甘薯基腐病病原鑒定及生長特性測定

唐偉，張成玲，王芳，楊冬靜，馬居奎，陳晶偉，謝逸萍，孫厚俊*

（1.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，江蘇徐州 221131；2寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040）

0 引言

【研究意義】甘薯［（L.）Lam］俗稱番薯、紅薯、山芋等，隸屬于旋花科甘薯屬，因其具有高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)、營養(yǎng)豐富的特點廣泛種植于世界上100多個國家和地區(qū)（馬代夫等，2021；王欣等，2021；趙凌霄等，2021），是一種重要的糧食作物，也可用作食品加工作物、保健、蔬菜和觀賞作物。我國是世界上最大的甘薯種植國，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織2019年統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國甘薯種植面積占世界總種植面積的30.56%，產(chǎn)量約為5.2×10kg，占世界總產(chǎn)量的一半以上（Food and Agriculture Organization，2019）。甘薯基腐病是近年來在我國東南沿海薯區(qū)新發(fā)生的一種病害，可導(dǎo)致甘薯莖基部變褐、發(fā)黑，地上部葉片發(fā)黃枯萎，嚴(yán)重時莖基部干枯，地上部逐漸枯死，致使甘薯絕產(chǎn)。目前甘薯基腐病在我國南方沿海薯區(qū)發(fā)生并有向內(nèi)陸擴(kuò)展蔓延的趨勢，但田間生產(chǎn)上暫未發(fā)現(xiàn)有良好防效的藥劑和抗病品種，其對我國沿海及內(nèi)陸薯區(qū)甘薯生產(chǎn)帶來巨大的威脅和隱患。因此，明確甘薯基腐病病原菌，探究病原菌生物學(xué)特性，對甘薯基腐病的綜合防治具有重要的指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1913年甘薯基腐病在美國弗吉尼亞州首次報道（高巖，2020），之后在東非、巴西、日本等地相繼報道（Almeida et al.，2020；Fujiwara et al.，2021）。2008年我國在臺灣省首次發(fā)現(xiàn)（黃巧雯等，2012），2014年在我國大陸發(fā)現(xiàn)，并開始在東南沿海廣泛報道（Gai et al.，2016；余繼華，2018；余繼華等，2019）。不同地區(qū)甘薯基腐病病原菌有所不同，Gai等（2016）、黃立飛等（2019）通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定出引起浙江三門市、臺州市的甘薯莖基腐爛病的病原有擬輪枝鐮刀菌［（Sacc.）Nirenberg］、茄病鐮刀菌［（Sacc.）Mart.］、毀壞擬莖點霉菌［（Harter）Boerema Loer.&Hamers］、甘薯間座殼菌（Harter & E.C.Field）等；Almeida等（2020）通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法明確了是引起巴西甘薯基腐病病原。間座殼菌屬于子囊殼菌綱（Ascomycota），間座殼目（Diaporthales），間座殼科（Diaporthaceae），其無性態(tài)為擬莖點霉屬（）真菌。在甘薯上，甘薯間座殼菌可造成甘薯干腐病和蔓枯?。▌⑥染?，2017；謝昀燁等，2021），致使薯塊兩端薯皮褐化皺縮，后期組織壞死，病部出現(xiàn)黑色瘤狀突起，影響甘薯的儲存和翌年薯苗繁育。目前對甘薯間座殼菌的防治措施較少，Lee等（2019）通過測定氣態(tài)二氧化氯（ClO）處理后菌絲生長和接種病變直徑，發(fā)現(xiàn)氣態(tài)二氧化氯可在體內(nèi)和體外抑制甘薯間座殼菌的生長；Fujiwara等（2021）開發(fā)的熒光定量檢測技術(shù)能對甘薯間座殼菌和毀壞間座殼菌（）實現(xiàn)定量檢測，為甘薯基腐病快速診斷和防治策略制定提供技術(shù)支撐；近期，Yang等（2022）通過基因組測序獲得甘薯間座殼菌的基因組草圖，為病原菌比較基因組學(xué)研究提供了新的基因信息資源以及防治甘薯間座殼菌提供了研究基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c】前期對甘薯基腐病的研究僅集中在病原物的分離鑒定及病原菌的快速檢測等方面，關(guān)于甘薯基腐病病原菌生長特性的研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以采自浙江省寧波市寧海縣甘薯基腐病病樣為材料，采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離，并用離體莖稈接種法進(jìn)行柯赫氏法則驗證；采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對病原菌的種類進(jìn)行鑒定，并通過菌絲培養(yǎng)法研究病原菌在不同環(huán)境下的生物學(xué)特征，為甘薯基腐病的預(yù)防和田間防治提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從浙江省寧波市寧海縣甘薯病田中采集具有甘薯基腐病典型癥狀的甘薯植株。供試甘薯品種為煙薯25。

主要儀器與試劑：顯微鏡（Leica DM 4000 B配Leica DFC550，Leica Microsystems，Mannheim，Germany）；PCR儀（USA，Bio-Rad Laboratories）；凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518229）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR mix購自北京擎科生物科技有限公司；葡萄糖等均為國產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）、察氏培養(yǎng)基（CDM）、甘薯葡萄糖培養(yǎng)基（SPDA）、燕麥片培養(yǎng)基（OMA）、胡蘿卜培養(yǎng)基（CA）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離采用組織分離法對具有基腐病典型特征的甘薯病樣進(jìn)行病原菌分離純化（方中達(dá)，1998）。

1.2.2 病原菌致病力測定用無菌水配置孢子懸浮液，用無菌小刀在煙薯25莖部縱割約2 cm長傷口，將孢子懸浮液注入傷口中，25℃保濕培養(yǎng)，以接種無菌水為對照，記錄發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌形態(tài)和分子鑒定將從接種發(fā)病甘薯上分離純化的病原菌在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落特征。以水為載體，挑取菌絲，顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)并拍照。

利用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取病原菌基因組DNA。利用ITS引物（ITS1：5'-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3'/ITS4：5'-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3'），Cal引物（Cal-228F：5'-GAGTTCAA GGAGGCCTTCTCCC-3'/Cal-737R：5'-CATCTTTCT GGCCATCATGG-3'）、His3引物（CYL-H3-1a：5'-AG GTCCACTGGTGGAAG-3'/CYL-H3-1b：5'-GCGGG CGAGCTGGATGTCCTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接至pMD18-T，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。序列上傳至GenBank，利用Clstualx 2.0進(jìn)行多重序列比對，利用MEGA 6.06采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 病原菌生物學(xué)特性測定

1.2.4 .1不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響用打孔器將培養(yǎng)7 d的病原菌沿菌絲外周打孔，形成直徑為5 mm的病原菌菌餅，將菌餅置于不同培養(yǎng)基中央。每處理重復(fù)3皿，培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 .2不同碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等量的葡萄糖、木糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、糊精、纖維素和甘露糖代替蔗糖，制成不同的碳源培養(yǎng)基；以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等量的草酸銨、甘氨酸、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、磷酸氫二銨、亞硝酸鈉和尿素代替硝酸鈉，制成不同的氮源培養(yǎng)基。每處理重復(fù)3皿，培養(yǎng)7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑（下同）。

1.2.4 .3不同溫度、pH對病原菌菌絲生長的影響將病原菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基中央，分別置于15、20、25、30和35℃5個溫度處理；利用1 mol/LHCl和1 mol/LNaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH，制成pH依次為4、5、6、7、8、9、10、11和12的PDA培養(yǎng)基，將病原菌菌餅置于培養(yǎng)基中央進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 .4病原菌致死溫度測定刮取在PDA培養(yǎng)上培養(yǎng)3～4 d的病原菌菌絲，用無菌水配制菌絲懸浮液；吸取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后分泌的病原菌孢子液，用無菌水稀釋形成孢子懸浮液；將孢子懸浮液盛于1.5 mL離心管中置于恒溫水浴鍋，分別在40、45、50、55、60、65和70℃下處理5、10和15 min；將處理后的懸浮液吸取150μL涂布于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5 d，觀察孢子及菌絲生長情況。根據(jù)試驗結(jié)果選取菌落生長變化之間的溫度，設(shè)置1℃的溫差再進(jìn)行試驗。

1.3 統(tǒng)計分析

利用IBM SPSS Statistics 25對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及致病性測定結(jié)果

從浙江寧海甘薯田間采集莖基部變黑腐爛的樣品（圖1-A），分離純化獲得1株菌株，標(biāo)記為RFNH。將分離獲得的菌株RF-NH接種到煙薯25號上，25℃保濕10 d后，接種部位四周出現(xiàn)黑色病斑，并逐漸擴(kuò)展（圖1-D）；對照接種部位無黑色病斑（圖1-E）。通過柯赫氏法則，從接種莖稈處重新分離獲得與接種菌株形態(tài)一致的病原菌，表明接種菌為甘薯基腐病致病菌。

2.2 病原菌形態(tài)觀察結(jié)果

菌落大致呈圓形但邊緣不規(guī)則，在PDA培養(yǎng)基上菌落菌絲初期為白色，后期菌落從中心向外周顏色逐漸加重呈黃褐色（圖1-F）；在培養(yǎng)基上單生或聚生黑色珊瑚狀或管狀分生孢子器，分泌淡黃色或白色液體，內(nèi)含大量分生孢子（圖1-B、圖1-C、圖1-G和圖1-H）。在顯微鏡下觀察，可見梭狀無色透明分生孢子，大小為3.166～4.563μm×6.954～11.327μm，大部分內(nèi)含2個油球，偶見3個油球（圖1-H）。與前人報道間座殼菌的形態(tài)相似（黃立飛等，2019），故從形態(tài)上初步鑒定病原菌為間座殼屬真菌。

圖1 甘薯基腐病癥狀與病原菌形態(tài)Fig.1 Symptom and pathogen morphology of sweet potato foot rot disease

2.3 病原菌分子鑒定

利用ITS、和基因的通用引物對病原菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得各基因的片段（圖2），其中，ITS基因片段長579 bp，基因片段長480 bp，基因片段長537 bp，并上傳至GenBank，序列登錄號分別為OK432549、OK432550和OK432551。經(jīng)序列比對，所得基因均與甘薯間座殼菌（）的一致率為100%。從GenBank中下載間座殼屬真菌相關(guān)基因，利用MEGA 6.06的NJ法以CBS 121124相關(guān)基因作為外群，構(gòu)建基于ITS、和基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)菌株RF-NH序列與甘薯間座殼菌聚類在一起。綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株RF-NH鑒定為甘薯間座殼菌。

2.4 病原菌生物學(xué)特性測定結(jié)果

2.4.1 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響由圖4可看出，不同培養(yǎng)基對菌株RF-NH菌絲生長有顯著影響，其中菌株RF-NH在SPDA培養(yǎng)基上生長最快，培養(yǎng)5 d后菌落直徑為7.48 cm，顯著高于除CA培養(yǎng)基外的其他5種培養(yǎng)基（＜0.05，下同）；在CDM培養(yǎng)基上生長最慢，培養(yǎng)5 d后菌落直徑為2.45 cm，且菌絲稀疏。培養(yǎng)后期，在PDA、SPDA、PSA、OMA和CA培養(yǎng)基中病原菌可產(chǎn)生分生孢子，而在CDM和NA培養(yǎng)基中病原菌未產(chǎn)生分生孢子。

圖2 甘薯間座殼菌不同基因的擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Amplification electrophoretogram of different genes of D.batatas

2.4.2 碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響由圖5可知，菌株RF-NH在所測碳源和氮源下均可生長。在碳源對比中，以糊精為碳源的培養(yǎng)基上的菌落直徑最大，為6.78 cm，其次是可溶性淀粉，為5.42 cm，兩者間菌落直徑差異顯著，且均與其他碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑差異顯著；以木糖為碳源的培養(yǎng)基上的菌落直徑最小，僅為2.95 cm；盡管以纖維素為碳源的培養(yǎng)基上的菌落直徑為4.40 cm，與常規(guī)的蔗糖處理間無顯著差異（＞0.05，下同），但菌絲最為稀疏。在氮源對比中，所有測試氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑均小于對照硝酸鈉，說明培養(yǎng)基中所添加的甘氨酸、磷酸氫二銨和氯化銨等相對于硝酸鈉不利于菌落的生長，尤其是以氯化銨和磷酸氫二銨為氮源的培養(yǎng)基上的菌落直徑最小，分別為2.25和2.23 cm。從氮源種類上看，菌株RF-NH對硝態(tài)氮利用高于銨態(tài)氮。

圖3 基于ITS、Cal和His3基因序列構(gòu)建的菌株RF-NH系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain RF-NH based on ITS，Cal and His3 gene sequence

圖4 不同培養(yǎng)基對菌株RF-NH菌落生長的影響Fig.4 Effects of different media on colony growth of strain RF-NH

2.4.3 溫度和pH對病原菌菌絲生長的影響 由圖6可知，菌株RF-NH的菌落直徑先隨溫度的升高而增大，25℃時達(dá)最高值，為8.17 cm，菌落直徑與其他溫度處理差異顯著；然后隨溫度的升高，菌落直徑逐漸減小。由圖7可知，隨著pH的增加，菌株RF-NH的菌落直徑逐漸減小，pH 4時菌落直徑最大，為8.15 cm，pH 12時菌落直徑最小，為1.98 cm，在pH 8～10時菌落直徑無顯著變化。

圖5 不同碳源（A）和氮源（B）對菌株RF-NH菌落生長的影響Fig.5 Effects of different carbon（A）and nitrogen（B）sources on colony growth of strain RF-NH

2.4.4 病原菌致死溫度測定菌株RF-NH的分生孢子和菌絲懸浮液在40、45、50、55、60、65和70℃下分別處理5、10和15 min后發(fā)現(xiàn)，40～45℃各時間處理的分生孢子和菌絲均能生長，55～70℃各時間處理的分生孢子和菌絲均不能生長。在50℃時處理5 min，分生孢子和菌絲均可生長，但處理10 min后分生孢子和菌絲均不能在PDA培養(yǎng)基上形成新的菌落。將孢子懸浮液和菌絲懸浮液在46、47、48和49℃下分別處理5、10和15 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在46～49℃各處理中，孢子懸浮液均在PDA培養(yǎng)基上形成新的菌落；而菌絲于49℃處理15 min在PDA培養(yǎng)基上不能產(chǎn)生新的菌落，其余處理均能生長，說明菌株RF-NH分生孢子的致死溫度為50℃10 min，菌絲致死溫度為49℃15 min或50℃10 min。

圖6 不同溫度對菌株RF-NH菌落生長的影響Fig.6 Effects of different temperatures on colony growth of strain RF-NH

圖7 不同pH對菌株RF-NH菌落生長的影響Fig.7 Effects of different pH on colony growth of strain RF-NH

3 討論

間座殼菌無性態(tài)為擬莖點霉菌，是植物上的內(nèi)生菌或致病菌，作為致病菌常導(dǎo)致植株枯死、根腐、潰瘍等癥狀（蘇文文等，2021）。目前，Rossman等（2015）推薦采用有性態(tài)名稱，而不是無性態(tài)名稱來命名這類真菌。在甘薯上，甘薯間座殼菌前期認(rèn)為是甘薯儲藏期病害甘薯干腐病和甘薯蔓枯病的病原（劉奕君等，2017；謝昀燁等，2021）。導(dǎo)致甘薯基腐病的還有鐮刀菌等其他病原菌，包括毀壞擬莖點霉菌和茄病鐮刀菌等（黃巧雯等，2012；黃立飛等，2019）。

在分生孢子形態(tài)上，本研究人工培養(yǎng)時只觀察到α型分生孢子，未見β型分生孢子，與前期黃巧雯等（2012）對毀壞擬莖點霉菌研究發(fā)現(xiàn)β型分生孢子未在人工培養(yǎng)中出現(xiàn)，僅在發(fā)病莖稈處偶現(xiàn)相似。由于間座殼菌形態(tài)在種間和種內(nèi)具有多邊性和形態(tài)可塑性，依據(jù)形態(tài)學(xué)分類易受觀察者的主觀影響，因此間座殼菌形態(tài)特征不適用于間座殼菌分類全部依據(jù)（Udayanga et al.，2012；Gomes et al.，2013），而通過對真菌保守看家基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定已應(yīng)用于間座殼菌和鏈格孢菌等病原真菌分類。Chaisiri等（2020）通過系統(tǒng)發(fā)育分析明確了柑橘黑化病病原菌（）的分類，而本研究通過對菌株RF-NH的ITS、和聯(lián)合基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，表明所得病原菌為。

病原菌生長特性的研究對農(nóng)作物病害的田間防治和農(nóng)產(chǎn)品儲存具有指導(dǎo)意義（杜艷麗等，2019；郭強(qiáng)等，2019；王秀娟等，2019）。本研究在對甘薯間座殼菌生長特性分析時發(fā)現(xiàn)，甘薯間座殼菌在糊精、可溶性淀粉和纖維素為碳源的培養(yǎng)基中生長較快，說明該病原菌能夠有效利用多糖。而在氮源利用上，甘薯間座殼菌對硝酸鈉等硝酸鹽的利用好于氯化銨、硫酸銨等銨鹽，因此在甘薯施肥時可適當(dāng)施用銨鹽代替硝酸鹽，創(chuàng)造不利于病原菌生長的環(huán)境。

甘薯間座殼菌能在15～35℃和pH 4～12的環(huán)境中生長，其生長最適溫度為25℃，與同屬的毀壞間座殼菌的最適溫度28℃相似；甘薯間座殼菌菌絲生長最適pH為4，與菌絲生長最適pH為6有所不同，說明甘薯間座殼菌的適應(yīng)力較強(qiáng)，且與毀壞間座菌殼稍有差別（高巖，2020）。甘薯間座殼菌在供試溫度培養(yǎng)時35℃下菌落直徑最小，在供試pH培養(yǎng)時pH 12下菌落直徑最小，說明該菌不偏好高溫和堿性環(huán)境；在50℃處理10 min時分生孢子致死，較分生孢子致死溫度48℃10 min稍高；在49℃處理15 min或50℃處理10 min時菌絲致死，較菌絲致死溫度為49℃10 min稍長（高巖，2020）。盡管2種菌致死溫度不完全一致，但差別較小，說明甘薯間座殼菌和毀壞間座殼菌對高溫的耐受程度低于低溫。因此，在田間防治時要及時清理病殘體，避免病殘體在田間越冬，提供病原菌生長的不適環(huán)境，抑制病害發(fā)生。此外，基于病菌偏好低溫環(huán)境，該菌可能具有在北方等薯區(qū)侵染危害的潛在能力，因此在種源調(diào)運(yùn)時要加強(qiáng)對病區(qū)種薯和種苗帶菌情況的檢驗檢測，防止病苗調(diào)運(yùn)。因甘薯間座殼菌在察氏培養(yǎng)基中未能誘導(dǎo)出孢子，因此，下一步應(yīng)篩選能誘導(dǎo)產(chǎn)孢的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)一步探究不同環(huán)境因素對病原菌孢子的影響。

目前生產(chǎn)上未見對甘薯基腐病具有良好抗性的甘薯品種，該病對我國沿海地區(qū)甘薯種植具有極大威脅，因此可通過抗性鑒定，以期獲得對該病具有抗性的品種，滿足我國病區(qū)甘薯種植需求。今后，一方面應(yīng)進(jìn)一步分析該病原菌分生孢子發(fā)育特點，利用基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等分析甘薯間座殼菌侵染甘薯的關(guān)鍵基因，以明晰該菌的侵染機(jī)制；另一方面，應(yīng)進(jìn)一步篩選抗性品種、防治藥劑和生防菌劑，從而指導(dǎo)田間生產(chǎn)，避免該病害的進(jìn)一步擴(kuò)散。

4 結(jié)論

甘薯間座殼菌是導(dǎo)致浙江省寧波市寧?？h甘薯基腐病的病原，該菌生長溫度范圍較窄，偏好25℃，適應(yīng)的pH較寬，偏好酸性環(huán)境，最適培養(yǎng)基為SPDA培養(yǎng)基。根據(jù)甘薯間座殼菌的生長特性，在田間病害防治中可通過改變栽種環(huán)境因素，調(diào)節(jié)土壤pH，營造堿性環(huán)境，合理施肥，適當(dāng)輪作，以抑制甘薯基腐病病原菌的生長，實現(xiàn)對甘薯基腐病的防治。