基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討華蟾素注射液治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制*

徐玲艷，于天怡，石美智，陳君君，邢婷玉，徐曉紅，劉 盈，韓永龍，張 鳳，姜 波△

（1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海 201306；2.上海長(zhǎng)征醫(yī)院，上海 200003）

結(jié)直腸癌為臨床常見(jiàn)消化道腫瘤，發(fā)病率和死亡率均僅次于乳腺癌和肺癌，位居第3位［1］。外科手術(shù)是治療結(jié)直腸癌的首選方案，但化學(xué)治療（簡(jiǎn)稱化療）仍是晚期結(jié)直腸癌的主要治療方式［2-3］。隨著靶向治療、免疫治療的加入，晚期結(jié)直腸癌患者的生存率提升［4］。中藥作為中國(guó)醫(yī)藥資源的寶庫(kù)，在癌癥的治療中仍占有一席之地。中藥制劑通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路可直接發(fā)揮抗腫瘤作用，還對(duì)化療引起的一系列不良反應(yīng)有緩減效果，能起到增效減毒的作用。華蟾素注射液（HCSI）是以蟾皮為主要原料提取精制而成的水溶性制劑，是第1個(gè)獲得美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）資助進(jìn)行臨床研究的抗腫瘤中藥注射液，廣泛應(yīng)用于原發(fā)性肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種中晚期腫瘤的治療，特別是對(duì)含草酸鉑方案化療失敗的晚期結(jié)直腸癌患者療效顯著［5］。目前，已從蟾皮中分離獲得超過(guò)100個(gè)單體化合物，其化學(xué)成分主要有蟾蜍內(nèi)酯（蟾毒配基類、蟾蜍毒素類）、蟾毒色胺類、多肽類、核苷類、氨基酸類等。華蟾素注射液中的水溶性生物堿及微量的脂溶性蟾毒內(nèi)酯類毒性成分被認(rèn)為是其主要的兩類化學(xué)活性成分［6-7］。隨著對(duì)華蟾素有效成分研究的不斷深入，為探討其藥效作用機(jī)制，系統(tǒng)研究華蟾素注射液的化學(xué)活性成分非常必要，對(duì)于研究中藥復(fù)方作用靶點(diǎn)、用藥規(guī)律意義深遠(yuǎn)。本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，綜合分析藥物-疾病-基因-靶點(diǎn)間的關(guān)系，剖析華蟾素注射液“多基因、多靶點(diǎn)”的作用特點(diǎn)［8-9］；利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)篩選出的華蟾素注射液作用靶點(diǎn)進(jìn)行聚類分析，從多個(gè)層面深入探討其作用機(jī)制，全面分析其作用靶點(diǎn)、生物過(guò)程及信號(hào)通路；并使用計(jì)算機(jī)輔助軟件對(duì)華蟾素注射液的主要活性成分與關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白進(jìn)行模擬對(duì)接，以闡明其治療結(jié)直腸癌復(fù)雜的作用機(jī)制，為華蟾素注射液治療結(jié)直腸癌的深入研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：Orbitrap Fusion Lumos型液質(zhì)聯(lián)用高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）；UNIVERSAL 32R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；ULT1786-3-V37型超低溫冰箱（美國(guó)Revco公司）。

試藥：華蟾素注射液（安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為190101-2）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗溶液（美國(guó)Gibco公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；其余試劑均為分析純。

細(xì)胞：人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

Canonical SMILES結(jié) 構(gòu)：PubChem網(wǎng) 站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。

數(shù)據(jù)庫(kù)：活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（SwissTargetPrediction，http：//www.swisstargetprediction.ch/）；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt，https：//www.uniprot.org/）；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB，http：//www.rcsb.org/）；基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards，https：//www.genecards.org/）；疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）；Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//go.drugbank.com/）；生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID 6.8，https：//david.ncifcrf.gov/）。

軟件：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(tái)（String，https：//string-db.org/）；生物信息云平臺(tái)（OmicShare，https：//www.omicshare.com/）；網(wǎng)絡(luò)分析及作圖軟件［可視化軟件Cytoscape 3.7.2，Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）］；ChemBioOffice 2014軟件；分子對(duì)接相關(guān)軟件（Auto-Duck Tools，ChemBio 3D，PyMOL，MOE）。

1.3 方法

活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：從文獻(xiàn)中查閱目前華蟾素注射液已明確的主要化學(xué)成分，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分標(biāo)準(zhǔn)canonical SMILES結(jié)構(gòu)式，導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行活性化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，默認(rèn)選擇“Homo sapiens”，輸入化合物字符串SMILES，提交、預(yù)測(cè)、篩選與華蟾素注射液活性化合物相關(guān)的作用靶點(diǎn)。通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，限定物種為“人”，將檢索得到的所有靶點(diǎn)蛋白校正為其標(biāo)準(zhǔn)名稱。在Gene-Cards數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)直腸癌相關(guān)靶基因，將以上3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的結(jié)直腸癌靶基因與華蟾素注射液靶基因輸入Venny 2.1.0軟件，取交集作為華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將上述靶點(diǎn)及華蟾素注射液主要化學(xué)成分導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建：將華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌靶點(diǎn)導(dǎo)入String平臺(tái)構(gòu)建PPI，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，自定義相互作用閾值“confidence=0.97”，其他參數(shù)為默認(rèn)值。將PPI導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，利用“Network Analysis”功能計(jì)算各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度值、介數(shù)、最短路徑等拓?fù)鋮?shù)，上述參數(shù)的值越大表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置越重要。選取網(wǎng)絡(luò)中3個(gè)拓?fù)鋮?shù)均較大且在均值以上的靶點(diǎn)作為華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌靶點(diǎn)的基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析：將華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌靶點(diǎn)輸入OmicShare和DAVID 6.8平臺(tái)，分別進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，依據(jù)P<0.001和P<0.05篩選富集的生物功能及信號(hào)通路。

華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接：在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)搜索華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌核心靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，借助PyMOL軟體將核心靶蛋白與原配體分離，同時(shí)去除核心靶蛋白的水分子、磷酸根及多余的非活性配體。將核心化學(xué)成分的二維（2D）結(jié)構(gòu)導(dǎo)入ChemBio 3D軟件后進(jìn)行MM2能量最小化優(yōu)化，以mol2格式保存。將核心靶蛋白、原配體、化合物三維（3D）結(jié)構(gòu)統(tǒng)一導(dǎo)入MOE軟件，利用“Site Finder”功能找出活性口袋，進(jìn)行核心靶蛋白與目標(biāo)化合物的分子對(duì)接。

細(xì)胞培養(yǎng)與華蟾素注射液測(cè)定：將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在T75方瓶中，培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基、10% FBS、1%雙抗溶液（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 d傳代，直到細(xì)胞數(shù)量足夠，以1×105個(gè)/mL接種于6孔板。48 h后每孔中加入含華蟾素注射液的培養(yǎng)基2 mL，分為空白組及1.0%，0.3%，0.1%（V/V）華蟾素注射液組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)48 h后棄去上清液，用冰冷磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，加入100 μL十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液裂解細(xì)胞，提取蛋白，經(jīng)還原烷基化、丙酮沉淀后酶解過(guò)夜。肽段除鹽后加入10 μL 0.5%甲酸-5%乙腈溶液重懸，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。? μL肽段樣品，置Orbitrap Fusion Lumos型液質(zhì)聯(lián)用高分辨質(zhì)譜儀分析。色譜條件：色譜柱為New Objective self-packed C18analytical PicoFrit column柱（40 cm×75 μm，9 μm）；流動(dòng)相A為0.5%甲酸-2%乙腈溶液（V/V），流動(dòng)相B為0.5%甲酸-80%乙腈溶液（V/V），梯度洗脫（0～60 min時(shí)5%B→50%B）；流速為300 nL/min。質(zhì)譜條件：全掃描模式分辨率設(shè)置為120000，質(zhì)荷比（m/z）為350～1500；數(shù)據(jù)非采集（DIA）模式掃描分辨率設(shè)置為30000，AGC target設(shè)置為1×e6，maximal IT設(shè)置為54 ms。DIA原始數(shù)據(jù)文件使用Spectronaut X軟件進(jìn)行搜庫(kù)分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分

華蟾素注射液為蟾皮的水提取物，化學(xué)成分復(fù)雜，目前已從蟾皮中分離獲得超過(guò)100個(gè)單體化合物，主要包括蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類、吲哚生物堿類、蟾蜍環(huán)酰胺類、小分子環(huán)肽類、核苷類等。根據(jù)文獻(xiàn)［10-12］報(bào)道，將篩選得到的63個(gè)化合物依次輸入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取相關(guān)化合物信息，詳見(jiàn)表1。

表1 華蟾素注射液中活性化合物信息Tab.1 Information of active compounds in Huachansu Injection

續(xù)表1華蟾素注射液中活性化合物信息Continued Tab.1 Information of active compounds in Huachansu Injection

2.2 抗結(jié)直腸癌作用靶點(diǎn)及主要成分預(yù)測(cè)

通過(guò)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)共得到華蟾素注射液化合物靶點(diǎn)978個(gè)，從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取結(jié)直腸癌疾病靶點(diǎn)共10495個(gè)。其中，TTD數(shù)據(jù)庫(kù)19個(gè)，Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)48個(gè)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)10428個(gè)。將華蟾素注射液活性成分靶點(diǎn)與結(jié)直腸癌疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1軟件，去重后得到25個(gè)共有靶點(diǎn)，詳見(jiàn)圖1。利用Cytoscape 3.7.2可視化軟件繪制華蟾素注射液治療結(jié)直腸癌的中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，每個(gè)參與互作的活性成分節(jié)點(diǎn)用一個(gè)圓圈表示，圓圈面積越大、顏色越深表示其度值越大，詳見(jiàn)圖2。篩選化合物度值大于5的節(jié)點(diǎn)，按度值大小對(duì)華蟾素注射液的活性成分進(jìn)行排序，共篩選出26種核心活性成分，詳見(jiàn)表2。

表2 華蟾素注射液核心活性成分拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)Tab.2 Topological properties of the core active ingredients of Huachansu Injection

圖1 華蟾素注射液活性成分靶點(diǎn)與結(jié)直腸癌疾病靶點(diǎn)的維恩圖Fig.1 Venn diagram of targets of active ingredients of Huachansu Injection and targets of CRC

圖2 華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌的中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 TCM-active ingredients-disease targets network of Huachansu Injection against CRC

2.3 抗結(jié)直腸癌靶蛋白PPI

用篩選出的25個(gè)蛋白在String數(shù)據(jù)庫(kù)中考察蛋白相互作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)孤立蛋白。將String得到的蛋白互作結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析，按度值大于5排列主要靶點(diǎn)，篩選出華蟾素注射液治療結(jié)直腸癌的主要疾病靶點(diǎn)7個(gè)。由圖3可知，每個(gè)參與互作的蛋白節(jié)點(diǎn)用一個(gè)圓圈表示，圓圈面積越大代表其度值越大，相互作用連線越粗代表其介數(shù)越大，圓圈周線越粗代表其路徑越短。PPI中共有17個(gè)節(jié)點(diǎn)、34條相互作用連線，平均度值為2.72，平均介數(shù)為4.89×10-2，平均最短路徑為3.43×10-1，經(jīng)節(jié)點(diǎn)的度值、介數(shù)、最短路徑3個(gè)拓?fù)鋮?shù)篩選，在網(wǎng)絡(luò)中較大的7個(gè)核心靶點(diǎn)分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、熱激蛋白90α家族成員1（HSP90AA1）、表皮生長(zhǎng)因子（EGFR）、激酶插入?yún)^(qū)域受體（KDR）、碳酸酐酶9（CA9）、Rho相關(guān)蛋白激酶1（ROCK1）、細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子（c-MET），詳見(jiàn)表3。

表3 華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌核心靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)Tab.3 Core targets and their topological parameters of Huachansu Injection against CRC

圖3 華蟾素注射液作用靶點(diǎn)的PPIA.Seventeen target proteins B.Seven target proteinsFig.3 PPI network of target of Huachansu Injection

2.4 抗結(jié)直腸癌靶點(diǎn)的GO功能富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，依據(jù)P<0.001篩選出GO條目262個(gè)，其中生物過(guò)程（BP）223個(gè)，分子功能（MF）24個(gè)，細(xì)胞組成（CC）15個(gè)。利用OmicShare云平臺(tái)對(duì)7個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，BP主要涉及發(fā)育過(guò)程、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程、刺激反應(yīng)等，MF和CC主要涉及結(jié)合過(guò)程、催化活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、分子功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜等。詳見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌靶點(diǎn)的GO功能富集分析二級(jí)分類柱狀圖Fig.4 Histogram of the second classification of GO function enrichment analysis of targets of Huachansu Injection against CRC

圖5 華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌靶點(diǎn)的GO功能富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of GO function enrichment analysis of targets of Huachansu Injection against CRC

2.5 抗結(jié)直腸癌靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

依據(jù)P<0.05篩選7個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路，主要有癌癥途徑（pathways in cancer）、氮代謝（nitrogen metabolism）、癌癥中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、Rap1信號(hào)通路（Rap1 signaling pathway）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥的中心碳代謝（central carbon metabolism in cancer）、黏著斑（focal adhesion）、大鼠肉瘤病毒（Ras）信號(hào)通路（Ras signaling pathway）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、麻疹（measles）等29條，詳見(jiàn)表4。由圖6可知，目標(biāo)靶基因涉及代謝、細(xì)胞過(guò)程、器官系統(tǒng)、疾病等。上述前20條信號(hào)通路的氣泡圖見(jiàn)圖7，以富集因子（RF）、P值及調(diào)控通路上的基因個(gè)數(shù)衡量KEGG富集程度，其中氣泡顏色代表P值的大小，RF代表富集程度的大小，氣泡大小代表該通路中目標(biāo)基因的多少?？梢?jiàn)，P值偏小為癌癥中的蛋白多糖、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗、腫瘤中的microRNA、黏著斑、癌癥途徑、PI3K-Akt信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、癌癥的中心碳代謝、人巨細(xì)胞病毒感染、非小細(xì)胞肺癌（NSCL）、黑色素瘤、胰腺癌、幽門(mén)螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、黏合連接、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、前列腺癌、HIF-1信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路。通過(guò)使用預(yù)測(cè)目標(biāo)靶蛋白在結(jié)直腸癌通路的富集分析發(fā)現(xiàn)，上述關(guān)鍵目標(biāo)蛋白在結(jié)直腸癌的治療中發(fā)揮重要作用，詳見(jiàn)圖8。

圖6 華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Statistical chart of KEGG pathway enrichment number of targets of Huachansu Injection against CRC

圖7 華蟾素注射液抗結(jié)直腸癌靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.7 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of targets of Huachansu Injection against CRC

圖8 華蟾素注射液作用的靶蛋白在結(jié)直腸癌通路的富集Fig.8 Enrichment of target proteins of Huachansu Injection in the CRC pathway

表4 KEGG通路富集分析信號(hào)通路Tab.4 Signal pathways of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中靶點(diǎn)蛋白的調(diào)節(jié)作用

不同濃度的華蟾素注射液與Caco-2細(xì)胞共同培養(yǎng)后，采用Orbitrap Fusion Lumos型液質(zhì)聯(lián)用高分辨質(zhì)譜儀相對(duì)定量Caco-2細(xì)胞中7種主要目標(biāo)靶點(diǎn)蛋白。結(jié)果顯示，1.0%（V/V）濃度的華蟾素注射液對(duì)STAT3，EFFR，HSP90AA1蛋白均有顯著抑制作用（P<0.05）。詳見(jiàn)圖9。

圖9 華蟾素注射液對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中靶點(diǎn)蛋白的調(diào)節(jié)作用Note：Compared with those in the blank control group，*P<0.05.Fig.9 Regulation of Huachansu Injection on the target proteins in Caco-2 cells

2.7 抗結(jié)直腸癌的核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

篩選PPI中度值排名靠前的核心靶點(diǎn)蛋白，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得核心靶蛋白的蛋白配體復(fù)合物，利用AutoDuck Tools和PyMOL軟件將蛋白除水、除配體，導(dǎo)入MOE軟件，將核心靶蛋白與華蟾素注射液排名靠前且經(jīng)Chem-Bio 3D結(jié)構(gòu)優(yōu)化的活性化合物進(jìn)行分子對(duì)接，評(píng)價(jià)活性化合物與靶蛋白之間的結(jié)合活性，根據(jù)其結(jié)合能大小篩選出華蟾素注射液治療結(jié)直腸癌的潛在核心化合物，分子對(duì)接結(jié)合能低于-5 kcal/mol為結(jié)合能力較好。模擬對(duì)接的最終GBVI/WSA打分及相互作用分析結(jié)果顯示，Bufalin與STAT3（PDB ID為6NJS）的最佳結(jié)合能為-6.0649 kcal/mol，Bufalin與HSP90AA1（PDB ID為1BYQ）的最佳結(jié)合能為-6.2610 kcal/mol，Cinobufagin與EGFR（PDB ID為5UG9）的 最 佳 結(jié) 合能 為-6.1388 kcal/mol，Cinobufagin與KDR（PDB ID為1YWN）的最佳結(jié)合能為-6.8075 kcal/mol。分子對(duì)接圖見(jiàn)圖10。

圖10 華蟾素注射液主要活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接三維圖和二維圖A1，A2.Bufalin-STAT3 B1，B2.Bufalin-HSP90AA1 C1，C2.Cinobufagin-EGFR D1，D2.Cinobufagin-KDRFig.103D and 2D diagrams of molecular docking of main active ingredients of Huachansu Injection and key target proteins

3 討論

華蟾素注射液作為一種臨床療效確切的抗腫瘤中藥注射液，在晚期結(jié)直腸癌的治療中發(fā)揮著重要作用［13-14］，其化學(xué)成分復(fù)雜，主要是蟾毒配基類、蟾蜍毒素類、蟾毒色胺、核苷類、多肽類、氨基酸類等。明確其發(fā)揮藥理作用的活性物質(zhì)是一項(xiàng)繁雜的工作。WEI等［15］考察了華蟾素注射液中的蟾蜍二烯內(nèi)酯類、生物堿類、核苷類、多肽類對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7402、胃癌細(xì)胞BGC-823的抗癌活性，結(jié)果顯示，蟾蜍二烯內(nèi)酯類具有最強(qiáng)的抗腫瘤活性，其次是多肽類，生物堿類幾乎沒(méi)有抗癌活性。KONG等［16］的研究顯示，生物堿類成分蟾蜍噻嚀通過(guò)抑制JAK2/STAT3通路而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬發(fā)揮華蟾素注射液抗腫瘤的作用。本研究中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)分析了華蟾素注射液治療結(jié)直腸癌的中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)華蟾素注射液治療結(jié)直腸癌是各類活性物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，處于核心藥理作用地位的化學(xué)活性物質(zhì)為蟾蜍二烯內(nèi)酯類，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的結(jié)果一致。

本研究中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法深入研究了華蟾素注射液活性成分靶點(diǎn)，重點(diǎn)分析了關(guān)鍵靶點(diǎn)及其富集的生物過(guò)程、信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)華蟾素注射液治療結(jié)直腸癌主要作用于STAT3，HSP90AA1，EGFR，KDR，CA9，ROCK1，c-MET等核心關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與發(fā)育過(guò)程、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程、刺激反應(yīng)等生物過(guò)程。關(guān)鍵靶點(diǎn)富集的通路主要有癌癥途徑、氮代謝、癌癥中的蛋白多糖、Rap1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、癌癥的中心碳代謝、黏著斑、Ras信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、麻疹等，其中癌癥途徑、信號(hào)通路的數(shù)量最多，如PI3K-Akt，Rap1，Ras信號(hào)通路等。華蟾素注射液通過(guò)STAT3的持續(xù)激活參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、癌變等過(guò)程，是該通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，也是目前結(jié)直腸癌治療研究的熱點(diǎn)［17-19］。c-Met二聚化和磷酸化，進(jìn)而抑制激活PI3K/Akt，RAS/MAPK，STAT3/JNK等信號(hào)通路，阻止腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)的降解等過(guò)程，實(shí)現(xiàn)治療結(jié)直腸癌的目的［20-23］。蟾毒靈通過(guò)EGFR信號(hào)通路改善EGFR酪氨酸激酶抑制劑的抵抗，能改善臨床腫瘤靶向藥物的耐藥問(wèn)題，顯著提高癌癥的治療效果［24-25］。

本研究中選取了蟾毒靈、華蟾毒配基與預(yù)測(cè)排名前4名的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，華蟾素注射液中的蟾毒靈對(duì)STAT3和HSP90AA1有較好的結(jié)合能力，而華蟾毒配基對(duì)EGFR和KDR有較好的結(jié)合能力。分子對(duì)接驗(yàn)證了4個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)蛋白華蟾素注射液發(fā)揮抗腫瘤作用的地位和重要性，同時(shí)液質(zhì)聯(lián)用高分辨質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了華蟾素注射液對(duì)EGFR，STAT3，HSP90AA1的作用，但對(duì)c-MET，CA9，ROCK1，KDR有作用的活性成分還需進(jìn)一步深入研究。

目前，華蟾素注射液藥理活性成分篩選的依據(jù)主要依賴化學(xué)分離、液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-QTOF/MS）等體外方法研究的結(jié)果。蟾毒靈、華蟾毒配基和酯蟾毒配基是華蟾素注射液中含量較高的化合物，為2020年版《中國(guó)藥典（一部）》中質(zhì)量控制的標(biāo)志性物質(zhì)，是入血成分體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究最多的活性成分［26］。而其他類化學(xué)成分因受到儀器設(shè)備精確度、靈敏度等條件的限制，無(wú)法準(zhǔn)確定量臨床劑量下其體內(nèi)活性成分的濃度，迄今鮮有華蟾素注射液多類活性成分入血定性、定量的綜合研究，故本研究中的預(yù)測(cè)性研究仍使用文獻(xiàn)已鑒定的體外化學(xué)活性成分。

綜上所述，華蟾素注射液治療結(jié)直腸癌具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的優(yōu)勢(shì)，后續(xù)將對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，重點(diǎn)圍繞華蟾素注射液對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗、結(jié)直腸癌模型PI3K-Akt信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路展開(kāi)研究，檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠度。本研究所得結(jié)論建立于數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)統(tǒng)計(jì)技術(shù)，可為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。