天農(nóng)麻雞脂肪沉積候選基因表達(dá)水平與腹脂率的相關(guān)性分析

李祥坤，曾道曙，羅超維，謝 莉，吳林溪，李 華，向 海

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東省動物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231）

隨著生長性能的遺傳改良和飼養(yǎng)水平的持續(xù)提高，優(yōu)質(zhì)雞生產(chǎn)面臨著腹部脂肪過度沉積的問題，導(dǎo)致雞肉品質(zhì)和飼料轉(zhuǎn)化效率下降。通過人工選擇培育體脂沉積量適中、群體均一度高的優(yōu)質(zhì)雞，是重要的發(fā)展方向。雞腹部脂肪沉積屬于中高等遺傳力性狀。篩選和鑒定顯著影響雞脂肪沉積水平的功能基因，開發(fā)新的分子標(biāo)記或潛在靶標(biāo)，是高效培育低腹脂沉積水平優(yōu)質(zhì)雞的重要途徑。目前，已有多個基因被報道參與調(diào)控脂肪的形成和分化，如過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma，）、轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1（Sterol Regulatory Element Binding Transcription Factor 1，）和-CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT Enhancer Binding Protein Alpha，）3 種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平與脂肪前體細(xì)胞分化顯著相關(guān)，并通過影響靶標(biāo)成脂基因的表達(dá)調(diào)節(jié)家雞機(jī)體的成脂過程。

研究發(fā)現(xiàn)，還可以通過介導(dǎo)脂肪酸合酶（Fatty Acid Synthase，）的表達(dá)，影響脂肪酸合成代謝通路進(jìn)而調(diào)節(jié)雞肝臟的脂肪代謝。另一方面，有研究報道雞腹部脂肪沉積水平與胰島素樣生長因子1（Insulin Like Growth Factor 1，）基因的SNP 位點(diǎn)c.-366A＞C和瘦素受體（Leptin Receptor，）突變體rs13684622（C1002R）有關(guān)。最近研究表明，?；o酶A 合成酶長鏈家族成員1（Acyl-CoA Synthetase Long-Chain Family，）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4（Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 4，）、磷脂酸磷酸酶1（Lipin1，）和等基因的甲基化修飾，通過調(diào)節(jié)脂肪酸合成和代謝通路水平影響雞的腹脂沉積。

天農(nóng)麻雞作為清遠(yuǎn)麻雞的商品代，在優(yōu)質(zhì)雞市場受到消費(fèi)者的廣泛歡迎，然而生長后期腹脂快速沉積嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)效益。本研究以上市天齡不同腹脂沉積水平的天農(nóng)麻雞為研究對象，利用qRT-PCR 方法定量檢測腹部脂肪組織中多個與脂肪沉積相關(guān)基因的表達(dá)水平，探討這些基因與天農(nóng)麻雞腹部脂肪沉積的關(guān)系，以期為天農(nóng)麻雞腹脂沉積性狀的遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本 實(shí)驗(yàn)動物選自廣東天農(nóng)食品集團(tuán)股份有限公司提供的200 只商品代天農(nóng)麻雞母雞，在相同條件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)至126 日齡，然后在溫度約10℃的室內(nèi)屠宰和分離腹部脂肪，對腹脂稱重后立即取少量組織于無酶凍存管并立即置于干冰中密封暫存，后轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆?。屠宰程序按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB13078-2001 和GB/T17237-1998）和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY5148-2002-NY5151-2002）進(jìn)行。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)篩選出與雞脂肪合成和沉積相關(guān)的10 個功能基因，以為內(nèi)參，使用Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）設(shè)計(jì)跨外顯子的熒光定量引物，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。基因信息和引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.3 RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)腹脂率對所有實(shí)驗(yàn)個體排序，隨機(jī)選擇不同腹脂率的32 個個體，使用南京諾唯贊（Vazyme）生物科技有限公司FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Mini Kit 提取腹脂組織的總RNA，并利用核酸濃度測定儀對總RNA 進(jìn)行初步質(zhì)檢。利用諾唯贊HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下：總反應(yīng)體系20 μL，1 μL 總RNA，4 μL 4 × gDNA wiper Mix，11 μL RNase-free ddHO，4 μL 5 × HiScript III qRT SuperMix。PCR 反應(yīng)條件為：42 ℃2 min，37 ℃15 min，85℃5 s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 qRT-PCR 檢測 利用諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 進(jìn)行熒光定量qPCR 檢測，反應(yīng)體系如下：10 μL 2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL Primer1（10 μmol/L），0.4 μL Primer2（10 μmol/L），0.8 μL cDNA，8.4 μL RNase Free ddHO，總反應(yīng)體系共20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃預(yù)變性5 s，60℃退火/延伸15 s，40 個循環(huán)。熔融曲線分析：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用qRT-PCR CT 值比較法（2）計(jì)算候選基因相對表達(dá)水平。CT 值為熒光量與熒光閾值線交叉時的循環(huán)數(shù)。計(jì)算公式如下：

采用Excel 軟件計(jì)算腹脂率和基因表達(dá)量均值，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤格式展示，利用SPSS 20.0 軟件（SPSS Science,Chicago，IL，USA）雙變量相關(guān)分析計(jì)算腹脂率和基因表達(dá)量的相關(guān)性（Pearson 相關(guān)系數(shù)）以及單因素方差分析Duncan's 法計(jì)算極端組間基因表達(dá)量的顯著差異性，運(yùn)用GraphPad Prism 8.2.1 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 候選基因表達(dá)水平及其與腹脂率的相關(guān)性分析 本研究通過qRT-PCR 檢測了10 個脂肪沉積候選基因在32 只天農(nóng)麻雞腹部脂肪中的表達(dá)水平。分別計(jì)算10個候選基因的表達(dá)量與腹脂率的pearson 相關(guān)性系數(shù)發(fā)現(xiàn)（表2），基因表達(dá)量與腹脂率相關(guān)性最高（=0.448），呈極顯著正相關(guān)；和基因次之（分別為0.409 和0.365），均呈顯著正相關(guān)；基因表達(dá)量與腹脂率相關(guān)性較高（=0.339）并呈正相關(guān)（=0.058），其余6 個基因表達(dá)量與腹脂率相關(guān)性較低（=-0.172～0.167）且均未達(dá)顯著水平（＞0.1）。

表2 腹脂率與各基因表達(dá)水平相關(guān)性分析

2.2 候選基因表達(dá)水平在不同腹脂沉積水平組間的比較根據(jù)腹脂率高低將天農(nóng)麻雞分成4 組（表3）：高脂組（腹脂率6.19%～4.64%，HH）、偏高脂組（4.47%～2.98 %，MH）、偏低脂組（2.96%～2.43 %，ML）和低脂組（2.42%～1.03 %，LL），其中高脂組腹脂率是低脂組的3.07 倍，偏高脂組腹脂率是低脂組的1.98 倍，偏低脂組腹脂率是低脂組的1.46 倍，另外兩兩組別之間的腹脂率比值分別為：1.55 倍（HH/MH）、1.36 倍（MH/ML）、1.46倍（ML/LL）。

表3 高低腹脂率分組表

比較候選基因在梯度腹脂沉積水平組間的表達(dá)模式（圖1），可見基因和基因的表達(dá)量隨著腹脂率降低而呈現(xiàn)由高至低的趨勢，提示其可能在調(diào)控脂肪沉積上發(fā)揮一定作用。在HH 組中表達(dá)量較高，在其他3 組中表達(dá)水平相當(dāng)；基因則在LL 組中表達(dá)量較高，在其他3 組中表達(dá)水平相當(dāng)，提示這2 個基因的表達(dá)水平對天農(nóng)麻雞腹脂沉積的影響可能存在一定的閾值效益。

圖1 高脂、偏高脂、偏低脂和低脂組腹脂樣品中基因的相對表達(dá)水平示意圖

2.3 高腹脂率與低腹脂率組間基因表達(dá)水平顯著性分析為了進(jìn)一步分析候選基因的表達(dá)量規(guī)律，按照腹脂率從高到低選取腹脂率最高的12 個體（H）和最低的12 個體（L）作為2 個極端組進(jìn)行基因表達(dá)量顯著性分析（圖2）。H 組平均體重為1 351.26 g，腹脂率5.05%，L 組平均體重為1 302.63 g，腹脂率2.04%，H 組腹脂率是L 組腹脂率的2.48 倍。結(jié)果顯示，和基因表達(dá)量在兩極端組間差異顯著；其余基因表達(dá)量在兩極端組間差異不顯著（＞0.05）。

圖2 極端組腹脂樣品中的相對表達(dá)水平示意圖

3 討 論

脂肪沉積性狀是優(yōu)質(zhì)雞肉品質(zhì)評價的重要指標(biāo)。減少腹部脂肪沉積，降低腹脂率是天農(nóng)麻雞生產(chǎn)中亟待解決的重要問題。本研究結(jié)果表明，高脂組腹脂率是偏高脂組的1.55 倍，偏高脂組腹脂率是偏低脂組的1.35 倍，偏低脂組腹脂率是低脂組的1.45 倍，同時部分候選基因的表達(dá)水平在梯度腹脂沉積水平組間呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，其中基因和基因表達(dá)量均在HH、MH、ML 和LL 組中依次降低，說明這4 個候選基因可能在天農(nóng)麻雞腹脂沉積性狀中發(fā)揮穩(wěn)定的調(diào)控作用。

是配體激活轉(zhuǎn)錄因子的核受體家族成員，是哺乳動物和鳥類脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子，其不僅促進(jìn)胚胎期脂肪細(xì)胞增殖，而且在脂肪分化過程中也有關(guān)鍵調(diào)控作用。研究表明，直接與轉(zhuǎn)錄中介體亞基1（Mediator Complex Subunit 1，）結(jié)合促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞生成，還能通過結(jié)合PR 結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白16（PR Domain Zinc Finger Protein 16，）的鋅指結(jié)構(gòu)域激活的轉(zhuǎn)錄功能，進(jìn)一步促進(jìn)棕色脂肪的合成。本研究中，在不同腹脂率天農(nóng)麻雞腹脂組織中的表達(dá)量趨勢與孟和和王麗的結(jié)果一致，提示其可能對天農(nóng)麻雞腹脂沉積的調(diào)節(jié)作用具有一定的理論依據(jù)。

為了進(jìn)一步研究候選基因表達(dá)水平與天農(nóng)麻雞腹脂率之間的關(guān)系，本研究將腹脂率與基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，鑒定出和的表達(dá)量與腹脂率呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性。接著選取腹脂率最高的12 個體（H）和最低的12 個體（L）作為2 個極端組對10 個候選基因表達(dá)量進(jìn)行組間顯著性分析，發(fā)現(xiàn)和的表達(dá)量在極高、極低組中均差異顯著。另外，和基因在兩極端組中的表達(dá)量趨勢符合它們在機(jī)體內(nèi)的作用，也符合先前的報道結(jié)果。

基因是水解VLDL（極低密度脂蛋白）中TG（甘油三酯）的主要酶，是參與脂肪代謝的關(guān)鍵酶，也是脂肪細(xì)胞中甘油三酯衍生脂肪酸吸收和存儲的限速酶。禁食實(shí)驗(yàn)表明，大鼠肝臟基因表達(dá)量升高，但是在饑餓大鼠腹脂中基因表達(dá)量下降，在饑餓處理之后重新投食的綿羊和奶牛的腹脂中又升高，基因的表達(dá)在脂肪沉積中具有很強(qiáng)的組織特異性和物種特異性。本研究中，基因表達(dá)量在高脂組腹部脂肪中高于低脂組，這一結(jié)果與前人報道雞腹脂基因mRNA 表達(dá)水平與腹脂率呈顯著正相關(guān)（＜0.05）一致?；?qū)儆赑AT 蛋白家族成員，是脂滴表面主要結(jié)構(gòu)蛋白，其調(diào)控脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和脂肪沉積，并且維持著脂滴的形成和保護(hù)脂滴免受水解。Souza 等用過量表達(dá)的Peri A 和Peri B 阻礙3T3-L1 細(xì)胞系中腫瘤壞死蛆因子增加脂解功能的發(fā)揮，證明了可以保護(hù)脂滴免受水解。而當(dāng)被蛋白激酶A（PKA）磷酸化，會沖破阻擋脂肪酶接觸脂滴的屏障，從而分解TG，因此控制磷酸化是脂肪分解的重要開關(guān)。本研究基因表達(dá)量在高脂組腹部脂肪中高于低脂組，與趙小玲的研究結(jié)果相似?；蛴址Q脂肪和肥胖相關(guān)基因，是人類發(fā)現(xiàn)的第一個與非病理性肥胖相關(guān)的基因。小鼠缺失導(dǎo)致出生后生長遲緩，脂肪組織和體重顯著減少，還通過控制能量消耗在功能上參與能量穩(wěn)態(tài)，突變導(dǎo)致小鼠血清水平降低，以及的過度表達(dá)引起小鼠食物攝入量增加，導(dǎo)致肥胖。據(jù)前人研究報道，基因在動物脂肪組織中高表達(dá)，但在母雞腹部脂肪中研究較少。本研究結(jié)果顯示，基因在極端高脂組中表達(dá)量高于極端低脂組并呈顯著差異，表明基因可能在天農(nóng)麻雞母雞腹脂中起著脂肪沉積調(diào)控作用。也有報道基因在人皮下脂肪組織中存在脂肪分解作用，但是其在物種和脂肪組織區(qū)域之間存在著差異性，具體的調(diào)控作用需要更進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

、、和表達(dá)量隨腹脂率增加而逐漸高表達(dá)，其中、和表達(dá)量與腹脂率呈顯著正相關(guān)且表達(dá)量在極端組間差異顯著，可能是正向調(diào)節(jié)天農(nóng)麻雞腹部脂肪沉積的重要候選基因。