高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定醒脾養(yǎng)兒顆粒中6種咖啡?？鼘幩犷惓煞趾?

朱幫會(huì)，李 銀，馬 雪，汪 洋，劉春花，田 琳，李勇軍△

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心·省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)·貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；4.貴州健興藥業(yè)有限公司，貴州 貴陽 550018）

醒脾養(yǎng)兒顆粒由一點(diǎn)紅、毛大丁草、蜘蛛香、山梔茶4味中藥材制備而成，具有醒脾開胃、固腸止瀉、養(yǎng)血安神等功效，臨床廣泛用于治療兒童厭食、腹瀉、腸炎、遺尿等［1-5］。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有一點(diǎn)紅和毛大丁草的薄層色譜鑒別、醇溶性浸出物含量規(guī)定及顆粒劑常規(guī)檢查等項(xiàng)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較單一，存在質(zhì)量控制體系不完善、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確等問題?？Х弱？鼘幩犷惓煞譃樾哑B(yǎng)兒顆粒中4味藥材的共有成分，具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等作用［6-7］。目前，關(guān)于藥材中咖啡?？鼘幩犷惡繙y(cè)定的研究報(bào)道較多，但尚未見醒脾養(yǎng)兒顆粒中此類成分的相關(guān)報(bào)道。為進(jìn)一步完善醒脾養(yǎng)兒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究中建立了同時(shí)測(cè)定6種咖啡酰奎寧酸類成分含量的高效液相色譜法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Fisher UltiMate 3000型高效液相色譜儀（配有系統(tǒng)控制器、輸液泵、脫氣組件、低壓梯度組件、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、溫控樣品室、UV-DAD檢測(cè)器及Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站），Multifuge X3R型高速冷凍離心機(jī)，均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Mettler EL-204型電子天平（精度為萬分之一），Mettler AE-240型電子天平（精度為十萬分之一），均購(gòu)于梅特勒-托利多儀器<上海>儀器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；WP-UP-IV-10型超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

新綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為wkq21010802），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為wkq20042702），隱綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為wkq20082705），異綠原酸B對(duì)照品（批號(hào)為wkq21022206），異綠原酸A對(duì)照品（批號(hào)為wkq21020306），異綠原酸C對(duì)照品（批號(hào)為wkq21012501），純度均不低于98%，均購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純，水為超純水；醒脾養(yǎng)兒顆粒（共21批，貴州健興藥業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase

2.2 溶液制備

分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品適量，加25%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.960，0.978，1.013，0.960，0.966，0.999 mg/mL的對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述對(duì)照品貯備液適量，置10 mL容量瓶中，加25%甲醇稀釋并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.05306，0.08400，0.06857，0.02796，0.01447，0.04115 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。取樣品2.0 g，精密稱定，置50 mL磨口具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）45 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加25%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心（轉(zhuǎn)速為14000 r/min）10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取空白溶液及2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品溶液與混合對(duì)照品溶液色譜中各相應(yīng)色譜峰保留時(shí)間一致，各待測(cè)成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且空白溶液無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Neochlorogenic acid 2.Chlorogenic acid 3.Cryptochlorogenic acid 4.Isochlorogenic acid B 5.Isochlorogenic acid A 6.Isochlorogenic acid C A.Blank solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加25%甲醇逐級(jí)稀釋，得系列梯度濃度混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 6種咖啡酰奎寧酸類成分線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test of six caffeoylquinic acids（n=6）

精密度試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20210117）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件平行進(jìn)樣6次，記錄峰面積。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C色譜峰峰面積的RSD分別為0.12%，0.11%，0.14%，0.31%，0.25%，0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20210117）6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C平均含量的RSD分別為0.37%，0.32%，0.25%，1.55%，1.57%，0.94%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄6種待測(cè)成分峰面積。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C色譜峰峰面積的RSD分別為0.55%，0.73%，0.88%，1.18%，0.65%，1.30%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20210117）6份，每份1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，分別加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品0.1210，0.1740，0.1470，0.05296，0.02648，0.06691 mg，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取21批樣品各2.0 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，結(jié)果見表4。可見，21批樣品中6種咖啡?？鼘幩峥偤繛?.30291～0.68319 mg/g，平均含量為0.48599 mg/g。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.4 Results of the content determination of six caffeoylquinic acids in the samples（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 提取方法選擇

曾考察超聲和回流2種提取方式，提取效果差異不明顯，故選擇更簡(jiǎn)便的超聲提取法。曾考察不同體積分?jǐn)?shù)（25%，50%，75%，100%）的甲醇和乙醇作為提取溶劑時(shí)待測(cè)成分的峰面積。綜合考慮節(jié)省溶劑、環(huán)保等因素，以25%甲醇提取時(shí)各待測(cè)成分的峰面積較大。曾考察不同提取時(shí)間（15，30，45，60 min）對(duì)提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)超聲提取45 min時(shí)各待測(cè)成分的提取率最大，故選擇提取時(shí)間為45 min。

3.2 色譜條件優(yōu)化

曾考察甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液時(shí)6種待測(cè)成分能在25 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)，且待測(cè)成分峰形較好，分離度均大于1.5。曾考察不同品牌色譜柱的分離效果，結(jié)果ACE Excel 5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）具有較高的柱效，待測(cè)成分與雜質(zhì)峰區(qū)分效果明顯。根據(jù)DAD全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C均于325 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。故選擇325 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)，考察不同柱溫（25，30，35℃）和不同流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）對(duì)待測(cè)成分分離度和峰形的影響。結(jié)果表明，在固定色譜柱，柱溫分別為25℃和35℃、流速為0.8 mL/min時(shí)各峰分離度小于1.5時(shí)峰形較差，當(dāng)柱溫為30℃、流速為1.0 mL/min時(shí)各峰分離度均大于1.5，且方法學(xué)考察結(jié)果符合相關(guān)要求。故選擇柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min。

3.3 指標(biāo)成分選擇

目前，醒脾養(yǎng)兒顆粒在臨床研究多集中于臨床療效與單味藥材的化學(xué)成分分離鑒定，對(duì)物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量評(píng)價(jià)卻鮮有報(bào)道?！秶?guó)家藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS-10337-（ZD-0337）-2002-2012Z作為目前醒脾養(yǎng)兒顆粒的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，僅有薄層色譜鑒別項(xiàng)，未對(duì)含量測(cè)定進(jìn)行相關(guān)規(guī)定。陶劍美等［8］采用紫外分光光度法對(duì)醒脾養(yǎng)兒顆粒中的總黃酮進(jìn)行測(cè)定；舒波等［9］采用高效液相色譜法測(cè)定熊果苷、槲皮苷、纈草三酯和乙酰纈草三酯的含量。醒脾養(yǎng)兒顆粒處方藥材中含有黃酮類、香豆素類、咖啡?？鼘幩犷悺⑤祁?、木脂素類等多種化學(xué)成分［10-13］，成分復(fù)雜，其功效往往是多種有效成分共同作用的結(jié)果，在優(yōu)先選擇君藥、臣藥及其他藥味專屬性成分進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，方中藥味所含共有成分可能會(huì)被忽略。在對(duì)質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行探索性研究中，通常以其中一個(gè)指標(biāo)成分作為定性鑒別和定量檢測(cè)的對(duì)象，但中藥及中藥復(fù)方制劑成分種類復(fù)雜，只對(duì)其中任意1種成分進(jìn)行檢測(cè)不能體現(xiàn)整體性，共有成分通常是反映制劑整體質(zhì)量控制的指標(biāo)，故對(duì)共有成分進(jìn)行含量測(cè)定具有重要意義。參考文獻(xiàn)［6，14］，咖啡?？鼘幩犷惓煞肿鳛樾哑B(yǎng)兒顆粒中4味藥材的共有成分，其含量相對(duì)較高且較穩(wěn)定，具有抗菌、細(xì)胞保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等良好的藥理活性。故選擇咖啡?？鼘幩犷惓煞肿鳛樾哑B(yǎng)兒顆粒的含量測(cè)定指標(biāo)。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于測(cè)定醒脾養(yǎng)兒顆粒中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 6種成分的總含量，為其質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。