罌粟殼炮制前后無機元素含量差異及地域分布特點*

徐繼軍，張明童，李冬華，宋平順，馬 瀟

（甘肅省藥品檢驗研究院·甘肅省中藏藥檢驗檢測技術(shù)工程實驗室·國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

罌粟殼為罌粟科植物罌粟Papaver somniferumL.的干燥成熟果殼［1］，可鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳和止瀉［2-3］。罌粟殼含有生物堿類、糖類及其衍生物等化學(xué)成分［4］，其中生物堿嗎啡久服易成癮，是唯一按麻醉藥品管理的中藥飲片［5］，故臨床為減輕其毒副作用多采用炮制品或配伍使用。目前，對中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究多以有機物質(zhì)為主，忽視了無機物質(zhì)在其中發(fā)揮的作用。現(xiàn)代研究認(rèn)為，中藥功效的發(fā)揮是有機成分和無機成分的協(xié)同作用［6］，且微量元素在中藥活性的表達(dá)中起著重要作用［7-8］。中藥的無機元素變化對中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義［9-11］。罌粟殼引起中毒反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為嗎啡等阿片類生物堿，炮制后毒性可降低，止咳和止痢作用可增強，其化學(xué)成分也發(fā)生了變化［12］。因此，考察罌粟殼炮制前后無機元素的含量，可為闡明其藥效發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。本研究中采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法測定了罌粟殼炮制前后無機元素的含量，并通過正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）法找出含量差異顯著的無機元素，比較炮制前后的變化，為罌粟殼和蜜罌粟殼的鑒別、產(chǎn)地區(qū)分、質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津2030型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（日本島津公司）；Multiwate 7000型超級微波消解儀（奧地利安東帕公司）；ME204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為萬分之一）。

1.2 試藥

混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液［含銀（Ag）等36種元素，質(zhì)量濃度為10 μg/mL，批號為R2-MEB 694161］，汞（Hg）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為1000 μg/mL，批號為R2-MEB814561），均購自美國IV公司；金（Au）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國計量科學(xué)研究院，質(zhì)量濃度為1000 μg/mL，批號為20191206）；內(nèi)標(biāo)溶液［美國安捷倫公司，含鈦（48Ti）、銠（103Rh）、錸（186Re），質(zhì)量濃度為1000 μg/mL，批號為CL3-188MK BY1］；65%硝酸（優(yōu)級純，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司）；超純水（實驗室自制）；罌粟殼（編號為S22-S31）及蜜罌粟殼（編號為S32-S41）各10批，均由甘肅普安制藥股份有限公司提供，產(chǎn)地分別為張掖（編號為S22-S26，S32-S36）和金昌（編號為S27-S31，S37-S41），經(jīng)甘肅省藥品檢驗研究院馬瀟主任藥師鑒定均為正品。炮制蜜罌粟殼時，每100 kg罌粟殼用煉蜜20 kg。

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS條件

射頻功率：1200 W；霧化氣壓力：100 psi；霧化溫度：2℃；等離子體氣體流速：18.0 L/min；氦氣（He）碰撞壓力：0.1 MPa；脈沖電壓：800 V；輔助氣體流速：0.8 L/min；載氣流速：0.86 L/min；冷卻循環(huán)水溫度：20℃。測定模式為He模式，重復(fù)測量3次。

2.2 微波消解條件

采用超級微波消解儀對樣品進行前處理。設(shè)置參數(shù)：功率，梯度變化（0～5 min時0～800 W，5～15 min時800 W，15～30 min時800～1200 W，30～50 min時1200 W）；冷卻溫度為80℃。溫度、壓力、時間、微波功率等參數(shù)可通過編程實現(xiàn)自動控制，從而降低系統(tǒng)誤差，提高樣品處理的重復(fù)性和方法研究的穩(wěn)定性，并采用變頻微波加熱系統(tǒng)，使消解溫度更均勻，消解速率更快，樣品消解更徹底、完全。

2.3 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密吸取36種混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為10 μg/mL）和Hg元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為1000 μg/mL）適量，加3%硝酸溶液制成質(zhì)量濃度分別為0.01，0.10，0.50，1.00，10.00，100.00，500.00 ng/mL的36種系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00 ng/mL的系列Hg元素標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取Au元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為1000 μg/mL）適量，加3%硝酸溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：分別精密吸取質(zhì)量濃度為1000 μg/mL的103Rh和186Re內(nèi)標(biāo)溶液適量，加3%硝酸溶液制成質(zhì)量濃度為50 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)使用液。分析過程中，為校正補償樣品的基體效應(yīng)和信號漂移，選擇48Ti，103Rh，186Re作為內(nèi)標(biāo)，通過蠕動泵在線加入，內(nèi)標(biāo)和樣品的稀釋因子約為1/10。

供試品溶液：取20批（編號為S22-S41）樣品，粉碎，過3號篩，取0.3 g，精密稱定，置石英消解罐中，加入2 mL硝酸和1 mL超純水，混勻，按2.2項下程序消解。待消解完全后，取出，放冷，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用少量水洗滌消解罐，合并洗液于容量瓶中，加入Au元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為1 μg/mL）200 μL，用3%硝酸溶液定容，搖勻，即得。

空白樣品溶液：除不加入Au元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外，按供試品溶液制備方法制備。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察、檢測限和定量限確定：吸取2.3項下系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和Hg元素標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，按2.1項下ICP-MS條件進樣測定，以各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果見表1，表明各元素在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與響應(yīng)值線性關(guān)系良好。按試驗方法測定空白樣品溶液，平行11次，計算空白標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，分別以3倍和10倍SD/k（k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）計算得儀器檢測限（3 σ）和定量限（10 σ）。按如下公式計算：檢測（定量）限濃度（μg/kg）=3 σ（10 σ）×稀釋倍數(shù)×10-3/理論取樣量。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察、檢測限和定量限確定結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of detection and limit of quantitation

精密度試驗：取供試品溶液適量，按2.1項下ICP-MS條件連續(xù)進樣測定6次。結(jié)果各元素質(zhì)量濃度的RSD為0.88%～1.34%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取2.3項下供試品溶液6份，按2.1項下ICP-MS條件進樣測定。結(jié)果各元素質(zhì)量濃度的RSD為0.96%～3.88%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為S22），按2.3項下方法制備供試品溶液，分別于配制后0，2，4，8，10 h時按2.1項下ICP-MS條件進樣測定。結(jié)果各元素質(zhì)量濃度的RSD為0.44%～2.87%（n=5），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（編號為S22）適量，精密稱定，共9份，分別加入高、中、低質(zhì)量濃度的37種混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，各3份，按2.1項下ICP-MS條件進樣測定，按外標(biāo)法計算各元素含量。結(jié)果各元素的平均加樣回收率為85.61%～102.10%，RSD為0.83%～4.87%（n=9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 罌粟殼炮制前后無機元素含量變化

取樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下ICP-MS條件進樣測定，無機元素含量變化見圖1。可見，Sr，Rb，Mn，Ba，Cr，Cu，Ni元素在樣品中含量豐富?！端幱弥参锛爸苿┻M出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，重金屬及有害元素的限量為Hg≤0.2 mg/kg，As≤2.0 mg/kg，Pb≤5.0 mg/kg，Cu≤20.0 mg/kg，Cd≤0.3 mg/kg。除Pb外，罌粟殼和蜜罌粟殼中重金屬及有害元素Cd，As，Hg，Cu的含量均低于規(guī)定限度，且炮制后重金屬及有害元素含量均有所減少。

圖1 罌粟殼與蜜罌粟殼中無機元素含量變化Note：Comparison of inorganic element contents between Papaveris Pericarpium and honey-stir-baked Papaveris Pericarpium，*P<0.05.Fig.1 Change of inorganic element contents in Papaveris Pericarpium and honey-stir-baked Papaveris Pericarpium

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對罌粟殼和蜜罌粟殼中37種無機元素的含量分別進行差異分析。結(jié)果顯示，罌粟殼和蜜罌粟殼中Ag，As，Cd，Hg，Th，V，Y，Co，Li，Cu，Sr元素的含量有顯著差異（P<0.05），蜜罌粟殼中Th，V，Y，Co，Li，Sr元素的含量較罌粟殼顯著增加，而Ag，As，Cd，Hg，Cu元素的含量較罌粟殼顯著降低。Be，Dy，Er，Eu，Gd，Ho，Lu，In，Pr，Tb，Tl，Tm，Yb元素的含量均低于檢測限，故未納入圖中。詳見圖1。

2.6 產(chǎn)地分布特點分析

將測得的各無機元素含量導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件，用OPLS-DA法分析樣品的聚集情況，罌粟殼和蜜罌粟殼的OPLS-DA模型得分圖見圖2?？梢?，罌粟殼和蜜罌粟殼均表現(xiàn)出明顯的聚類，且組間分離更明顯，表明罌粟殼和蜜罌粟殼無機元素含量差異顯著；不同產(chǎn)地罌粟殼樣品聚集明顯且樣品點沒有重疊，表明OPLS-DA法可較好地區(qū)分產(chǎn)地。但蜜罌粟殼樣品受蜜炙影響不能明顯區(qū)分產(chǎn)地，故有重疊部分。該模型解釋率（R2）為0.936，預(yù)測力參數(shù)（Q2）為0.928，均大于0.5，且接近于1.0，表明所建立模型的解釋率和預(yù)測能力均較好。

圖2 OPLS-DA模型得分圖1.Papaveris Pericarpium 2.Honey-stir-baked Papaveris PericarpiumFig.2 Scoring diagram of OPLS-DA model

采用置換檢驗驗證OPLS-DA模型的擬合程度，結(jié)果見圖3?？梢?，R2擬合直線在Y軸的截距為0.1，Q2擬合直線在Y軸的截距小于0，表明所建立的模型可靠，不存在過度擬合，具有較好的預(yù)測能力。

圖3 OPLS-DA模型荷載圖Fig.3 Loading diagram of OPLS-DA model

由上述模型分析得到無機元素的變量權(quán)重（VIP），當(dāng)VIP≥1時該變量對組間差異的影響大，可作為組間特征性成分，故以VIP>1為指標(biāo)進行篩選，得到重要性變量VIP貢獻率，詳見圖4?？梢姡町愋詿o機元素影響程度從大到小依次為As>Nd>Ce>La>Mn>Cd>Y>Sr>Co>Hg>Cu>Th>Li>Ag>Rb。

圖4 無機元素變量的VIP圖Fig.4 VIP diagram of inorganic element variables

3 討論

本研究中采用超級微波消解儀對樣品進行前處理，其具有自動化操作智能微波化學(xué)工作平臺，可多通道、快速、完全消解樣品，且消解試劑用量少，減少了樣品的空白值和背景干擾，同時有利于節(jié)能減排；變頻微波加熱系統(tǒng)使加熱更均勻，樣品消解更徹底，有利于提高樣品處理的重復(fù)性和方法研究的穩(wěn)定性。相較于電熱板消解和普通微波消解等常規(guī)方法，超級微波消解試劑使用量更少，用時短，無需趕酸，稀釋后可直接上機分析，操作方便快捷。從試驗結(jié)果來看，取3個平行樣品進行消解，測得各無機元素含量間的RSD均小于3%，表明具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。另外，通過ICP-MS法測定，采用He碰撞模式和在線加入內(nèi)標(biāo)溶液，能有效降低背景噪音值，排除基體效應(yīng)對多元素產(chǎn)生的干擾。由于采樣錐對Hg元素具有較強的吸附性，在樣品定容前加入一定量的Au元素，使形成金汞齊（Au2Hg），減少采樣錐對Hg元素的吸附，從而確保樣品中Hg元素測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由圖1可知，罌粟殼炮制前后的Sr，Rb，Mn，Ba，Cr，Cu，Ni等無機元素含量較高，罌粟殼和蜜罌粟殼中Ag，As，Cd，Hg，Th，V，Y，Co，Li，Cu，Sr元素含量有顯著差異（P<0.05），其中炮制后的Th，V，Y，Co，Li，Sr元素含量較炮制前均顯著增加，而Ag，As，Cd，Hg，Cu元素的含量較炮制前均顯著降低。重金屬及有害元素As，Cd，Hg，Cu炮制后含量顯著下降，可能是罌粟殼炮制后減毒的原因之一。另外，炮制蜜罌粟殼時，每100 kg罌粟殼用煉蜜20 kg，罌粟殼炮制前后上述元素的變化也可能與加入煉蜜有關(guān)，但有待進一步研究。

采用OPLS-DA法對無機元素進行聚類，能有效區(qū)分罌粟殼和蜜罌粟殼，其中As，Nd，Ce，La，Mn，Cd，Y，Sr，Co，Hg，Cu，Th，Li，Ag，Rb的VIP均大于1，均為其差異性無機元素。

綜上所述，本研究中建立的超級微波消解-ICP-MS法操作便捷、準(zhǔn)確度和靈敏度均較高，為罌粟殼和蜜罌粟殼的鑒別和產(chǎn)地區(qū)分提供了新思路。從無機元素變化角度，為探究罌粟殼炮制減毒、增強補益功效的科學(xué)內(nèi)涵提供了基礎(chǔ)資料，可為罌粟殼藥材的質(zhì)量控制及安全性評價提供科學(xué)依據(jù)。