高效液相色譜法同時測定丹參藥材和飲片中莧菜紅、胭脂紅、金胺O含量*

張 華，朱澤兵，馬英杰，陽文武

（重慶市萬州食品藥品檢驗所·三峽庫區(qū)道地藥材開發(fā)利用重慶市重點實驗室，重慶 404000）

丹參是唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩功效，主治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)等癥［1］。丹參藥用歷史悠久，用途廣泛，為大宗常用中藥，還是國家衛(wèi)生健康委員會公布的“保健食品”品種。藥理實驗證明，丹參水溶性成分具有抗氧化、抗菌和治療心腦血管疾病的功效，故丹參為預(yù)防和治療心腦血管疾病的常用藥［2-7］。莧菜紅、胭脂紅、金胺O均為人工合成色素，其色系與丹參顏色相近，極易用于丹參藥材與飲片的染色。但這3種色素服用過量會危害人體健康。含有莧菜紅的物品長期食用有致癌性，尤其對嬰幼兒傷害極大；胭脂紅毒理學(xué)實驗顯示其具有一定致癌和致突變作用；金胺O對皮膚黏膜有輕度刺激作用，可引起結(jié)膜炎、皮炎和上呼吸道刺激癥狀，長期過量食用，將對人體腎臟、肝臟造成損害甚至致癌［8］。近年來，中藥材中擅自添加色素及飲片染色問題依然嚴(yán)重［9］。《2019年全國中藥材及飲片質(zhì)量分析報告》指出，丹參、五味子、朱砂等部分市售品種存在染色現(xiàn)象［10］。目前，檢測中藥材或飲片中非法染色的研究較多［11-13］，但尚未見同時檢測丹參中莧菜紅、胭脂紅、金胺O 3種常見合成色素方法的報道。為了提高丹參的質(zhì)量和保障臨床安全用藥，本研究中建立了同時檢測丹參藥材和飲片中莧菜紅、胭脂紅、金胺O含量的高效液相色譜法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有二極管陣列（SPD）檢測器；KH-2000DB型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為800 W，頻率為40 kHz）；SQP型分析天平（德國Sartorius公司，精度為0.0001 g）；SCI-20-D型超純水機(jī)（重慶科潤水處理設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，北京迪馬科技有限公司）；乙酸銨（優(yōu)級純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號為19001），胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號為19001），金胺O標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號為19002），均購自中國計量科學(xué)研究院標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究與管理中心，質(zhì)量濃度均為1000 μg/mL；丹參藥材（編號為1-2），產(chǎn)自四川和河南，經(jīng)重慶市萬州食品藥品檢驗所張德偉副主任中藥師鑒定均為正品；丹參飲片（編號為3-23），樣品信息見表1。

表1 丹參飲片樣品信息Tab.1 Information of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma Pieces Samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：中譜紅RD-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.05 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：512 nm（莧菜紅和胭脂紅），432 nm（金胺O）；進(jìn)樣量：10 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 Program of gradient elution of mobile phase

2.2 溶液制備

分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，配制成質(zhì)量濃度分別為1，5，10，20，50 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取樣品1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ蕿?50 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液各適量，置同一容量瓶中，混勻，即得加標(biāo)供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2項下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)供試品溶液和供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果目標(biāo)化合物分離度良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Amaranth 2.Carmine 3.Auramine OA.Mixed standard solution B.Test solution adding mixed standard solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取2.2項下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、待測成分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表3，表明莧菜紅、胭脂紅、金胺O的質(zhì)量濃度在1～50 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定：取樣品1 g，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加入較低質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加甲醇溶解并定容，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比為3∶1和10∶1時的質(zhì)量濃度確定檢測限和定量限。結(jié)果見表3。

精密度試驗：取2.2項下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為10 μg/mL），按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，結(jié)果見表3，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一加標(biāo)供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，20，24 h時按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各化合物峰面積的RSD。結(jié)果見表3，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 方法學(xué)考察結(jié)果Tab.3 Results of the methodological investigation

加樣回收試驗：取樣品6份，精密稱定，分別精密加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，以加標(biāo)前后所測定含量計算各色素的加樣回收率。結(jié)果見表4，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表4 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品檢測

取丹參藥材（編號為1-2）和飲片（編號為3-23），按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果僅編號為1和2的樣品檢出金胺O，含量分別為0.16 mg/kg和0.21 mg/kg，其余樣品中均未檢出或檢出量低于定量限，未發(fā)現(xiàn)非法添加情況，但不排除存在其他安全隱患。

3 討論

3.1 色譜條件考察

通過單因素試驗對色譜柱（中譜紅RD-C18柱、Diamonsil C18柱、Sepax C18柱和Inertsustain C18柱），柱溫（25，30，35℃），進(jìn)樣量（10，15，20 μL），流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）及流動相系統(tǒng)（甲醇-0.05 mol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.05 mol/L乙酸銨溶液、甲醇-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液和甲醇-水溶液）進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇2.1項下色譜條件時各成分分離度良好，色譜峰峰形呈正態(tài)分布。同時，采用SPD檢測器對各標(biāo)準(zhǔn)溶液于190～800 nm波長范圍內(nèi)掃描發(fā)現(xiàn)，莧菜紅和胭脂紅于512 nm波長附近有最大吸收；金胺O于432 nm波長附近有最大吸收，而于512 nm波長處吸收較弱。為保證各待測成分均能得到較好響應(yīng)，且減少干擾峰，最終確定2.1項下色譜條件。

3.2 樣品前處理優(yōu)化

本研究中對不同提取溶劑（水、30%甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇），浸泡時間（0，30，40，60 min），提取方法（超聲提取和加熱回流提?。?，超聲提取時間（20，30，40 min）進(jìn)行了考察，最終確定以甲醇超聲處理30 min為樣品提取條件。

3.3 方法評價

本方法操作簡便快捷、適用范圍廣、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于丹參藥材和飲片中3種合成色素非法染色的快速篩查，有助于更好地控制丹參的質(zhì)量，保障其臨床安全用藥。