坡柳種子精油對(duì)5種植物病原真菌的熏蒸活性及化學(xué)成分分析

劉全俊，付立新，2，張揚(yáng)，李豐超，于航，李金梁，秦小萍*

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南昆明 650201；2德宏職業(yè)學(xué)院，云南芒市 678400；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)水利學(xué)院，云南昆明 650201）

0 引言

【研究意義】立枯絲核菌（）、番茄灰霉病菌（）、尖孢鐮刀菌（）、芒果炭疽病菌（）、番茄早疫病菌（）是引起水果和蔬菜病害的重要病原真菌（吳瓊等，2018；郭敬等，2020；李其利等，2020；呼李樂(lè)等，2021；田春英等，2021），目前主要采用化學(xué)制劑防控上述病原菌引發(fā)的病害，但化學(xué)殺菌劑通常會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染并引發(fā)病原菌的抗藥性，因而越來(lái)越多的學(xué)者致力于開(kāi)發(fā)無(wú)污染、低毒和低殘留的合成殺菌劑替代品用于植物病原真菌控制。坡柳［（Linn.）Jacq.］又名車(chē)桑子，是無(wú)患子科（Sapindaceae）車(chē)桑子屬（）常綠灌木，其化學(xué)成分豐富，具有抗菌、抗病毒、抗炎和殺蟲(chóng)等潛力（牛紅梅，2010）。因此，從具有良好應(yīng)用前景的坡柳中提取種子精油并探究其抗菌活性物質(zhì)，對(duì)植物病害防控，保障農(nóng)作物安全生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】趙紅艷和楊美林（2006）采用菌落直徑法研究坡柳種子提取物對(duì)4種病原真菌［燕麥鐮刀菌（）、梨黑星病菌（VTanaka et Yamamoto）、煙草赤星病菌（）和番茄早疫病菌］菌落生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，乙醇提取物抑菌效果最好。趙紅艷等（2007）研究發(fā)現(xiàn)氯仿提取物對(duì)米象［（Linnaeus）］有顯著的觸殺活性。秦小萍等（2008a，2008b）研究報(bào)道坡柳種子乙醇提取物對(duì)小菜蛾［（L.）］4齡幼蟲(chóng)具有很強(qiáng)的拒食作用，對(duì)高粱、小麥和稗草的幼根具有較好的抑制活性。Pirzada等（2010）用氯仿、乙醇、甲醇、乙酸乙酯和水提取坡柳葉片化學(xué)成分，并測(cè)試對(duì)黑曲霉（）、黃曲霉（）、擬青霉（）、石膏樣小孢子菌（）和紅色毛癬菌（）的抑制活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯仿提取物對(duì)供試真菌具有很強(qiáng)的抑制活性。吳道慧等（2014）及張余杰等（2014a，2014b）采用浸漬葉碟飼喂法測(cè)定坡柳皂苷對(duì)棉鈴蟲(chóng)［（Hübner）］、大菜粉蝶（）、粘蟲(chóng)［（Walker）］生長(zhǎng)發(fā)育的影響，結(jié)果顯示，坡柳皂苷對(duì)棉鈴蟲(chóng)、大菜粉蝶和粘蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用，且隨濃度的增大而提高。代玉玲等（2015）采用無(wú)限量取食法、葉碟法和半葉法分別測(cè)定坡柳皂苷對(duì)果蠅（）的胃毒活性、小菜蛾幼蟲(chóng)的非選擇性拒食活性及甘藍(lán)蚜蟲(chóng)（）的選擇性拒食活性，結(jié)果表明，坡柳皂苷對(duì)果蠅和小菜蛾具有較好的生物活性，對(duì)甘藍(lán)蚜蟲(chóng)的活性一般。張揚(yáng)等（2018）采用小孔樹(shù)脂、凝膠Sephadex LH-20、反相色譜ODS及制備型高效液相色譜（PreHPLC）等分離技術(shù)從坡柳種子乙醇提取物中分離獲得1種活性化合物，測(cè)試發(fā)現(xiàn)其對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)具有較好的非選擇性拒食活性。Bimani和Hossain（2020）以正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取坡柳葉片中化學(xué)成分，并測(cè)試對(duì)5種細(xì)菌的活性，結(jié)果表明，乙酸乙酯和氯仿提取物的抑菌活性最高，而正己烷提取物的抑菌活性最低。胡棟寶等（2021）以車(chē)桑子種子為試材，采用超聲波輔助法提取總黃酮，并考察其體外抗氧化活性，結(jié)果表明，車(chē)桑子種子黃酮提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基具有較強(qiáng)的清除能力，且對(duì)Fe也具有較強(qiáng)的還原能力。于航等（2021）通過(guò)透射電鏡觀(guān)察了大菜粉蝶4齡幼蟲(chóng)取食含坡柳皂苷葉碟后的中腸組織病理變化，結(jié)果表明，在1 mg/mL坡柳皂苷的作用下，大菜粉蝶幼蟲(chóng)圍食膜和微絨毛消失，腸細(xì)胞與底膜分離，腔內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，溶酶體活動(dòng)劇增，細(xì)胞器及細(xì)胞體出現(xiàn)自溶，光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極度膨大。【本研究切入點(diǎn)】近年來(lái)對(duì)坡柳種子的報(bào)道多見(jiàn)于其溶劑提取物應(yīng)用方面，對(duì)其精油的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以坡柳種子為材料，采用同時(shí)蒸餾萃取法獲取坡柳種子精油，并用對(duì)扣熏蒸法測(cè)試其對(duì)5種植物病原真菌（立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、芒果炭疽病菌和番茄早疫病菌）的抑制活性；通過(guò)氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進(jìn)一步分析坡柳種子精油的化學(xué)成分，以期篩選出可有效防控植物病原微生物的天然產(chǎn)物，為下一步開(kāi)發(fā)為植物源殺菌劑打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

坡柳種子購(gòu)于云南生態(tài)技術(shù)有限公司，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)分類(lèi)專(zhuān)家李孫文副教授鑒定，標(biāo)本存放于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院化學(xué)樓生物農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室。供試菌株：立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、番茄早疫病菌和芒果炭疽病菌均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥與化學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供，用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)保存。

主要儀器：SE602F型電子天平（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；XL-60C粉碎機(jī)（廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）；DHT型攪拌調(diào)溫電熱套（鄄城光明儀器有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市國(guó)華電器有限公司）；N-1100D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海市泉杰儀器有限公司）；DLSB-5L/20型低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義予華儀器有限公司）；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵（上海市子期實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；水蒸氣蒸餾裝置，本實(shí)驗(yàn)室定制；安捷倫7890-5975N氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)/安捷倫科技）。

主要試劑：1-辛烯-3醇（1-octen-3-ol）［含量98%，阿拉丁試劑（上海）有限公司］；亞油酸甲酯（Methyl linoleate）［含量98%，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司］；苯甲醛（Benzaldehyde）［含量99%，安耐吉（上海）有限公司］；-戊基丁內(nèi)酯（-nonanolactone）（含量98%，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；2-正戊基呋喃（2-pentylfuran）［含量98%，阿拉丁試劑（北京）有限公司］；99%無(wú)水硫酸鈉（天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；二氯甲烷（AR）（天津富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精油提取采用同時(shí)蒸餾萃取法，參照羅凱等（2012）的方法略作修改。稱(chēng)取70 g坡柳種子放入1 L的物料瓶中，加入700 mL蒸餾水混合均勻，在物料瓶中加入少量沸石；用量筒量取250 mL二氯甲烷（分析純）加入另一500 mL平底燒瓶中；將物料瓶、燒瓶與水蒸氣蒸餾裝置固定連接，打開(kāi)冷凝循環(huán)，打開(kāi)電熱套開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)溫度，待第1滴餾出液滴下開(kāi)始計(jì)時(shí)，蒸餾12 h后停止加熱；待裝置冷卻后，取下蒸餾裝置，向裝有二氯甲烷的燒瓶中加入過(guò)量無(wú)水硫酸鈉去水，振蕩搖晃，過(guò)濾；濃縮濾液得坡柳種子精油，計(jì)算得率。將精油保存在棕色瓶中，封口備用。

1.2.2 坡柳種子精油對(duì)5種植物病原真菌的熏蒸抑菌活性采用對(duì)扣熏蒸法（廖旺姣等，2014）測(cè)試精油對(duì)5種供試植物病原真菌的抑制活性；采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定精油對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性。無(wú)菌培養(yǎng)皿2個(gè)（內(nèi)徑9 cm），一皿為PDA培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中央接入1個(gè)病原菌菌餅（直徑0.5 mm），另一皿為空白平板，分別設(shè)置10和50μL/L的一定體積的精油平均分布在濾紙片（直徑2 cm）上，兩皿合并（體積0.25 L）進(jìn)行對(duì)扣熏蒸試驗(yàn)，PDA平板在下，涂藥或空白平板在上。每種病原菌設(shè)1組對(duì)照，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)溫度為（25±1）℃、光周期L∶D=24 h∶0 h。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.3 坡柳種子精油成分分析GC條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度230℃，檢測(cè)器溫度260℃；柱溫：初始溫度40℃，程序升溫5℃/min升溫至260℃，保持30 min；柱流量（Ne）為1.0 mL/min；柱前壓100 kPa；進(jìn)樣量1.0μL；分流比10∶1；載氣為高純氦氣。

MS條件：電離方式EI；電離能量70 eV；離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，全掃描質(zhì)量范圍50～550 m/z記錄質(zhì)量譜；接口溫度280℃；流速1.0 mL/min；采用NIST 05標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)計(jì)算機(jī)檢索定性。

1.2.4 坡柳種子精油的5種單體成分對(duì)5種植物病原真菌的熏蒸抑菌活性采用對(duì)扣熏蒸法：將1-辛烯-3-醇、亞油酸甲酯、苯甲醛、-戊基丁內(nèi)酯和2-正戊基呋喃配置成50μL/L的溶液，測(cè)試對(duì)5種植物病原真菌的熏蒸抑制活性，測(cè)定方法同1.2.2。

1.2.5 坡柳種子精油的2種單體成分對(duì)5種植物病原真菌熏蒸抑菌活性的抑制中濃度（IC）采用對(duì)扣熏蒸法：將1-辛烯-3-醇和苯甲醛配置成系列梯度濃度，分別測(cè)試對(duì)5種植物病原真菌的IC，測(cè)定方法同1.2.2。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)不同處理的差異性進(jìn)行分析，Probit概率分析法計(jì)算IC。

2 結(jié)果與分析

2.1 坡柳種子精油得率

以料液比1∶10提取12 h，消耗坡柳種子3000 g，得精油質(zhì)量2.88 g，計(jì)算得出坡柳種子精油提取率為0.096%。

2.2 坡柳種子精油對(duì)5種植物病原真菌的熏蒸抑菌活性

如表1所示，坡柳種子精油對(duì)5種供試植物病原真菌有不同程度的抑制作用，隨著精油濃度升高，對(duì)病原菌的抑制率也升高。當(dāng)坡柳種子精油濃度為10μL/L時(shí)，對(duì)立枯絲核菌的活性最好，抑制率為60.50%，抑制率顯著高于對(duì)其他病原菌處理（＜0.05，下同）；對(duì)番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌的活性最差。當(dāng)坡柳種子精油濃度為50μL/L時(shí)，對(duì)尖孢鐮刀菌的活性最好，抑制率為100.00%，抑制率顯著高于對(duì)其他病原菌處理；其次是對(duì)芒果炭疽病菌的活性，抑制率為87.10%；對(duì)番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的活性最差。

2.3 GC-MS分析結(jié)果

2.3.1 坡柳種子精油的總離子流圖采用GC-MS分析坡柳種子精油，通過(guò)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按面積歸一化法測(cè)得揮發(fā)油各組分含量。按照設(shè)定的GC-MS條件對(duì)坡柳種子精油進(jìn)行分析，得坡柳種子精油總離子流圖（圖1）。

2.3.2 坡柳種子精油的主要化學(xué)成分GC-MS分析結(jié)果顯示，坡柳種子精油包含79種化合物（表2）。其中相對(duì)含量大于3.000%的有10種化合物，分別為苯甲醛（3.241%）、1-辛烯-3-醇（5.611%）、2-正戊基呋喃（5.896%）、-戊基丁內(nèi)酯（5.820%）、亞油酸甲酯（5.507%）、1-己醇（5.328%）、2-丁基-2-辛烯醛（4.128%）、松柏烯（6.966%）、依蘭油烯（3.464%）和棕櫚酸甲酯（3.385%）。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，參考市售的化合物種類(lèi)，本研究選取1-辛烯-3醇、亞油酸甲酯、苯甲醛、-戊基丁內(nèi)酯和2-正戊基呋喃等5種化合物進(jìn)行抑菌活性測(cè)試。

2.4 5種化合物對(duì)5種植物病原真菌熏蒸抑菌活性

由表3可知，在處理濃度為50μL/L時(shí)，1-辛烯-3-醇和苯甲醛對(duì)5種植物病原真菌均表現(xiàn)出完全抑制；亞油酸甲酯對(duì)番茄灰霉病菌表現(xiàn)出活性，但對(duì)其余4種植物病原真菌無(wú)活性或活性差；-戊基丁內(nèi)酯對(duì)立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌和番茄早疫病菌有不同程度的抑制活性，其中對(duì)尖孢鐮刀菌的活性最好，抑制率為58.9%，其次是對(duì)立枯絲核菌，抑制率為50.7%，而對(duì)芒果炭疽病菌無(wú)活性；2-正戊基呋喃僅對(duì)立枯絲核菌具有活性，抑制率為51.9%，對(duì)其余4種病原菌無(wú)抑制活性。

表1 坡柳種子精油對(duì)5種植物病原真菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率Table 1 Inhibition rate of essential oil of D.viscosa seed on mycelium of 5 plant pathogenic fungi

圖1 坡柳種子精油總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of essential oils of D.viscosa seed

2.5 2種化合物對(duì)5種植物病原真菌熏蒸抑菌活性的IC50

選擇對(duì)5種供試植物病原真菌抑制活性最好的2種化合物苯甲醛和1-辛烯-3-醇進(jìn)行熏蒸毒力測(cè)定，結(jié)果（表4）顯示，2種化合物對(duì)5種植物病原真菌均有較好的抑菌活性。

3 討論

本研究采用同時(shí)蒸餾萃取法獲取坡柳種子精油，使用對(duì)扣熏蒸法測(cè)試了坡柳種子精油對(duì)5種植物病原真菌的抑制活性，結(jié)果表明坡柳種子精油對(duì)供試5種病原真菌具有不同程度的抑制活性。利用植物精油抑制植物病原真菌的研究較多，有研究報(bào)道珊瑚姜塊揮發(fā)精油（羅世瓊等，2013）、薰衣草精油（劉凡等，2017）和百里香精油（張阿強(qiáng)等，2017）對(duì)立枯絲核菌具有較好的抑菌活性。Chala等（2014）用玫瑰草（）和黑小茴香（）的揮發(fā)物測(cè)試對(duì)芒果炭疽病菌的抑菌活性，結(jié)果顯示對(duì)芒果炭疽病菌的生長(zhǎng)抑制率為100%。本研究發(fā)現(xiàn)，坡柳種子精油在濃度為50μL/L時(shí)對(duì)立枯絲核菌和

芒果炭疽病菌的抑制率分別為81.10%和87.10%，雖然測(cè)定方法不同，但比較測(cè)定濃度的差異性，坡柳種子精油對(duì)立枯絲核菌和芒果炭疽病菌的抑制效果明顯，應(yīng)給予高度關(guān)注。林霜霜等（2017）研究了檸檬香茅（）精油及其主要成分檸檬醛對(duì)番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和辣椒尖孢鐮刀菌的抑制活性，結(jié)果表明，在200 mg/L濃度下檸檬香茅精油對(duì)3種病菌的抑制率分別為67.02%、32.03%

和20.42%。Zhao等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，牛至（）精油對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)有較好的抑制作用，當(dāng)精油濃度為250 mg/L時(shí)對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率可達(dá)96.39%，其成分中的香芹酚和百里香酚濃度為125 mg/L時(shí)對(duì)番茄灰霉病菌表現(xiàn)出完全抑制。本研究用50μL/L坡柳種子精油熏蒸尖孢鐮刀菌、番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌，抑菌率分別為100.00%、28.70%和28.60%。相比林霜霜等（2017）的結(jié)果，本研究使用的坡柳種子精油濃度更低，且對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果較好，對(duì)番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌效果較差；相比于Zhao等（2021）的結(jié)果，本研究所用濃度也偏低，若適當(dāng)提高精油濃度，抑菌活性可能也會(huì)提升。

表2 坡柳種子精油GC-MS分析結(jié)果Table 2 GC-MS analysis results of the essential oil of D.viscosa seed

續(xù)表2坡柳種子精油GC-MS分析結(jié)果Continue Table 2 GC-MS analysis results of the essential oil of D.viscosa seed

表3 5種化合物純品對(duì)5種植物病原真菌的熏蒸抑制率（%）Table 3 Fumigation inhibition rates of 5 pure compounds against 5 plant pathogenic fungi（%）

表4 2種化合物純品對(duì)5種植物病原真菌的IC50（μL/L）Table 4 IC50 of 2 pure compounds against 5 plant pathogenic fungi（μL/L）

坡柳植物中化合物種類(lèi)豐富，牛紅梅（2010）從地上部分（枝、葉和果實(shí)）的甲醇提取物中共分離鑒定得到12種化合物，包括2種新的二萜類(lèi)化合物和2種新的異戊烯基黃酮類(lèi)化合物，其中的2種新型二萜類(lèi)化合物對(duì)致倦庫(kù)蚊（）4齡幼蟲(chóng)顯示出毒殺活性。張來(lái)賓（2012）從其地上部分乙醇提取物的二氯甲烷部位共分離鑒定得到35種化合物，其中10種新的異戊烯基黃酮類(lèi)化合物，7種新的二萜類(lèi)化合物。本研究利用同時(shí)蒸餾萃取法獲取坡柳種子精油，并用GC-MS分析了其化學(xué)成分，共得到79種化合物。相比牛紅梅（2010）和張來(lái)賓（2012）的研究結(jié)果，坡柳種子精油化學(xué)成分種類(lèi)更多。由于提取化合物的技術(shù)和溶劑不同，導(dǎo)致獲得的化合物種類(lèi)不同（徐凱節(jié)等，2013；牛彪等，2019），若要明確坡柳植物中化合物的種類(lèi)，還有待深入研究。

選取坡柳種子精油中的5種化合物苯甲醛、1-辛烯-3-醇、2-正戊基呋喃、亞油酸甲酯和-戊基丁內(nèi)酯純品對(duì)5種植物病原真菌立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、番茄早疫病菌和芒果炭疽病菌進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果顯示，苯甲醛和1-辛烯-3-醇在濃度為50μL/L時(shí)對(duì)5種供試植物病原真菌的抑制率為100.0%。1-辛烯-3-醇和苯甲醛作為食物香料和食物添加劑多通過(guò)化學(xué)途徑合成（張雷亮等，2017）。Herrera等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，1-辛烯-3-醇能有效防治玉米象甲（）和黃萎病真菌（）。Lee等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，苯甲醛對(duì)稻象甲（）有較好的熏蒸毒力。李雪玲和凌瑋瑋（2010）研究了桃仁中苯甲醛的提取及其抑菌作用，結(jié)果表明，在0.5 mol/L硫酸、80℃條件下水解80 min提取的天然苯甲醛對(duì)霉菌和細(xì)菌均有一定的抑制作用。此外，苯甲醛衍生物在生物活性方面多有利用，李曉榮（2012）報(bào)道苯甲醛希夫堿對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（G）的典型菌株金黃色葡萄球菌（）和革蘭氏陰性菌（G）的典型菌株肺炎克雷伯桿菌（）具有抑菌作用。1-辛烯-3-醇和苯甲醛可作為食品香料及食品添加劑使用，且2種化合物對(duì)立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、芒果炭疽病菌和番茄早疫病菌具有較好的抑菌活性，結(jié)合其具有防腐性、芳香性的特點(diǎn)，表明1-辛烯-3-醇和苯甲醛在食品防腐研究及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物病害防治上具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

坡柳種子精油中化學(xué)成分種類(lèi)豐富，其中1-辛烯-3醇和苯甲醛的活性最好。坡柳種子精油具有開(kāi)發(fā)成為新型植物源殺菌劑的潛力。