松乳菇菌株的分離鑒定及其與馬尾松的互作效應(yīng)

向健偉，龍芳，張立秋，周家春，鄭威，馬瓊*

（1湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000；2恩施硒妹子葡萄釀酒有限公司，湖北恩施 445000；3湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)技術(shù)研究所，湖北武漢 430063）

0 引言

【研究意義】松乳菇（，Ld）屬于紅菇科（）、乳菇屬（）真菌，俗稱樅樹菌，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的松乳菇多糖，而松乳菇多糖作為一種活性成分，具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞凋亡的作用（錢葉等，2017）。松乳菇在湖北、江西、湖南、重慶、四川、貴州和云南等南方地區(qū)均有分布（林佳等，2016），主要發(fā)生在馬尾松林下，常與松屬植物的根系共生，是一種典型的珍稀外生菌根真菌，松乳菇子實(shí)體分化需要獨(dú)特的共生生態(tài)環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)條件（王冉等，2020）。由于生態(tài)環(huán)境的變化，我國(guó)南方地區(qū)野生松乳菇的分布和產(chǎn)量急劇下降，為保護(hù)野生乳菇屬真菌資源的多樣性，有必要進(jìn)行松乳菇菌種資源的開發(fā)、馴化與共生栽培?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)外研究者模擬自然生態(tài)條件進(jìn)行了松乳菇的馴化栽培。多數(shù)研究者認(rèn)為，松乳菇與其松屬宿主植物間有促生作用，但松乳菇菌絲體均表現(xiàn)為不出菇或者出菇量低，不能真正實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。周國(guó)英等（2003）開展松乳菇的菌種分離，獲得了松乳菇菌種。辜夕容等（2005）、馬瓊等（2005）、楊艷美（2011）在馬尾松（）根系外源接種松乳菇等外生菌根真菌，發(fā)現(xiàn)松乳菇等外生菌根真菌有利于培育馬尾松苗木。何躍軍等（2008）將松乳菇等外生菌根真菌接種柏木幼苗，證實(shí)了松乳菇對(duì)柏木幼苗促生效果較好。部分研究者認(rèn)為松乳菇具有腐生性質(zhì)，開展了松乳菇的腐生馴化栽培。方平夷（1994）利用棉籽殼和茅草等腐生栽培松乳菇，獲得了少量松乳菇原基；詹少華（2018）利用松針和雜樹葉腐生栽培松乳菇，成功實(shí)現(xiàn)了松乳菇栽培種菌絲體向菇蕾轉(zhuǎn)化。但腐生栽培均未能獲得成熟松乳菇子實(shí)體，有研究者開展了松乳菇與松屬植物的共生栽培。賀誼紅等（2016）在5年生馬尾松林中撒播松乳菇菌絲體，探究松乳菇的半人工馴化栽培，但出菇率不高。鄭華英等（2020）在松樹林下馴化栽培松乳菇，獲得了少量松乳菇子實(shí)體。目前，通過松乳菇與松屬植物根系形成菌根，將菌根苗在野外環(huán)境下培育，人工干擾子實(shí)體的形成，是獲得松乳菇的主要方法，該方法在新西蘭已經(jīng)成功實(shí)施，但規(guī)模馴化栽培還未實(shí)現(xiàn)（Gollado et al.，2019）。松乳菇不能規(guī)模馴化栽培的主要原因在于，一是松乳菇菌株分離物不純，未進(jìn)行分子鑒定，二是松乳菇特殊的共生生態(tài)條件無法滿足，未獲得高質(zhì)量的菌根苗木，三是沒有形成子實(shí)體的足夠菌根化菌索及菌根?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】菌根化松乳菇菌索與菌根是影響馬尾松生長(zhǎng)的重要生態(tài)因子（徐江等，2012），而外源接種外生菌根真菌能增加土壤肥力，促進(jìn)共生植物的生長(zhǎng)發(fā)育（陳躬國(guó)等，2020），目前有關(guān)松乳菇與馬尾松的互作效應(yīng)鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用組織分離法分離湖北省恩施市境內(nèi)野生松乳菇子實(shí)體，獲得菌絲分離物，基于rDNA ITS序列方法分子鑒定該菌絲分離物的種屬；分析外源接種松乳菇對(duì)馬尾松苗木的菌根侵染率、生長(zhǎng)指標(biāo)及氮（N）、磷（P）、鉀（K）元素含量的影響，對(duì)馬尾松菌根侵染率與松乳菇子實(shí)體生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期為建立松乳菇與馬尾松共生體系、實(shí)現(xiàn)松乳菇的規(guī)模馴化栽培打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種的獲取與培養(yǎng)

試菜松乳菇子實(shí)體采自湖北恩施天然馬尾松次生林，林地馬尾松林齡主要為16～25年，海拔高度853～1065 m，壤土，郁閉度中等，年均降水量1400～1500 mm，年均氣溫14.9～16.3℃。用保鮮袋包裝松乳菇子實(shí)體樣本，帶回實(shí)驗(yàn)室。在無菌條件下沖洗子實(shí)體表面，75%乙醇消毒，采用組織分離法獲得松乳菇菌種。使用打孔接種器，截取2塊直徑6 mm的菌塊，接種到新鮮制備的PDA固體培養(yǎng)基上，每菌接種3皿，25℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后記錄菌種的生長(zhǎng)狀況，利用普通光學(xué)顯微鏡觀察菌絲的顯微特征。根據(jù)菌落培養(yǎng)特征得到3個(gè)菌株，即松乳菇恩施-1（Enshi 1，Ld-Es-1）、松乳菇恩施-2（Enshi 2，Ld-Es-2）和松乳菇恩施-3（Enshi 3，Ld-Es-3）。

1.2 菌種的分子鑒定

采用CTAB法提取3個(gè)菌株的菌絲基因組DNA，利用乳菇屬真菌rDNA ITS序列正向引物ITS1 5'-TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3'和反向引物L(fēng)DITS2R 5'-AGAGGAGCTGGGTCTAAG-3'（Guerin-Laguette et al.，2014），PCR擴(kuò)增rDNA ITS序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化回收，引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。利用DANMEN 8.0拼接測(cè)序序列，將拼接后的核苷酸序列與NCBI nucleotide blast數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的乳菇屬真菌rDNA ITS序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 松乳菇栽培種菌絲體的制備

首先制備離體栽培種培養(yǎng)基，配方為馬尾松木屑14%、棉籽殼24%、稻草粉24%、玉米芯14%、干牛糞10%、珍珠巖10%、糖1.5%、石膏1.5%和磷酸二氫鉀1%，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基水分含量至65%～70%、pH 7.2。將栽培種培養(yǎng)基質(zhì)裝入500 mL玻璃錐形瓶，壓實(shí)，封瓶口，121℃高壓蒸汽滅菌2 h，待基質(zhì)溫度降至室溫，每瓶培養(yǎng)基接入直徑6 mm的菌塊3塊，每菌株接種10瓶，置于25℃培養(yǎng)，記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)、污染情況及菌絲長(zhǎng)滿固體培養(yǎng)基質(zhì)的天數(shù)，獲得栽培種菌絲體。

1.4 松乳菇與馬尾松共培養(yǎng)試驗(yàn)

于2020年4月初，在標(biāo)準(zhǔn)苗床中進(jìn)行松乳菇與馬尾松的共培養(yǎng)試驗(yàn)。將苗床分隔成若干個(gè)1 m（1 m×1 m）小區(qū)，土壤消毒，塑料薄膜覆蓋7 d，分別接種3種栽培種菌絲體，接種量為400 g/m。將發(fā)芽的馬尾松種子播種至苗床中，播種量為40 g/m，苗期常規(guī)管理。試驗(yàn)設(shè)接種無菌栽培種培養(yǎng)基對(duì)照（CK）和接種處理，均做3個(gè)重復(fù)。各接種處理如下：L-1處理，接種Ld-Es-1栽培種；L-2處理，接種Ld-Es-2栽培種；L-3處理，接種Ld-Es-3栽培種。在松乳菇與馬尾松幼苗共培養(yǎng)約6個(gè)月后，隨機(jī)抽取CK和接種處理的馬尾松幼苗，各抽取20株，用體式顯微鏡（徠卡M205FA）檢測(cè)馬尾松根系的菌根侵染率。在共培養(yǎng)11個(gè)月后，隨機(jī)抽取CK和接種處理馬尾松苗木，各抽取20株，測(cè)定馬尾松苗木的干重、株高、地徑、主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)及根系的菌根侵染率；截取CK和各接種處理馬尾松苗木的根系和葉片，分別烘干、粉碎，測(cè)定根系與葉片的N、P、K的含量，其中，N含量采用凱氏蒸餾法測(cè)定，P含量采用鉬銻抗比色法測(cè)定，K含量采用原子吸收分光光度法測(cè)定（張小燕，2013）。在共培養(yǎng)13個(gè)月后，觀察CK與接種處理馬尾松苗圃小區(qū)的出菇情況，統(tǒng)計(jì)各接種處理的出菇數(shù)量，計(jì)算平均出菇數(shù)、總鮮重、平均鮮重及松乳菇產(chǎn)量，其中：平均出菇數(shù)=同一接種處理出菇總數(shù)/重復(fù)小區(qū)數(shù)量；總鮮重為同一接種處理總鮮菇重量之和；平均鮮重=同一接種處理總鮮重/出菇數(shù)量；松乳菇產(chǎn)量=所有接種處理松乳菇總鮮重/接種處理小區(qū)總面積（1 m×9）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入及整理；運(yùn)用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），利用Duncan法進(jìn)行多重比較分析。使用OriginPro 7.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離培養(yǎng)特征

由表1可看出，接種5 d后3株菌絲分離物均能在PDA培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)。其中，菌株Ld-Es-1的長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，培養(yǎng)5 d的平均菌落直徑為2.7～3.1 cm，約20.00 d長(zhǎng)滿90 mm玻璃平板，老化菌絲分泌物為橘紅色；菌株Ld-Es-2培養(yǎng)5 d的平均菌落直徑為2.7～2.8 cm，約26.67 d長(zhǎng)滿90 mm玻璃平板，老化菌絲分泌物呈淺綠色；菌株Ld-Es-3培養(yǎng)5 d的平均菌落直徑為2.4～2.5 cm，約32.00 d長(zhǎng)滿90 mm玻璃平板，老化菌絲分泌物呈乳白色。各菌株長(zhǎng)滿平板天數(shù)間差異顯著（＜0.05，下同），其中菌株Ld-Es-1生長(zhǎng)天數(shù)最短。利用普通光學(xué)顯微鏡制片觀察3株真菌菌絲，菌絲均未見鎖狀聯(lián)合，有隔膜。

2.2 菌株的分子鑒定

3株菌株rDNA ITS序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均得到520～615 bp的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。將核苷酸序列在NCBI nucleotide blast數(shù)據(jù)庫(kù)中與已有的松乳菇ITS序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果得出，菌株Ld-Es-1的ITS序列與云南松乳菇KY661914.1相似度為99.65%，菌株Ld-Es-2的ITS序列與四川松乳菇KX034408.1相似度為99.12%，菌株Ld-Es-3的ITS序列與云南松乳菇KY684167.1相似度為99.45%，序列相似度均大于99.00%，因此鑒定3株菌為松乳菇。

表1 3株菌的菌落培養(yǎng)及菌絲的顯微特征Table 1 Colony culture and microscopic characteristics of 3 strains

2.3 松乳菇栽培種的培養(yǎng)情況

玻璃錐形瓶因其瓶口小，內(nèi)裝培養(yǎng)基質(zhì)持水性好。采用玻璃錐形瓶制備3種松乳菇栽培種，3種受試菌株均能在錐形瓶制備培養(yǎng)基質(zhì)中實(shí)現(xiàn)菌絲體的生長(zhǎng)（圖2），菌絲體白色、粗壯、延伸生長(zhǎng)良好。相比較而言，菌株Ld-Es-1菌絲生長(zhǎng)最快，平均需要約22.60 d長(zhǎng)滿固體基質(zhì)，10瓶栽培種中僅1瓶出現(xiàn)霉菌污染；菌株Ld-Es-3生長(zhǎng)良好，約30.80 d長(zhǎng)滿基質(zhì)，10瓶栽培種中有2瓶出現(xiàn)霉菌污染；菌株Ld-Es-2菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌絲長(zhǎng)滿瓶的時(shí)間約為37.00 d，10瓶栽培種中有4瓶霉菌污染（表2）。各菌株長(zhǎng)滿瓶固體基質(zhì)所需時(shí)間差異顯著，菌株Ld-Es-1所需最短。

圖1 PCR擴(kuò)增松乳菇菌株rDNA ITS序列Fig.1 PCR amplification of rDNA ITS sequence of L.deliciosus strains

圖2 松乳菇菌株在錐形瓶中的培養(yǎng)情況Fig.2 Cultivation of L.deliciosus strains in triangle flasks

2.4 接種松乳菇對(duì)馬尾松菌根侵染率和生長(zhǎng)的影響

在松乳菇與馬尾松共培養(yǎng)約6個(gè)月后，由圖3可直觀看出，接種處理的馬尾松長(zhǎng)勢(shì)遠(yuǎn)好于CK。測(cè)定馬尾松幼苗根系的菌根侵染率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3株供試菌株處理下馬尾松的菌根侵染率均在70.00%左右，馬尾松根系形成外生菌根，根尖表面布滿外生菌根真菌菌絲，而CK的馬尾松根系未發(fā)現(xiàn)菌根。

在松乳菇與馬尾松共培養(yǎng)11個(gè)月后，接種處理的馬尾松菌根侵染率均在95.00%以上，顯著高于CK，其中，L-1處理的馬尾松菌根侵染率高達(dá)98.36%，與L-3處理差異顯著（＜0.05，下同），與L-2處理差異不顯著（＞0.05，下同）（表3）。

由表3還可看出，在松乳菇與馬尾松共培養(yǎng)11個(gè)月后，接種處理表現(xiàn)出對(duì)馬尾松生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用，苗木的干重、株高、地徑、主根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)均有所增加，各生長(zhǎng)指標(biāo)均與CK差異顯著。與CK相比，接種處理馬尾松干重增加5.41%～19.25%，株高增加11.15%～20.59%，主根長(zhǎng)增加12.58%～28.90%，側(cè)根數(shù)增加34.88%～46.42%，地徑增加52.63%～68.42%，增幅最大。說明接種松乳菇能大幅度提高馬尾松苗木各生長(zhǎng)指標(biāo)，顯著改善苗木質(zhì)量，其中，L-1處理的馬尾松干重、株高、地徑、主根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)增幅最大，效果最優(yōu)。

表2 松乳菇栽培種的培養(yǎng)特征Table 2 Cultural characteristics of L.deliciosus cultivar

圖3 松乳菇與馬尾松共培養(yǎng)后馬尾松長(zhǎng)勢(shì)Fig.3 Growth of P.massoniana after co-cultivation of L.deliciosus strains with P.massoniana

表3 接種松乳菇對(duì)馬尾松生長(zhǎng)及菌根侵染率的影響（n=20）Table 3 Effects of L.deliciosus inoculation on the growth and the mycorrhizal infection rate of P.massoniana（n=20）

2.5 接種松乳菇對(duì)馬尾松N、P、K含量的影響

N、P、K等大量營(yíng)養(yǎng)元素含量是衡量植物養(yǎng)分狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，優(yōu)良的外生菌根真菌與植物根系形成外生菌根，能活化土壤中的難溶性或難分解物質(zhì)，從而促進(jìn)共生植物吸收養(yǎng)分。由表4可知，在松乳菇與馬尾松共培養(yǎng)11個(gè)月后，L-1處理顯著提高了馬尾松根系和葉片的N和P含量，但K含量與CK差異不顯著。與CK相比，接種處理的根系N含量增加17.97%～44.04%，根系P含量增加13.03%～33.24%；接種處理的葉片N含量增加10.02%～45.17%，葉片P含量增加22.72%～49.84%；且馬尾松葉片的N和P含量均高于根系。由此表明，松乳菇接種處理不僅有利于根系吸收土壤中N、P元素，還能促進(jìn)根系養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片。不同接種處理相比，各處理間馬尾松根系和葉片的N、P含量有差異，其中L-1處理根系和葉片的N、P含量均顯著高于L-3處理。

2.6 松乳菇子實(shí)體的形成及接種處理對(duì)子實(shí)體形成的影響

在松乳菇與馬尾松共培養(yǎng)約6個(gè)月后，3個(gè)供試菌株接種處理土壤中均有白色的菌絲體，而CK土壤中沒有肉眼可見的白色菌絲。在松乳菇與馬尾松共培養(yǎng)13個(gè)月后，松乳菇接種處理各重復(fù)均出菇，而CK沒有松乳菇出現(xiàn)，松乳菇子實(shí)體在馬尾松的莖基部生長(zhǎng)，單生，從出菇至成熟需10 d左右，共獲得24個(gè)松乳菇子實(shí)體，平均出菇量為2.67個(gè)/m，產(chǎn)量為80.67 g/m，菇體的形態(tài)特征與其野生菌相似，進(jìn)一步證實(shí)3種受試菌為松乳菇。分析3種受試菌子實(shí)體形成的差異，結(jié)果（表5）表明，L-1和L-3處理的子實(shí)體總鮮重稍高，L-2處理子實(shí)體總鮮重最低，L-1處理的總鮮重顯著高于L-2處理，但松乳菇平均出菇數(shù)和平均鮮重差異不顯著。

表4 接種松乳菇對(duì)馬尾松根系和葉片N、P、K含量的影響（mg/g）（n=20）Table 4 Effects of L.deliciosus inoculation on N，P and K contents in roots and leaves of P.massoniana（mg/g）（n=20）

表5 不同處理松乳菇子實(shí)體形成情況Table 5 Fruiting formation of L.deliciosus in different treatments

分析各接種處理松乳菇的平均出菇數(shù)、總鮮重、平均鮮重與馬尾松菌根侵染率的相關(guān)性，結(jié)果如表6所示，因接種處理各重復(fù)的出菇數(shù)差異較大，松乳菇平均出菇數(shù)、總鮮重與馬尾松菌根侵染率間的相關(guān)性不顯著。

3 討論

3.1 分子鑒定對(duì)松乳菇菌種的重要性及松乳菇的營(yíng)養(yǎng)特征

傳統(tǒng)的真菌鑒定主要依據(jù)子實(shí)體的形態(tài)特征和菌種的培養(yǎng)特征，但乳菇屬多個(gè)種形態(tài)特征十分相似，基于子實(shí)體形態(tài)學(xué)特征鑒別野生菌根性食用菌易受到環(huán)境和個(gè)人主觀因素的影響，從該子實(shí)體分離獲得的菌種培養(yǎng)特征鑒定也不盡科學(xué)。隨著核酸分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，rDNA ITS序列作為一種分子標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于真菌鑒定（郭亮等，2011；岳萬松等，2014），利用分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定真菌，結(jié)果更準(zhǔn)確更可靠。在本研究中，3株受試菌均能在PDA瓊脂培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)，菌落培養(yǎng)特征不同，rDNA ITS序列分子鑒定結(jié)果表明均為松乳菇，其ITS序列與已有的松乳菇ITS序列相似度均大于99.00%。在脫離松屬植物環(huán)境條件下，利用松木屑、棉籽殼、稻草粉等木質(zhì)素和纖維素含量高的原料作為離體培養(yǎng)松乳菇的基質(zhì)，松乳菇菌絲體能實(shí)現(xiàn)良好生長(zhǎng)，表明松乳菇屬于兼腐生外生菌根真菌，實(shí)現(xiàn)其馴化栽培具有可行性（陳玉華等，2013）。

3.2 松乳菇接種與馬尾松生長(zhǎng)的關(guān)系

根際微生物對(duì)植物生長(zhǎng)與養(yǎng)分吸收有重要作用，外生菌根真菌能增加根際土壤肥力，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，植株生物量、株高、地徑、主根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)是評(píng)價(jià)苗木質(zhì)量的重要指標(biāo)（陳新等，2018）。外生菌根真菌侵染共生植物根系后，改變根系形態(tài)，增加植物根系的適應(yīng)性，促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)，提高地徑和側(cè)根數(shù)，進(jìn)而擴(kuò)大根系吸收養(yǎng)分的面積（宋志強(qiáng)等，2020）。在松乳菇與馬尾松共培養(yǎng)11個(gè)月后，3株松乳菇均顯著提高了馬尾松的菌根侵染率，使馬尾松的菌根侵染率高達(dá)95.29%～98.36%。外源接種松乳菇大幅提高了馬尾松的生長(zhǎng)指標(biāo)，尤其是地徑和側(cè)根數(shù)增加幅度較大。松乳菇顯著提高了馬尾松對(duì)N、P養(yǎng)分的吸收，且N、P在馬尾松葉片中的含量分配比例高于根系，但對(duì)K養(yǎng)分的吸收影響不顯著，該結(jié)果與松乳菇對(duì)馬尾松的養(yǎng)分含量影響結(jié)果一致（辜夕容等，2005；楊艷美，2011）。總的來看，Ld-1處理無論對(duì)馬尾松苗木的菌根侵染率、生長(zhǎng)及N、P養(yǎng)分吸收影響效果均優(yōu)于Ld-3和Ld-2處理。

表6 馬尾松菌根侵染率與松乳菇子實(shí)體生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)分析Table 6 Correlation analysis of mycorrhizal ratio of P.massoniana with fruiting growth of L.deliciosus

3.3 共培養(yǎng)對(duì)松乳菇馴化栽培的影響

對(duì)于大多數(shù)菌根性食用菌而言，由于人工培養(yǎng)菌根苗木的外延菌絲難以形成菌索，無法分化形成子實(shí)體（馮萬艷等，2019）。在本研究中，松乳菇成功實(shí)現(xiàn)子實(shí)體分化，表明馬尾松菌根上的松乳菇外延菌絲能延伸生長(zhǎng)，并與土壤相互交織形成菌索。但3個(gè)菌株與馬尾松共培養(yǎng)仍表現(xiàn)為松乳菇出菇周期長(zhǎng)，出菇量低。本研究中松乳菇在共生培養(yǎng)13個(gè)月后出菇，出菇周期較短，松乳菇產(chǎn)量較低，僅80.67 g/m，低于新西蘭輻射松林共生栽培松乳菇的產(chǎn)量300 g/m（Guerin-Laguette et al，2014）。本研究中松乳菇的平均出菇數(shù)、總鮮重與馬尾松菌根侵染率間的相關(guān)性不顯著，原因與松乳菇外延菌絲生物量的積累不夠有密切聯(lián)系，外生菌根形成、菌索形成及子實(shí)體分化是一個(gè)連續(xù)的過程，土壤有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)貧乏影響了松乳菇外延菌絲的生長(zhǎng)及累積（羅佳煜等，2021），后期共生栽培需要以提高有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給為出發(fā)點(diǎn)，或覆土增加小分子有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，亦或從分子水平上改造松乳菇分泌降解有機(jī)物質(zhì)的酶（凡啟超，2016）。今后還需要進(jìn)一步優(yōu)化松乳菇出菇的營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件，建立更為成熟的松乳菇與馬尾松的共培養(yǎng)體系。

4 結(jié)論

rDNA ITS方法可準(zhǔn)確鑒定野生松乳菇，外源接種松乳菇能促進(jìn)馬尾松苗木的生長(zhǎng)及對(duì)N、P等元素的利用，菌根侵染率的提高有利于松乳菇子實(shí)體形成，湖北省恩施市境內(nèi)的松乳菇資源可作為馴化栽培松乳菇的潛在優(yōu)良菌株。