利用CRISPR/Cas9 技術(shù)定向編輯水稻OsIQD1 基因

林春姿，謝華斌，黃其偉，高 上，王加峰

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】鈣調(diào)素（Calmodulin,CaM）作為細(xì)胞內(nèi)主要的Ca2+傳感蛋白，通過與不同的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（Calmodulin Binding Proteins,CaMBPs）結(jié)合傳遞鈣信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞生理和生長發(fā)育過程。IQD 家族蛋白屬于一類CaMBPs，是Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)的重要感受器［1］，在各種陸地植物上都很常見［2］。已發(fā)現(xiàn)的IQD 家族蛋白的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能不盡相同，但大多在植物生長發(fā)育和調(diào)控生物脅迫與非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用，且它們的亞細(xì)胞定位模式各不相同［3］。AtIQD1 與KLCR1 和CaM 相互作用，從而將驅(qū)動(dòng)蛋白與Ca2+第二信使信號(hào)聯(lián)系起來［4-5］。其他IQD 家族蛋白也可能介導(dǎo)不同的驅(qū)動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路，例如蛋白質(zhì)分選或細(xì)胞壁形成［6］。IQD家族最早在擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)，已發(fā)現(xiàn)擬南芥、水稻、大豆、番茄、玉米中有33、29、67、34、26 個(gè)IQD基因［2,7］。目前絕大多數(shù)IQD1基因的具體功能尚不明確，利用CRISPR/Cas9 編輯技術(shù)對(duì)水稻IQD基因家族成員OsIQD1進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得的突變體對(duì)探究OsIQD1基因調(diào)控水稻生長發(fā)育與逆境響應(yīng)的作用機(jī)制等均具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】IQD 家族蛋白均含有IQ 基序（IQxxxRGxxxR），其功能的深入研究是闡明Ca2+/CaM 介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵［2,8］。擬南芥AtIQD1 定位于細(xì)胞核和微管，與CaM 以依賴于Ca2+的方式互作，并與多種蛋白質(zhì)同時(shí)相互作用以整合Ca2+信號(hào)防御生物脅迫［9-10］，而AtIQD22表達(dá)受赤霉素抑制，被DELLA基因誘導(dǎo)，表明AtIQD22參與植物防御反應(yīng)和生長發(fā)育的調(diào)節(jié)［11］。過表達(dá)番茄IQD12/SUN會(huì)導(dǎo)致番茄果實(shí)變長，莖和葉穗軸扭曲生長，推測(cè)與生長素的分布改變有關(guān)，可見IQD12/SUN參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育［12-13］，而ZmIQDs 和PtIQDs 對(duì)干旱脅迫起關(guān)鍵作用［14-15］。雖然IQD 家族蛋白很早就在水稻中被發(fā)現(xiàn)，但它們的具體生物學(xué)功能尚未見報(bào)道?；蚓庉嬍抢煤怂崦福–as9）對(duì)基因組的目標(biāo)基因進(jìn)行剪切編輯，從而使目的基因發(fā)生突變而改變某一特定性狀的技術(shù)。利用基因編輯技術(shù)準(zhǔn)確有效地對(duì)水稻基因組進(jìn)行修飾，對(duì)水稻重要性狀的改良具有重要意義。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是繼鋅指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFN）技術(shù)和類轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN）技術(shù)之后的新一代基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)可對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行插入或者刪除式的基因敲除［16-18］。CRISPR/Cas9 編輯系統(tǒng)作為植物遺傳改良的有效途徑，自2013 年以來在水稻、小麥、玉米、番茄、煙草、大豆等農(nóng)作物中成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)基因的定點(diǎn)編輯［19-23］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究團(tuán)隊(duì)前期通過酵母雙雜篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pik-H4 和OsIQD1 存在互作關(guān)系，進(jìn)一步解析水稻OsIQD1 的功能對(duì)揭示其在水稻生長發(fā)育、逆境脅迫調(diào)節(jié)過程中的作用機(jī)制具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以水稻OsIQD1為目的基因，通過CRISPR/Cas9 基因編輯與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，獲得水稻osiqd1突變體材料，以期為后續(xù)開展OsIQD1 參與的抗稻瘟病具體調(diào)控通路的功能解析奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的水稻材料為粳稻Pik-H4 NIL，是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心利用誘變株系H4 與LTH 構(gòu)建的含有抗稻瘟病基因Pik-H4的近等基因系。Cas9-gRNA 表達(dá)盒載體pGTR 和pRGEB32 購自Addgene 公司。編輯靶點(diǎn)引物、核酸測(cè)序服務(wù)分別由生工生物工程（上海）股份有限公司、北京擎科生物科技有限公司完成。BsaI 內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶分別購自NEB（北京）有限公司、南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

利用OsIQD1的CDS 序列在CRISPR/Cas9 在線靶點(diǎn)設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/ targetdesign/）設(shè)計(jì)2 個(gè)特異性靶點(diǎn)。對(duì)2 個(gè)靶點(diǎn)的編碼區(qū)序列進(jìn)行掃描分析，以原間隔子鄰近序列（Protospacer Adjacent Motifs，PAM）前20 個(gè)堿基作為候選靶點(diǎn)，以日本晴全基因組為參考序列，選擇特異性高的序列〔第1 外顯子和第5 外顯子（DUF4005 結(jié)構(gòu)域）區(qū)域〕為靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)2 個(gè)20 bp 的編輯靶點(diǎn)，旨在提高無功能蛋白的發(fā)生概率從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因敲除。為保證OsIQD1靶點(diǎn)序列的一致性，在Pik-H4 NIL 中對(duì)兩個(gè)靶點(diǎn)區(qū)域序列分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，以分析靶點(diǎn)序列是否與日本晴序列一致，所用引物如表1 所示。

表1 PCR 擴(kuò)增靶點(diǎn)區(qū)域序列所用的引物Table 1 Primers used for PCR amplification of target region sequences

1.3 基因編輯載體構(gòu)建

敲除載體構(gòu)建參考Kabin 等［24］的方法。根據(jù)分別來自第1 外顯子、第5 外顯子的2 個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物（表2）。以pGTR 載體為模板，分別用3 對(duì)引物（L5AD5-F 和OSIQD1-target1-R、OSIQD1-target1-F 和OSIQD1-target2-R、OSIQD1-target2-F 和L3AD5-R）擴(kuò)增相應(yīng)片段。各片段進(jìn)行凝膠回收純化后用BsaI 進(jìn)行酶切，并用T7 連接酶組裝3 個(gè)片段，然后將組裝產(chǎn)物用引物（S5AD5-new-F 和S3AD5-new-R）再進(jìn)行一輪PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：2 μL 模板DNA、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP、1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，S5AD5-new-F 和S3AD5-new-R 各2 μL，17 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s、57℃退火15 s、72℃延伸15 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PCR 產(chǎn)物純化后用FokI 進(jìn)行酶切，最終得到gRNA-靶點(diǎn)1-tRNAgRNA-靶點(diǎn)2-tRNA 片段。將Cas9 蛋白表達(dá)載體pRGEB32 用BsaI 進(jìn)行酶切，利用T4 連接酶將帶有靶點(diǎn)的純合片段與酶切載體進(jìn)行連接重組，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 后進(jìn)行測(cè)序分析，陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)，并侵染轉(zhuǎn)化Pik-H4 NIL 愈傷組織，經(jīng)2 次篩選、分化、生根，將轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行種植。用CTAB 法提取T0代轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA，用抗潮霉素基因（HPT II）特異引物（HPT-F：5′-ATTTGTGTACGCCCGACAGT-3′ 和HPT-R：5′-GTGCTTGACATTGGGGAGTT-3′）進(jìn) 行PCR檢測(cè)以確定轉(zhuǎn)基因陽性植株。

表2 基因編輯載體構(gòu)建所用的引物Table 2 Primers used for gene editing vector construction

1.4 基因編輯株系的靶點(diǎn)分析

為檢測(cè)OsIQD1基因靶點(diǎn)的突變情況，利用引物OsIQD1-target1-test-F、OsIQD1-target1-test-R、OsIQD1-target2-test-F、OsIQD1-target2-test-R（表1）分別對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性植株的OsIQD1基因2 個(gè)靶點(diǎn)區(qū)域的DNA 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：1 μL 模板DNA、12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix，引物各1 μL，9.5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s、57℃退火15 s、72℃延伸1 min，27 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。獲得PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別為280、357 bp，將靶點(diǎn)區(qū)域位置的擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，并與野生型區(qū)域序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定突變植株的基因變異類型。

1.5 OsIQD1 敲除植株的病程相關(guān)基因表達(dá)量分析

基于前期研究已知Pik-H4 與OsIQD1 存在互作關(guān)系，Pik-H4 又受稻瘟病菌誘導(dǎo)，因此進(jìn)一步檢測(cè)野生型和突變體中的病程相關(guān)（Pathogenesisrelated,PR）基因表達(dá)量。PR1a和PR1b是最早報(bào)道的水稻PR1基因家族成員［25-26］，其編碼的蛋白質(zhì)剩余類絲氨酸羧肽酶（Serine Carboxypeptidase-Like Proteins,SCPLs）［27］。剪取野生型和突變體植株的葉片，檢測(cè)稻瘟病菌病程相關(guān)基因的表達(dá)量，引物序列如表3 所示。

表3 稻瘟病菌病程相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)所用的引物Table 3 Primers used to detect the expression of genes related to the course of disease in Magnaporthe oryzae

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻IQD1 同源蛋白分析

為獲得水稻IQD1的候選蛋白，用AtIQD1 蛋白序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源搜索，結(jié)果（圖1）表明，水稻中存在3 個(gè)與AtIQD1 同源性較高的候選蛋白，分別為Os01g0833800（41.67%）、Os05g0123200（44.27%）和Os05g0463300（46.77%），Os01g0833800 基因包含7 個(gè)外顯子，CDS 全長1 503 bp，編碼501個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)C 端有1 個(gè)DUF4005 結(jié)構(gòu)域。Os05g0463300 基因包含5 個(gè)外顯子，CDS全長1 617 bp，編碼539 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)C 端含有1 個(gè)IQ 基序。Os05g0123200 含有6 個(gè)外顯子，CDS 全長1 425 bp，編碼475 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的 N 端含有1 個(gè)IQ 基序，C 端含有1個(gè)DUF4005 結(jié)構(gòu)域。已知IQ 基序（IQxxxRGxxxR）主要是少數(shù)幾個(gè)CaM 與CaMBPs 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域之一［28］，而DUF4005 結(jié)構(gòu)域是一種由59 個(gè)氨基酸組成的肽，在體外直接與微管結(jié)合［29］。已 知OsIQD1的TIGR Rice Genome Project ID 為Os05m00240［2］，且根據(jù)比對(duì)氨基酸序列結(jié)果推測(cè)，Os05g0123200 為AtIQD1的同源基因OsIQD1。

圖1 OsIQD1 與AtIQD1 同源性分析Fig.1 Homology analysis of OsIQD1 and AtIQD1

2.2 pRGEB32-OsIQD1-gRNA 雙元載體構(gòu)建

為獲得OsIQD1定點(diǎn)編輯突變體，在OsIQD1基因第1 外顯子、第5 外顯子各設(shè)計(jì)1個(gè)靶點(diǎn)，將組裝好的純合片段連接到pRGEB32載體骨架中，得到pRGEB32-OsIQD1-gRNA 雙元載體（圖2 A、B）。利用OsU3 啟動(dòng)子測(cè)序引物（pRGEB32-CX-F 和 pRGEB32-CX-R）對(duì) 構(gòu)建載體上的靶點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如圖2 C 所示，2 個(gè)靶點(diǎn)序列與所設(shè)計(jì)靶點(diǎn)序列一致。抽提相應(yīng)的質(zhì)粒DNA，利用NheⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行酶切鑒定，獲得大小約為5.57 kb 和10.69 kb 的目的片段（圖2 D），表明OsIQD1的2 個(gè)靶點(diǎn)正確組裝到 pRGEB32 載體上。本研究構(gòu)建的載體適用于后續(xù)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化中，為獲得OsIQD1水稻突變體奠定基礎(chǔ)。

圖2 gRNA 靶位點(diǎn)、pRGEB32-OsIQD1-gRNA 表達(dá)載體組裝示意圖及陽性克隆鑒定結(jié)果Fig.2 gRNA target sites,assembly diagram of pRGEB32-OsIQD1-gRNA expression vector and positive clone identification results

2.3 轉(zhuǎn)基因植株鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pRGEB32-OsIQD1-gRNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻材料Pik-H4 NIL 愈傷組織中，獲得30 株轉(zhuǎn)基因植株。用篩選標(biāo)記抗潮霉素基因HPT II特異引物（HPT-F 和HPT-R）對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR 鑒定，以載體質(zhì)粒為模板作為陽性對(duì)照，野生型日本晴DNA 為模板作為陰性對(duì)照。結(jié)果（圖3）表明，本研究成功獲得30 株陽性轉(zhuǎn)基因植株。

圖3 轉(zhuǎn)基因株系抗潮霉素基因HPT II 的PCR 鑒定Fig.3 Identification of hygromycin resistance gene HPT II of transgenic line by PCR

2.4 突變類型分析

為明確OsIQD1基因靶點(diǎn)是否發(fā)生定點(diǎn)編輯，進(jìn)一步對(duì)經(jīng)潮霉素檢測(cè)鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性植株的突變位點(diǎn)進(jìn)行分析。由于OsIQD1基因的2 個(gè)靶點(diǎn)在序列上相距2 587 bp，利用兩對(duì)引物（表1）擴(kuò)增各靶位點(diǎn)區(qū)域DNA 片段。以獲得的轉(zhuǎn)基因陽性植株基因組DNA 為模板，用相應(yīng)的引物對(duì)靶位點(diǎn)序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并測(cè)序。以野生型序列作為參考，分析比較OsIQD1轉(zhuǎn)基因株系中各靶位點(diǎn)附近序列的測(cè)序峰圖，并利用解碼網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/）對(duì)全部轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果（表4）表明，30 個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性株系中，有10 個(gè)株系的OsIQD1基因發(fā)生了定點(diǎn)編輯現(xiàn)象，其中有6 個(gè)株系（m1、m2、m6、m8、m10 和m17）的兩個(gè)靶點(diǎn)區(qū)域均發(fā)生了編輯；有8 個(gè)株系（m1、m2、m3、m6、m8、m10、m17和m25）的靶點(diǎn)1 被編輯，共有13 個(gè)編輯事件，編輯效率為21.67%，如m1 中存在大片段缺失導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，而m6 中一條染色體存在2 bp 缺失引起移碼而導(dǎo)致翻譯提前終止（圖4A、B）；有8 個(gè)株系（m1、m2、m6、m8、m10、m17、m21 和m22）的靶點(diǎn)2 被編輯，共有16 個(gè)編輯事件，編輯效率為26.67%，如m1 已經(jīng)是純合突變，兩條染色體中均有1 bp 缺失導(dǎo)致翻譯提前終止，而m6 中一條染色體也有1 bp 缺失引起移碼導(dǎo)致翻譯提前終止（圖4C、D）。綜上分析可推測(cè)，部分突變株系（如m1）在T0代時(shí)目的基因的功能就喪失，而雜合突變需要在T1、T2代繼續(xù)測(cè)序比較分析。

圖4 部分轉(zhuǎn)基因株系中兩個(gè)靶點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果比對(duì)Fig.4 Sequencing comparison of two targets in some transgenic lines

表4 部分轉(zhuǎn)基因植株中OsIQD1 基因靶位點(diǎn)編輯情況Table 4 Editing of OsIQD1 gene targets in some transgenic plants

本試驗(yàn)收獲部分T0代株系的種子進(jìn)行擴(kuò)繁得到T1代植株，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3 種突變類型：（1）敲除靶點(diǎn)1 存在2 bp 缺失，敲除靶點(diǎn)2 存在1 bp缺失，并且測(cè)序峰圖并未出現(xiàn)嚴(yán)重的雙峰現(xiàn)象，表明osiqd1-1為純合株系；（2）敲除靶點(diǎn)1 存在一條鏈缺失1 bp、另一條鏈缺失兩個(gè)大片段的現(xiàn)象，敲除靶點(diǎn)2 存在1 bp 插入、測(cè)序峰圖靶點(diǎn)1有雙峰現(xiàn)象，靶點(diǎn)2 并未出現(xiàn)嚴(yán)重的雙峰現(xiàn)象，表明osiqd1-2尚未完全純合，但仍可作為后續(xù)試驗(yàn)材料；（3）敲除靶點(diǎn)1 存在1 bp 插入，敲除靶點(diǎn)2 存在1 bp 替換且1 bp 插入，并且測(cè)序峰圖并未出現(xiàn)嚴(yán)重的雙峰現(xiàn)象，表明osiqd1-3為純合株系（圖5A、B、C）。通過熒光定量PCR 檢測(cè)osiqd1-1、osiqd1-2、osiqd1-3等3個(gè)獨(dú)立株系的OsIQD1基因表達(dá)量，結(jié)果（圖5D）顯示，這些突變株系的基因表達(dá)量顯著低于野生型的表達(dá)水平。本研究獲得了具有穩(wěn)定遺傳的CRISPR/Cas9敲除OsIQD1的轉(zhuǎn)基因植株。

圖5 OsIQD1 的CRISPR/Cas9 敲除植株驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Verification of OsIQD1 knock-outed plants via CRISPR/Cas9

2.5 OsIQD1 敲除植株的病程相關(guān)基因表達(dá)量分析

病程相關(guān)基因一般作為免疫響應(yīng)的標(biāo)記基因。本研究檢測(cè)了野生型和突變體中稻瘟病菌病程相關(guān)基因PR1a和PR1b的表達(dá)量，結(jié)果（圖6）顯示，野生型植株P(guān)R1a和PR1b基因表達(dá)量相較于osiqd1突變體均上調(diào)，說明OsIQD1參與植物的免疫反應(yīng)過程。

圖6 病程相關(guān)基因PR1a(A)、PR1b(B)在野生型WT 和osiqd1-1、osiqd1-2、osiqd1-3 植株中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 Relative expression levels of disease-course related genes PR1a and PR1b in WT and osiqd1-1,osiqd1-2 and osiqd1-3 plants

2.6 OsIQD1 轉(zhuǎn)基因T1 代植株的獲得

經(jīng)前期鑒定獲得OsIQD1轉(zhuǎn)基因3 種突變類型植株（圖7），與野生型Pik-H4 NIL 相比，OsIQD1轉(zhuǎn)基因T1代幼苗植株生長相對(duì)一致，但分蘗數(shù)增多。敲除OSIQD1后對(duì)水稻抗病的影響需要進(jìn)一步檢測(cè)。

圖7 osiqd1-1、osiqd1-2、osiqd1-3 與野生型WT 幼苗植株形態(tài)特征比對(duì)Fig.7 Morphological characteristics of osiqd1-1,osiqd1-2 and osiqd1-3 compared to the WT

3 討論

水稻作為全球主要的糧食作物之一，養(yǎng)育世界一半以上的人口。隨著人口持續(xù)增長、耕地面積減少、極端環(huán)境頻發(fā)等問題的出現(xiàn)，糧食產(chǎn)量和安全引起了國家重點(diǎn)關(guān)注［30］。解決當(dāng)前糧食短缺的有效措施之一是在現(xiàn)有耕地的基礎(chǔ)上，突破傳統(tǒng)育種手段瓶頸，借助分子手段，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、高效的分子設(shè)計(jì)育種，提高水稻產(chǎn)量［31］。但傳統(tǒng)育種手段需要經(jīng)過多代回交篩選，育種工作量巨大，周期較長，效率低下，且容易受連鎖基因影響。而CRISPR/Cas9 是一種高效且簡(jiǎn)便的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，能快速獲得目標(biāo)性狀改善并能穩(wěn)定遺傳的純合突變植株，極大地縮短了育種周期［32-33］。

目前已經(jīng)報(bào)道的水稻IQD基因有29 個(gè)，但只有OsIQD14得到進(jìn)一步研究，而其他家族成員未得到深入研究。OsIQD14 在水稻籽殼細(xì)胞中高度表達(dá)，調(diào)節(jié)微管細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)以控制稻粒大小。除了定位到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)外，OsIQD14還沿著微管分布。當(dāng)OsIQD14 耗盡時(shí)，谷物變得更寬更短，作物產(chǎn)量增加；當(dāng)OsIQD14 過表達(dá)時(shí)，晶粒變得更長更窄，不會(huì)影響總產(chǎn)量［34］。本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，通過雙靶點(diǎn)編輯方式，對(duì)水稻OsIQD1進(jìn)行定點(diǎn)突變，相對(duì)于單靶點(diǎn)編輯得到較多單一堿基突變，極大提高了對(duì)OsIQD1的編輯效率。其中target1 位點(diǎn)的編輯效率為21.67%，target2 位點(diǎn)的編輯效率為26.67%，表明同一基因的不同靶位點(diǎn)會(huì)影響編輯效率，與已報(bào)道的細(xì)胞質(zhì)分裂關(guān)鍵基因OsMAP65-3一致，載體的編輯效率與不同的靶序列相關(guān)性較大［35］。因此，為確保高效編輯，對(duì)目的基因編輯時(shí)應(yīng)選用2 個(gè)以上的靶位點(diǎn)。

本研究T0代植株突變種類較為豐富，極大提高了OsIQD1變異的多樣性，但鑒于CRISPR/Cas9 編輯植株的T0代轉(zhuǎn)基因株系會(huì)產(chǎn)生純合突變、雜合突變、雙等位突變，以及未發(fā)生突變等4 種基因型植株，純合突變株系比例相對(duì)較少，要獲得較多的變異類型則需要對(duì)雜合突變、雙等位突變等轉(zhuǎn)基因植株后代的分離情況進(jìn)行分析與鑒定。目前本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對(duì)水稻鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白基因OsIQD1編碼區(qū)序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的種質(zhì)材料，為后續(xù)開展水稻抗稻瘟病育種奠定了基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AtIQD1可以使擬南芥顯著增強(qiáng)對(duì)壞死型真菌Botrytis cinerea的抗性，敲除AtIQD1則表現(xiàn)感病，下調(diào)一些與植物生物防御相關(guān)基因的表達(dá)［36］。水稻OsIQD1 是否具有與AtIQD1 類似的功能仍有待進(jìn)一步研究。本研究通過創(chuàng)制水稻OsIQD1 突變體，旨在研究IQD1在參與水稻抗病具體調(diào)控通路中的作用機(jī)理。病程相關(guān)蛋白質(zhì)是植物受病原物脅迫后誘導(dǎo)產(chǎn)生并積累的一類蛋白質(zhì)，是植物防衛(wèi)體系的重要組成部分，它們往往在植物抗病反應(yīng)的下游發(fā)揮作用，在很多情況下是直接限制病原物生長的主要因素。最早報(bào)道的水稻PR1基因家族成員PR1a和PR1b，受稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、水楊酸（Salicylic Acid,SA）、茉莉酸（Jasmonic Acid,JA）等誘導(dǎo)，對(duì)光、傷害、磷酸酶抑制劑等脅迫和化學(xué)處理作出反應(yīng)［25-26］。本研究結(jié)果表明，與野生型Pik-H4 NIL 相比，PR1a和PR1b在osiqd1突變體植株中的表達(dá)量明顯升高，初步推測(cè)OsIQD1 參與植物的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)過程。

4 結(jié)論

鑒于CRISPR/Cas9 基因編輯可特異性敲除目標(biāo)DNA 序列，本研究利用該技術(shù)，設(shè)計(jì)了分別靶向起始密碼子（ATG）下游與DUF4005 結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)靶點(diǎn)，對(duì)OsIQD1基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，并獲得了osiqd1純合突變體材料。與野生型Pik-H4 NIL相比，osiqd1突變體在幼苗時(shí)期長勢(shì)大致相同，但分蘗增多；同時(shí)，PR1a和PR1b在osiqd1突變體中表達(dá)量明顯升高，初步推測(cè)OsIQD1 參與到植物的基礎(chǔ)免疫過程中，為水稻抗稻瘟病的研究提供了豐富的遺傳材料，也為水稻的抗病育種奠定了重要基礎(chǔ)。