷分別降低了10.81%和9.34%。

鞘氨醇單胞菌能夠降解PAHs 和塑料單體，還可分泌多聚糖來促進塑料表面生物膜的形成［27］；鞘脂菌屬和新鞘脂菌屬可以降解菲和芘［28-29］，它們還被報道具有很強的降解塑料聚合物（聚乙烯醇）的能力［30］，并在PE、PP 和PS 微塑料表面的生物膜中檢測到［31］，推測鞘脂菌屬和新鞘脂菌屬也具有降解微塑料的潛力。分枝桿菌、諾卡氏菌、溶桿菌屬、火山巖海球菌、鏈霉菌、貪噬菌屬和藤黃單胞菌均已被證實具有降解PAHs 的能力［32-37］。馮靜［38］利用基因克隆技術研究發(fā)現(xiàn)，白淺灰鏈霉菌可以降解PE 塑料，其分泌的漆酶在降解過程中起到關鍵作用。這表明土壤中的微生物在受到PY 和PVC 污染的長期脅迫后，通過增加這些可耐受和降解PY 和PVC的菌群數(shù)量和組成來抵抗脅迫，使土壤生態(tài)系統(tǒng)在污染物作用下能夠保持相對穩(wěn)定。

生物調節(jié)是生物體通過自身調整和機制來應對污染脅迫的重要功能［39］；運動功能可以讓生物體在污染環(huán)境中更好地生存下來［40］，PY 和PVC 的添加增強了土壤菌群的生物調節(jié)和運動功能，說明微生物能進行自調控來提高對PY-PVC污染的耐受性。發(fā)育、繁殖和代謝過程的增強會促進土壤微生物的生命活動而對PY-PVC 污染呈現(xiàn)出較好的適應能力。轉運功能的增強可以讓進入到細胞質內(nèi)的污染物更好地排出到胞外，降低PY 和PVC 對微生物的危害。

氨基酸/碳水化合物/脂類代謝是生物體內(nèi)的主要代謝途徑，它們與能量代謝密切相關。核苷酸代謝與細胞自身穩(wěn)態(tài)直接相關，這對于生物體的生理過程至關重要，有助于能量供給體腺苷三磷酸（ATP）和鳥嘌呤核苷三磷酸（GTP）的生成。次級代謝產(chǎn)物的合成可以進一步將微生物代謝過程產(chǎn)生的有害物質進一步轉化，可以對抗生物進程中出現(xiàn)的氧化應激反應，提高微生物的存活能力［41］。PY 和PVC 的添加不僅增強了氨基酸/碳水化合物/脂類代謝等初級代謝進程，還促進了次級代謝產(chǎn)物的合成過程，包括萜類和聚酮類代謝、輔助因子和維生素代謝等，這說明土壤中微生物通過加快代謝過程，為微生物細胞的生命活動提供能量；還可通過提高自身的抗氧化能力來應對PY-PVC 污染的脅迫。轉錄是在RNA 聚合酶的催化作用下以DNA 的一條鏈為模板合成信使RNA（mRNA）的過程，然后在酶和輔助因子的協(xié)助下以mRNA 為模板合成蛋白質從而完成翻譯過程，在微生物體內(nèi)轉錄和翻譯是同時發(fā)生的，通過調整基因的表達來適應環(huán)境的變化。信號轉導是生物細胞針對外界環(huán)境變化所進行的生理應答反應，可通過改變細菌的基因轉錄表達來減輕環(huán)境脅迫的影響［42-43］。這些代謝途徑比例的增加可能是微生物為了適應PY 和PVC 污染的調控機制。外源化學物的生物降解和代謝途徑是將有污染物通過微生物的分解作用轉化為小分子物質、CO2和H2O 的過程；細胞內(nèi)積累的有害代謝產(chǎn)物可以通過細胞膜轉運和排泄過程及時從體內(nèi)排出，有利于微生物的生長，從而加速微生物群落的演替，提高微生物對PY、PVC 的解毒和抵抗能力。

AAs 屬于催化蛋白質類，包括單加氧酶、過氧化物酶和氧化還原酶類等，它們在微生物降解有機污染物和塑料的過程中起到一定作用［44-45］。例如，細菌可以分泌不同的過氧化物酶進而控制其對芳香族化合物的降解作用；氧化還原酶會參與到有機污染物的降解過程中，并可維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；微生物群落可通過氧化還原酶類等參與其代謝途徑來完成對污染物的分解。PY 和PVC 污染土壤中AAs 功能的增強，說明在兩者的長期作用下，土壤中微生物表現(xiàn)出對PY 和PVC的降解潛力，這可能也是菌群抵抗污染物毒性的機制之一。CBM 是一個連續(xù)的氨基酸序列，可以通過非共價鍵作用方式將多糖底物斷裂開［46］，CEs、GHs、GTs 和PLs 與多糖（木質素、木聚糖、多糖、纖維和半纖維等）的分解有關。胞外多糖的含量與微生物對污染脅迫的抵抗性呈正相關［47-48］，本研究在污染體系中與多糖分解相關酶的比例降低，說明PY 和PVC 的存在會抑制多糖的分解轉化，促使微生物能更好地適應污染脅迫的環(huán)境。

綜上所述，PVC-PY 復合污染會對土壤微生物群落的生物學功能、代謝途徑和CAZy 酶活性產(chǎn)生一定影響，三者的變化具有一定的相關性。細胞膜轉運和排泄過程的提高可以促進有害代謝產(chǎn)物排出到細胞外，這與菌群的轉運功能的增強一致。菌群代謝功能的加快可為微生物細胞的生命活動提供充足的能量，這與其發(fā)育和繁殖功能的增強規(guī)律相符合。AAs 在有機污染物和塑料的微生物降解過程中發(fā)揮一定作用，AAs 活性的增強說明了在PVC-PY 污染土壤中微生物對兩者的降解潛力，這與外源化學物的生物降解/代謝途徑比例升高有很大的關聯(lián)性。生物學功能、代謝途徑和CAZy 酶活性對菌群的生物學過程具有相互聯(lián)系的調控機理，對微生物群落應對PVC-PY污染的脅迫起協(xié)同作用，使土壤生態(tài)系統(tǒng)在污染物作用下能夠維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

4 結論

PY 和PVC 的添加會使β-變形菌、芽單胞菌、亞硝化球菌和伯克霍爾德菌等相對豐度降低，可能會抑制這些菌在氮磷循環(huán)和轉化中的作用；增加了可耐受/降解PY 和PVC 的鞘氨醇單胞菌、諾卡氏菌、溶桿菌屬、鏈霉菌和分枝桿菌等的相對豐度。PY和PVC能夠增強土壤中微生物的發(fā)育、繁殖和自我調節(jié)功能，加快污染物的代謝進程和對有害產(chǎn)物的轉運/排泄過程，不僅為生物體的生命活動提供能量，還可提高其自身的抗氧化能力，促使微生物對PY 和PVC 污染環(huán)境具有更好的適應能力。