m6A 甲基化修飾及其影響動物脂肪生成的分子機制研究進展

宋興亞，彭 巍，劉 賢，姚 治，張子敬，雷初朝，王二耀，黃永震*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海大學，青海西寧 810016；3.河南省畜牧總站，河南鄭州 450008；4.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002）

RNA 表觀遺傳修飾是轉(zhuǎn)錄后水平對RNA 調(diào)控的關鍵所在，發(fā)生在轉(zhuǎn)錄組中，對于動物體內(nèi)多種生命進程發(fā)揮著極其重要的作用?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)了170 余種RNA 修飾，能夠改變RNA 中所含堿基的電荷以及堿基配對特性，使RNA 發(fā)生空間構象上的變化。mA 甲基化修飾在真核生物mRNA 的甲基化修飾形式中豐度最高，是目前RNA 表觀遺傳修飾的熱門研究方向之一。本文綜述了mA 甲基化修飾和脂肪生成的基本過程以及mA 甲基化修飾影響脂肪生成的機制，以期為研究動物脂肪調(diào)控提供新思路。

1 m6A 甲基化修飾概述

mA 甲基化修飾是指發(fā)生在RNA 中腺苷酸第6 位N 通過甲基轉(zhuǎn)移酶催化形成的甲基化修飾，其出現(xiàn)在高度保守的序列上，主要發(fā)生在RRACH（R 為A/G；A 為mA 甲基化修飾位點；H 為A/U/C）序列的腺嘌呤上，且其主要分布在終止密碼子附近、3’-非翻譯區(qū)（3'-UTRs）、mRNA 外顯子及編碼區(qū)（CDS）。mA 甲基化修飾主要依靠甲基轉(zhuǎn)移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和結(jié)合蛋白（Readers）多種蛋白共同調(diào)控來完成，圖1 較為直觀地呈現(xiàn)了這一過程，并包括了mA 酶系統(tǒng)的主要成員和其各自發(fā)揮的作用。

圖1 m6A 甲基化修飾酶系主要蛋白及分子機制示意圖[10]

1.1 mA 酶系統(tǒng)

1.1.1 甲基轉(zhuǎn)移酶 mA 修飾由甲基轉(zhuǎn)移酶復合體（MTC）所介導，也被稱為甲基轉(zhuǎn)移酶。其中的主要成分有甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）、METTL14、METTL16、RNA 結(jié)合模體蛋白15（RBM15）、成腎細胞瘤1-結(jié)合蛋白（WTAP）、CCCH 型鋅指蛋白13（ZC3H13）等。

METTL3、METTL14 和WTAP 是甲基轉(zhuǎn)移酶復合體中的重要組分。METTL3 是在哺乳動物中第1 個被鑒定出來的mA 甲基轉(zhuǎn)移酶，其對應的基因高度保守，在大量不同物種中都存在其同源蛋白。METTL14 可與METTL3 等比例形成二聚體，相互之間起到協(xié)同作用，增強兩者的催化能力。WTAP 再與METTL3 和METTL14 的二聚體結(jié)合形成復合體，加快mA 甲基化進程，并對該過程進行動態(tài)調(diào)控。有研究表明，WTAP對胚胎發(fā)育起著非常重要的作用，其缺失會引起細胞分化能力減弱甚至喪失，使胚胎無法存活。敲除小鼠胚胎干細胞中的基因，顯著降低了mRNA 整體的mA 水平，并且影響干細胞的自我修復，進而影響干細胞分化。

1.1.2 去甲基化酶 去甲基化酶的催化作用實現(xiàn)了RNA主動完成去甲基化過程。去甲基化酶主要包括同屬于AlkB 家族的肥胖關聯(lián)蛋白（FTO）、AlkB 同源蛋白5（ALKBH5）、ALKBH1 和ALKBH3?；虮话l(fā)現(xiàn)之初，人們把它當作肥胖關聯(lián)基因，之后研究發(fā)現(xiàn)FTO 也在mA 甲基化修飾中發(fā)揮著去甲基化酶的功能，且FTO 是最早被發(fā)現(xiàn)的mA 去甲基化酶，該發(fā)現(xiàn)證實了mA 甲基化修飾這一過程是可逆的。FTO 廣泛存在于全年齡段生命的組織細胞中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達水平尤其高，能夠有效去除mRNA 上的mA 修飾；ALKBH5 存在于大部分組織的細胞核內(nèi)，通過調(diào)控mRNA 運輸過程發(fā)揮其去甲基化的作用。有研究表明，這些去甲基化酶都是通過相同的途徑發(fā)揮作用，即先把mA 氧化為N-羥甲基腺苷（hmA），然后轉(zhuǎn)變?yōu)镹-甲酰腺苷（fA），最后變?yōu)橄佘铡?/p>

1.1.3 結(jié)合蛋白 含有mA 甲基化修飾的蛋白質(zhì)若想行使其特殊的功能，需要先與結(jié)合蛋白結(jié)合，才能實現(xiàn)其特定的功能。已知哺乳動物中存在的mA 結(jié)合蛋白主要包括YTH 結(jié)構域包含蛋白（YTHDC）、核不均一核糖核蛋白（hNRNPs）、胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白（IGF2BPs）和真核起始因子3（elF3）等。有研究證明，YTH 結(jié)構域通過特異性識別達到結(jié)合蛋白與mRNA 上的mA 位點特異性結(jié)合的目的，使結(jié)合蛋白發(fā)揮相應的功能，從而對mRNA 的選擇性剪接與結(jié)構改變進行直接調(diào)控或間接調(diào)控。

1.2 mA 在動物中的生物學功能 mA 甲基化修飾在動物的轉(zhuǎn)錄組中廣泛存在，使得生長發(fā)育、癌癥治療、畜禽育種等多領域工作者對mA 甲基化修飾的關注度提高，mA 更多的生物學功能也逐漸浮現(xiàn)在大眾的視野當中。

1.2.1 調(diào)控干細胞分化 細胞分化是生物生長發(fā)育最重要的生命過程之一，而多種發(fā)育調(diào)控因子對應的mRNA 的穩(wěn)定性與mA 甲基化修飾的水平呈負相關，Geula 等研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠胚胎干細胞中的基因，細胞中的mA 甲基化修飾水平降低，胚胎干細胞的自我更新能力和分化能力也隨之受到抑制，胚胎的早期發(fā)育會極度受限，導致死亡。

1.2.2 調(diào)控器官發(fā)育 在所有器官中，大腦是mA 甲基化修飾水平及其相關蛋白表達豐度最高的器官之一。有研究表明，敲除小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的基因會高度抑制大腦皮層及小腦發(fā)育，而敲除基因會嚴重影響大腦皮質(zhì)發(fā)育。

1.2.3 影響癌癥發(fā)生 mA 甲基化修飾在癌癥發(fā)生的過程中扮演著極其重要的角色。METTL14 在急性骨髓白血?。ˋML）中抑制AML 細胞系的終末髓樣分化，并促進其增殖，通過對致癌基因與的mA 甲基化修飾水平進行調(diào)控使其發(fā)揮致癌作用。Barbieri等研究證明，啟動子結(jié)合的METTL3 在相關mRNA對應的編碼區(qū)內(nèi)誘導 mA 甲基化修飾，并通過緩解核糖體停滯來加強其翻譯，從而影響急性骨髓白血病的發(fā)展，該研究將甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3 確定為AML 的潛在治療靶點。

1.2.4 影響生殖性能 Yuan 等運用全基因組關聯(lián)分析（GWAS）篩選出包括去甲基酶ALKBH5 在內(nèi)的許多候選基因會對小鼠睪丸的大小和發(fā)育產(chǎn)生較大影響。mA 的高水平存在是弱精子癥的危險因素并影響精子活力，而甲基轉(zhuǎn)移酶，尤其是 METTL3，在增加精子RNA 中的mA 含量方面起著關鍵作用。

1.2.5 影響肌肉發(fā)育 丁浩等通過對比雞骨骼肌細胞各個時期去甲基化酶基因和的表達水平，以及對應時期mA 甲基化修飾水平，推測ALKBH5 和FTO 可能通過調(diào)控mA 水平來影響雞的骨骼肌發(fā)育。

2 動物脂肪生成概述

動物的脂肪組織主要分布在機體的皮下、肌肉組織或內(nèi)臟周圍等。皮下過多地生成脂肪會大幅降低動物的飼料轉(zhuǎn)化率，進而影響畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。而脂肪含量與肉產(chǎn)品質(zhì)量存在密切關系，會影響動物肉質(zhì)的色澤、風味以及嫩度等，因此調(diào)節(jié)不同部位的脂肪組織生成與沉積一直是肉用動物研究的熱門。

2.1 脂肪細胞生成過程 脂肪細胞是由起源于中胚層的間充質(zhì)干細胞分化而來，其生成需要經(jīng)過以下幾個步驟：首先由多能的間充質(zhì)干細胞“定型”分化專能的前脂肪細胞，然后前脂肪細胞再向脂肪細胞進行“終末分化”，最后以聚酯的形式形成成熟的脂肪細胞。脂肪細胞的生長包括脂肪細胞數(shù)量的積累以及體積的變化。成熟的脂肪細胞不具備分裂和分化的功能，因此脂肪細胞數(shù)量上的積累是依靠前體脂肪細胞的增殖分化來完成，而脂肪細胞體積的增大主要是因為胞內(nèi)甘油三酯含量升高所導致。

2.2 脂肪細胞生成的調(diào)控因子 在脂肪生成和分化的過程中，許多調(diào)控因子發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用，如過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）、CCAAT/ 增強子結(jié)合蛋白（C/EBPs）等。PPAR是脂肪生成和調(diào)控的主要作用因子之一，脂肪細胞中激活的PPAR保證了脂肪細胞因子（脂聯(lián)素和瘦素）的平衡和充分分泌，同時在機體內(nèi)的糖脂代謝和胰島素信號傳導也扮演著重要角色。對于C/EBP，它是C/EBPs 異構體之一，其表達對自身有著正反饋效應，即C/EBP表達增多后，可誘導自身表達，形成正反饋。同時，數(shù)據(jù)匯總的結(jié)果顯示，缺乏PPAR的成纖維細胞即使在添加了高水平C/EBP的情況下仍無法向脂肪細胞分化，由此可得，C/EBP在脂肪生成中發(fā)揮的作用是輔助PPAR完成成脂過程。

3 m6A 甲基化修飾影響脂肪生成的機制

mA 會對動物機體的脂肪生成產(chǎn)生影響，主要是去甲基化酶FTO、甲基轉(zhuǎn)移酶復合體及其組分METTL3、mA 結(jié)合蛋白IGF2BP1 以及其他重要成脂基因通過mA 甲基化修飾在動物脂肪生成中發(fā)揮作用。

3.1 FTO 表達水平與脂肪生成呈正相關 依賴于去甲基化酶FTO 的mA 脫甲基過程不僅是mRNA 修飾加工的新機制，該過程在脂肪分化、形成的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著尤為關鍵的作用。

Zhao 等運用基因組學、細胞生物學技術等生物技術發(fā)現(xiàn)mA 酶體系中的重要組分——FTO 缺失會阻礙前體脂肪細胞（3T3-L1）的分化：在3T3-L1 分化過程中，mA 修飾區(qū)域集中在外顯子剪切位點附近，并且和mRNA 剪接加工的重要元件SR 蛋白結(jié)合序列具有空間重疊性；干擾表達可以增加富含絲氨酸/精氨酸剪接因子（SRSF2）對RNA 的結(jié)合能力，促進SRSF2靶基因的外顯子保留，這一過程在圖2 中有詳細說明；FTO 調(diào)控剪接位點附近的mA 甲基化修飾水平來控制成脂調(diào)節(jié)因子RuNt 相關轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位1（RUNX1T1）的剪切產(chǎn)物，調(diào)控了3T3-L1 的分化。脂肪形成的過程中，F(xiàn)TO 的表達水平與mA 修飾水平成反比，F(xiàn)TO的活性降低會阻止成脂過程，只有具有催化活性的FTO才能激發(fā)脂肪的形成。

圖2 FTO 依賴性m6A 甲基化修飾和SRSF2 介導的RUNX1T1 的可變剪接示意圖[26]

Jiao 等通過構建基因敲除和過表達的前體脂肪細胞3T3-L1，對比分析得出FTO 可抑制3T3-L1 細胞增殖，并使線粒體膜電位和ATP 水平降低；實驗還檢測了幾種脂質(zhì)代謝相關轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，結(jié)果顯示敲除后，除抑制了AKT 磷酸化和4 型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT4）的表達之外，還降低了PPAR的表達水平。Wang 等敲除小鼠基因，發(fā)現(xiàn)自噬相關蛋白5（ATG5）與自噬相關蛋白7（ATG7）的表達降低，YTHDF2 與mA 甲基化修飾水平較高的ATG5 與ATG7 mRNA 結(jié)合，導致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被降解，蛋白質(zhì)表達減少，從而抑制了自噬與脂肪形成。為確定YTHDF2 是否是FTO 在3T3-L1 細胞形成脂肪中發(fā)揮作用的主要因素，實驗進行沉默，結(jié)果顯示與對照細胞相比，細胞周期蛋白A2（CCNA2）和細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）的mRNA 水平升高，G1 期和S 期細胞周期阻滯消失，G2 期細胞數(shù)量明顯增多，并且沉默會使敲除給成脂標記物PPAR，C/EBP和脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）帶來的抑制作用減小或逆轉(zhuǎn)。表明FTO 與YTHDF2 協(xié)同作用通過影響甲基化介導CCNA2 和CDK2 的表達途徑，進一步調(diào)控細胞周期和脂肪生成過程。

3.2 METTL3 表達水平與脂肪生成呈負相關 Yao 等通過進行qPCR 與Western blots 技術，發(fā)現(xiàn)沉默基因可顯著促進豬骨髓間充質(zhì)干細胞（pBMSC）的成脂分化：當METTL3 受到干擾時，JAK1 mRNA 的mA修飾水平下降，從而使其mRNA 的穩(wěn)定性得到增強，激活了Janus 激酶1（JAK1）/ 信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄因子5（STAT5）/C/EBP途徑，使得脂肪生成增多，同時成脂標記物PPAR、C/EBP和FABP4 的表達受到激發(fā)，表達水平升高；相反，細胞中METTL3 的過表達明顯抑制了pBMSC 的脂肪生成：當METTL3 過表達時，觀察到脂質(zhì)滴減少，并且成脂標記物PPAR，C/EBP和FABP4 被明顯抑制。

Kobayashi 等通過單獨敲除或過表達WTAP、METTL3 和METTL14，發(fā)現(xiàn)這三種組分協(xié)同工作，生成的甲基轉(zhuǎn)移酶復合體通過影響在促進脂肪細胞分化的有絲分裂擴增（MCE）過程中的細胞周期來正向調(diào)控脂肪形成。

3.3 IGF2BP1 表達水平與脂肪生成呈正相關 IGF2BP1是mA 甲基化修飾的“reader”，屬于單鏈RNA 結(jié)合蛋白，可以與胰島素樣生長因子2（IGF2）mRNA的5' UTR 結(jié)合并調(diào)節(jié)IGF2 的翻譯，在細胞內(nèi)多個過程中都發(fā)揮著重要作用。已有研究表明IGF2 的過表達與兒童肥胖相關，IGF2 降低了脂肪細胞中胰島素受體的 mRNA 表達，并下調(diào)了胰島素受體亞型A（IR-A）和GLUT4 的豐度以及內(nèi)臟脂肪細胞中相應的葡萄糖攝取。IGF2 在小鼠肝臟的過表達會降低體脂。Chen等研究其結(jié)合蛋白IGF2BP1 與雞脂肪生成的關系，結(jié)果顯示IGF2BP1 可以促進脂肪細胞的增殖和分化，其過表達會增加脂質(zhì)滴含量。并且在雞肝相關細胞系Leghorn 株M 雞肝癌（LMH）細胞中的異位表達表明，IGF2BP1 可以調(diào)節(jié)與脂肪酸代謝相關的基因的表達，促進脂肪細胞增殖分化，增加脂滴積累。

3.4 其他成脂相關基因的mA 甲基化修飾影響脂肪生成線粒體載體同源物2（MTCH2）是一種線粒體外膜蛋白，MTCH2 高表達水平細胞具有更強的脂肪沉積能力。Jiang 等從金華豬的背最長肌中已知脂質(zhì)氧化代謝相關的102 個mA 甲基化修飾基因選出mA 水平差異最顯著的，研究其mA 甲基化修飾水平對金華豬脂肪生成的影響，結(jié)果顯示高水平的mA 甲基化修飾可以促進金華豬肌內(nèi)前體脂肪細胞分化過程中的表達，可能是通過增強自身mRNA 的翻譯，促進對應蛋白的表達，從而促進脂肪生成。Jiang 等的研究僅在組中發(fā)現(xiàn)敲除基因會減少MTCH2蛋白的水平，而在同義的mA 位點突變組中沒有發(fā)現(xiàn)，基因的過表達會增加MTCH2 蛋白的水平；后續(xù)通過RIP 實驗揭示了YTHDF1 和MTCH2 mRNA 之間的直接相互作用，表明由mA 介導的翻譯依賴于mA 結(jié)合蛋白——YTHDF1（圖3）。

圖3 MTCH2 以m6A-YTHDF1 依賴性機制促進肌內(nèi)脂肪生成示意圖[38]

4 小 結(jié)

隨著RNA 表觀遺傳學不斷發(fā)展，mA 甲基化修飾更多的生物學功能逐漸被發(fā)掘出來，其在組織器官發(fā)育、細胞分化、癌癥發(fā)生及脂肪生成等方面都扮演著不可或缺的角色。就現(xiàn)有研究看來，mA 相關調(diào)節(jié)蛋白影響脂肪生成主要是依靠其與RNA 相結(jié)合來發(fā)揮功能，其關鍵作用意味著它們對應的基因有望成為調(diào)節(jié)畜禽機體脂肪含量的篩選位點，但其中還存在著一些值得深入思考的地方：一些成脂基因在不同物種中具有序列保守性，那么這些基因發(fā)生mA 甲基化修飾產(chǎn)生的影響是否具有結(jié)果的一致性；同種動物不同組織器官的mA 甲基化修飾水平存在差異，是否與該部位的脂肪含量呈一致性。若能通過mA 甲基化修飾水平來調(diào)控畜產(chǎn)品中的脂肪含量，將會助力畜牧生產(chǎn)向前跨進一大步，這對于科研工作者來說仍是一項巨大的挑戰(zhàn)，研究前景一片光明。