超聲-DNA提取酚試劑-堿性蛋白酶協(xié)同提取污泥蛋白質(zhì)的研究

＊崔靜 周濤 趙由才

（1.天津裕川錦鴻環(huán)保科技有限公司 天津 300459 2.同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 上海 200092）

近年來市政污泥產(chǎn)量隨污水處理規(guī)模而不斷攀升，以含水率為80%計算，預(yù)計到2025年，年污泥產(chǎn)量將超過6000萬噸[1]。剩余污泥高度親水，含水率高（95%～99%），且富含多種有機污染物、病原菌、重金屬等有毒有害物質(zhì)，同時伴有惡臭氣體，因此必須對剩余污泥進行妥善地處理處置[2]。

從資源角度看，剩余污泥中含有30%～60%的蛋白質(zhì)以及磷、鉀等營養(yǎng)元素，若加以分離則可作為有機肥、土壤調(diào)理劑、蛋白泡沫滅火劑等使用[3]。熱堿水解法作為一種高效的污泥蛋白質(zhì)分離技術(shù)，通過加壓、加熱、加堿等操作水解破壞污泥細胞壁和菌膠團，并分離濃縮獲取其中蛋白質(zhì)[4]，促使細胞膜破裂并釋放胞內(nèi)蛋白質(zhì)。酚抽提作為一種優(yōu)良的蛋白提取方法，提高了蛋白質(zhì)提取效率[5]。生物酶法利用酶的高效催化性能，對污泥細胞壁進行分解，從而析出胞內(nèi)蛋白質(zhì)[6]?；诖?，本研究探究超聲-化學(xué)藥劑-蛋白酶協(xié)同處理對污泥熱堿混合液中蛋白質(zhì)的二次提取效果，通過單因素控制變量試驗確定最佳蛋白酶種類和初始酶加量，并利用EPS和IS評估污泥的脫水性，旨在為實際工程運行提供參考和依據(jù)。

1.材料與方法

(1)污泥樣品和化學(xué)藥品

污泥混合液由天津某環(huán)?？萍脊咎峁?，取自熱堿工藝閃蒸處理出口，完整工藝流程及樣品來源如圖1所示。污泥混合液基本性質(zhì)包括：含水率94.8%～96.2%，pH為12.30～12.46。

圖1 熱堿工藝流程及污泥樣品示意圖

DNA提取酚試劑（pH＞7.8，上海索萊寶生物科技有限公司），水解酶包括中性蛋白酶（BR，50U/mg）、堿性蛋白酶（200U/mg）、木瓜蛋白酶（＞200U/mg）和胰蛋白酶（＞2500U/mg），均購置于上海麥克林生化科技有限公司。

(2)超聲-DNA提取酚試劑-蛋白酶水解污泥實驗

首先向容量為1L的燒杯中加入500mL的污泥混合液，加入30mL（體積分數(shù)6%）的DNA提取酚試劑，用玻璃棒快速攪拌3min并置于漩渦混合儀上混合30s以保證藥劑與污泥充分混合。隨后加入一定質(zhì)量比的蛋白酶，繼續(xù)置于漩渦混合儀上混合60s。待蛋白酶充分溶解后，將燒杯放于超聲清洗鍋（頻率40kHz，600W）中部進行超聲處理，時間20min，溫度38℃。反應(yīng)結(jié)束后將水解液于90℃水浴鍋中滅酶處理15min，然后離心處理，轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時間為10min，取上清液過0.45μm濾膜獲得蛋白質(zhì)濾液，并測定其蛋白質(zhì)濃度。

采用單因素控制變量實驗探討蛋白酶種類和初始酶加量（1000～6000U/g污泥混合液）兩種變量因素的影響。

(3)物質(zhì)提取及分析方法

EPS的提取采用熱提取法[7]，IS的提取采用熱Tris緩沖溶液法[8]；MLVSS的測定參照第四版《城市污水水質(zhì)檢驗方法標準》[9]；多糖濃度采用苯酚-硫酸法進行測定[10]；蛋白質(zhì)濃度的測定采用Frolund等[11]的改進型Lowery法進行測定；污泥IS中的TOC含量利用TN/TOC分析儀測定（島津、TOC V-CPN，5～50mg/L）。

2.結(jié)果與分析

(1)超聲-DNA提取酚試劑-蛋白酶協(xié)同水解單因素實驗研究

以單一超聲處理、超聲+DNA提取酚試劑、超聲+DNA提取酚試劑+中性蛋白酶三組進行控制變量實驗，結(jié)果如圖2所示。原樣中濾液蛋白質(zhì)平均質(zhì)量濃度為277.43mg/L，經(jīng)超聲破碎后質(zhì)量濃度增大至473.12mg/L，說明物理處理能有效促進污泥中蛋白質(zhì)的釋放。超聲處理強化了體系的聲空化作用，同時利用水力剪切力和瞬態(tài)空化加速了污泥細胞壁的裂解[12]。DNA提取酚試劑聯(lián)合超聲處理后，濾液蛋白質(zhì)平均質(zhì)量濃度進一步增大至712.57mg/L，證明了化學(xué)藥劑作用能夠在超聲處理基礎(chǔ)上增大對于污泥的破解程度。

圖2 超聲-DNA提取酚試劑-蛋白酶協(xié)同處理對濾液中蛋白質(zhì)濃度的影響

超聲、DNA提取酚試劑和中性蛋白酶聯(lián)合處理后，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度繼續(xù)增至794.86mg/L，略高于超聲協(xié)同DNA提取酚試劑組，相較于未處理組提高186.51%，這說明了酶的水解能夠與物理及化學(xué)作用相耦合，進一步促進微生物細胞壁的裂解，釋放出胞內(nèi)外物質(zhì)，從而達到蛋白質(zhì)提取的目的。

(2)協(xié)同水解蛋白酶單因素實驗研究

①蛋白酶種類對于污泥蛋白質(zhì)提取的影響

以外加的蛋白酶種類為變量因素，并維持超聲和DNA提取酚試劑處理條件不變，控制混合液的初始酶加量為3000U/g，結(jié)果如圖3所示。堿性蛋白酶組的濾液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度最高，平均為827.73mg/L，其次是中性蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的提取效果較差，表明不同蛋白酶具有不同的活性、作用位點以及與底物之間的相互作用，這均會導(dǎo)致對同一底物的水解效果具有明顯差異[12]。超聲+DNA提取酚試劑+胰蛋白酶或木瓜蛋白酶組濾液蛋白質(zhì)濃度低于超聲+DNA提取酚試劑處理組。

圖3 蛋白酶種類對協(xié)同處理后濾液中蛋白質(zhì)濃度的影響

②酶加量對于污泥蛋白質(zhì)提取的影響

如圖4所示，隨著初始酶加量由1000U/g逐漸增大至4000U/g，濾液中蛋白質(zhì)平均質(zhì)量濃度也提高至883.43mg/L，相較于未加入蛋白酶組提高23.98%。此后，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度隨著初始酶加量的增加而趨于平緩，在酶加量為6000U/g時平均質(zhì)量濃度為900.86mg/L，較4000U/g僅提高1.97%，這說明此時酶對污泥的水解能力已不再是提高蛋白質(zhì)濃度的限制性因素。因此最佳的初始酶加量應(yīng)設(shè)為4000U/g。

圖4 初始酶加量對協(xié)同處理后濾液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

(3)協(xié)同處理前后污泥脫水性和穩(wěn)定性評估

①EPS組分及含量分析

結(jié)果如圖5所示。協(xié)同處理前后S-EPS的平均濃度分別為1561.59mg/L和2864.01mg/L，遠高于LB-EPS和TB-EPS，這也說明經(jīng)過熱堿處理后的原污泥混合液中，微生物細胞和污泥膠體之間的吸附結(jié)合作用已被破壞，TB-EPS和LB-EPS被溶解及釋放，從而導(dǎo)致細胞中多糖和蛋白質(zhì)進入S-EPS中，而進一步地超聲-DNA提取酚試劑-堿性蛋白酶處理強化了這一現(xiàn)象。LB-EPS和TB-EPS的減少會促進污泥絮體水分的釋放和分離，因此處理后混合液的固液分離速率會大幅度提高。協(xié)同處理后，S-EPS中蛋白質(zhì)與多糖的平均比值為0.45，高于處理前，這也有利于維持污泥體系長期穩(wěn)定性。

圖5 協(xié)同處理前后污泥EPS組分和含量的變化

②IS含量分析

以IS含量為檢測指標，分析了污泥中微生物的活性，結(jié)果如圖6所示。污泥混合液中IS的濃度由54.16mgTOC/gVSS降至25.08mgTOC/gVSS，說明協(xié)同處理后污泥膠體中的微生物代謝作用進一步減緩，微生物細胞大量溶解或凋亡，從而釋放出蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，脫水性能得到改善。

圖6 協(xié)同處理前后污泥IS含量的變化

3.結(jié)論

（1）中性蛋白酶和堿性蛋白酶協(xié)同處理能促進對污泥蛋白質(zhì)的提取效果，其中最優(yōu)的蛋白酶種類為堿性蛋白酶。濾液蛋白質(zhì)含量隨初始酶加量先快速增大后趨于平緩。綜合蛋白質(zhì)含量、酶成本可確定最佳的酶加量為4000U/g，此時蛋白質(zhì)含量為883.43mg/L，較于未加入蛋白酶組提高23.98%。

（2）超聲-DNA提取酚試劑-堿性蛋白酶協(xié)同處理后，污泥混合液的S-EPS含量升高83.44%，LB-EPS和TB-EPS分別降低33.11%和24.95%，同時SEPS中蛋白質(zhì)與多糖的比值提高了100.40%，表明協(xié)同處理能夠有效提升污泥混合液的脫水性和穩(wěn)定性。