microRNA研究概況及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用前景

李祥，劉龍，安世恒，關(guān)若冰

（河南省害蟲綠色防控國際聯(lián)合實驗室/河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州，450002）

0 引言

成熟的microRNA（miRNA）長度約為18～35 nt，不具有開放閱讀框（ORF），因而不能編碼蛋白質(zhì)，其序列在不同物種的基因進(jìn)化上高度保守，并且在生物發(fā)育過程中miRNAs的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的組織特異性和時間特異性（Jonas and Izaurralde，2015；Lukasik and Zielenkiewicz，2016）。miRBase Sequence Database（http：//www.mirbase.org/）作為最大的miRNA信息存儲數(shù)據(jù)庫，目前已收錄了超過48860個miRNA成熟體序列，涵蓋了包括動物、植物和微生物在內(nèi)的271個物種（Kozomara et al.，2019）。

生物體內(nèi)絕大多數(shù)基因可能受到miRNA的調(diào)控，且同一miRNA可能調(diào)控多個功能相似甚至功能完全不相關(guān)基因的表達(dá)（Seitz and Pinzón，2017）。準(zhǔn)確識別miRNA的靶基因是明確其功能必不可少的環(huán)節(jié)。但目前，還沒有十分準(zhǔn)確、有效的預(yù)測手段，已明確了靶基因的miRNA也比較有限，不足以對后續(xù)研究提供充足的參考信息，極大限制了mi-RNA的相關(guān)研究和生產(chǎn)應(yīng)用。本研究概述了miRNA的特征、在細(xì)胞內(nèi)的形成過程、對靶基因的調(diào)控機制及其在生物體內(nèi)的功能，尤其是miRNA在昆蟲生長、發(fā)育以及植物-病原物互作中的關(guān)鍵作用，并討論了miRNA作為生物農(nóng)藥的研發(fā)潛力。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從軟件預(yù)測和試驗分析等角度詳細(xì)論述了miRNA靶基因預(yù)測和驗證的方法及其優(yōu)、缺點，并指出當(dāng)前研究的不足和未來的發(fā)展方向，為今后miRNA相關(guān)研究和生產(chǎn)應(yīng)用方面提供一些思路。

1 miRNA在細(xì)胞內(nèi)的形成過程

生物體內(nèi)的少數(shù)miRNAs轉(zhuǎn)錄于編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域，其產(chǎn)生會被所在基因的轉(zhuǎn)錄行為所影響；而大多數(shù)miRNAs來源于基因間的序列，通常擁有獨立的啟動子及調(diào)控元件（Chang et al.，2015）。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與miRNA轉(zhuǎn)錄序列的調(diào)控位點結(jié)合后，會激活RNA聚合酶II（RNA polymerase II）并在細(xì)胞核內(nèi)生成初級轉(zhuǎn)錄物，即初級miRNA（Primary miRNA，pri-miRNA）（Roden et al.，2017；Creugny et al.，2018）。有研究證實，極少數(shù)pri-miRNA（如pri-mir-634）是在RNA聚合酶III的催化作用下形成（Paraboschi et al.，2017）。

miRNA成熟體的形成通常需要pri-miRNA經(jīng)過2次剪切。在動物細(xì)胞核中，pri-miRNAs在Drosha蛋白的作用下，首先被剪切形成miRNA前體（Precursor miRNA，pre-miRNA）（Lee et al.，2003；Roden et al.，2017）。Drosha蛋白隸屬于核糖核酸酶III（RNase III）家族，通常存在于細(xì)胞核內(nèi)，能特異性的識別雙鏈RNA結(jié)構(gòu)并將其剪切成3′端具有2個突出堿基的產(chǎn)物（Lee and Shin，2018）。pre-miRNA的長度一般為60～80 nt，可形成典型的莖—環(huán)結(jié)構(gòu)以維持較低的自由能（Creugny et al.，2018）。核質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白Exportin5（Exp5）是一種Ran-GTP依賴性蛋白，能識別并結(jié)合pre-miRNA的莖—環(huán)末端結(jié)構(gòu)，并將剪切好的pre-miRNA運出細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，GTP發(fā)生去磷酸化反應(yīng)變?yōu)镚DP，同時釋放pre-miRNA（Kim et al.，2016）。在此過程中，Exp5不僅承擔(dān)了運輸功能，還保護(hù)著pre-miRNA不被其他酶類降解（Zeng and Cullen，2006；Wu et al.，2018）。

在細(xì)胞質(zhì)中，RNase III家族的另一個成員Dicer將對pre-miRNA進(jìn)行第二次剪切，形成一個不穩(wěn)定的miRNA：miRNA*復(fù)合體（Sand，2014）。在此過程中，TRBP（Transactivation-response RNA-binding protein）和PACT（Protein kinase R-activating protein）兩類輔助蛋白能大幅提高Dicer對miRNA：miRNA*復(fù)合體的親和力并從中挑選出合適的miRNA成熟體；其中，TRBP負(fù)責(zé)對底物進(jìn)行識別和定位（Komori et al.，2020），PACT則促進(jìn)了Dicer的剪切過程（Wilson et al.，2015）。在miRNA：miRNA*復(fù)合體中，穩(wěn)定性較高的miRNA即成為miRNA成熟體，并將協(xié)同AGO、Dicer等蛋白共同形成miRNA沉默誘導(dǎo)復(fù)合體（miRNA-induced silencing complex，miRISC），另一個miRNA則會在細(xì)胞內(nèi)被迅速降解（Krol et al.，2010；Carthew et al.，2017）。如果這兩個miRNAs的5'末端的穩(wěn)定性相近，則有可能形成2種不同的miRNA成熟體以及相應(yīng)的miRISC（Sheu-Gruttadauria and MacRae，2018）（圖1）。

植物miRNA的形成方式與動物存在明顯的差異，最典型的差異是植物中不存在Drosha或與其同源的蛋白（Chorostecki et al.，2017）。但在擬南芥（）中 發(fā) 現(xiàn) 了Dicer的 同 源 物DCL1，并證明了DCL1主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，并參與了pre-miRNA和miRNA成熟體的形成過程（Suarez et al.，2015），因而推測DCL1表現(xiàn)出類似Drosha或Dicer的功能。需要注意的是，植物miRNA通常在細(xì)胞核內(nèi)被加工成熟，而動物miRNA的成熟通常發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步佐證了上述推斷。此外，植物中HYL1的功能與動物中的TRBP和PACT相似，均發(fā)揮協(xié)同催化的作用；植物中HST則是Exp5的同源物，被認(rèn)為是miRNA-miRNA*復(fù)合體運出細(xì)胞核的載體蛋白（Mengistu and Tenkegna，2021）。

圖1 miRNA在動物體內(nèi)的生物合成過程（Ameres and Zamore，2013）Fig.1 miRNA biogenesis process in animals（Ameres and Zamore，2013）

2 miRNA對靶基因的調(diào)控機制

成熟的miRNA會協(xié)同AGO、Dicer、TRBP、PACT等元件形成miRISC，并通過對mRNA進(jìn)行降解或翻譯抑制兩種不同的作用機制來實現(xiàn)其沉默效應(yīng)（Tang，2005；Liu et al.，2017）。miRNA與靶基因序列的互補程度則決定了具體的調(diào)控機制。

大多數(shù)植物miRNA與其靶標(biāo)mRNA的序列幾乎完全互補，其作用機制與siRNA形成的RISC相類似（郝大海和龔明，2020），即與mRNA結(jié)合后，miRISC引導(dǎo)其中的外切酶和內(nèi)切酶同時作用，降解所在的mRNA。反應(yīng)完成后，miRISC被完整的釋放出來并參與下一個剪切事件（Samad et al.，2017）。值得注意的是，植物miRNA與靶基因的結(jié)合位點可能存在于整個mRNA序列；而動物miRNA的結(jié)合位點通常定位在mRNA的3'UTR。與植物不同的是，動物miRNA僅在靠近5'端的少數(shù)序列與靶基因完全互補，而其余序列的互補程度則很低，使得miRNA在動物體內(nèi)的主要作用方式為翻譯抑制。目前普遍認(rèn)為在動物體內(nèi)miRISC能在不破壞mRNA結(jié)構(gòu)的前提下，抑制其翻譯過程中的某個階段，導(dǎo)致無法合成或減少合成相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物（Ameres and Zamore，2013；Gebert and Macrae，2019）。動物中多數(shù)miRNAs與靶標(biāo)mRNA的結(jié)合位點位于3'UTR，極大降低了靶基因的預(yù)測范圍。但越來越多的研究報道指出，miRNA-mRNA的結(jié)合位點也可能存在于靶基因的編碼區(qū)（CDS）和5'UTR（Baizhigitova et al.，2018），這使得研究者需要重新評估和審視以前的研究。

3 miRNA對生物的調(diào)控功能

3.1 miRNA在生物體內(nèi)的一般功能

目前對于miRNA的功能研究主要采用反向遺傳學(xué)的方法。一方面通過突變靶基因的結(jié)合位點來觀察miRNA的結(jié)合情況以及相應(yīng)的表型變化，另一方面通過過表達(dá)或抑制miRNA的表達(dá)水平來觀察所造成的影響（Gebert et al.，2019）。大多數(shù)miRNAs行使調(diào)控作用時，往往是微調(diào)（Fine-tune）靶基因的表達(dá)水平使其維持適宜的表達(dá)豐度，因此，改變miRNA的表達(dá)量并不一定能觀察到十分明顯的表型變化。在探索miRNA的功能時，研究者通常采用高通量測序加生物信息學(xué)分析的方法，明確miRNA的時空表達(dá)特性，并根據(jù)miRNA與mRNA的序列互補程度和結(jié)合穩(wěn)定性預(yù)測其靶基因，然后結(jié)合分子生物學(xué)手段對miRNA與mRNA的互作關(guān)系進(jìn)行驗證，并根據(jù)靶基因的作用判斷miRNA的功能。

植物miRNA與靶基因的結(jié)合序列幾乎完全互補，極大提高了靶基因預(yù)測的準(zhǔn)確性（崔俊霞等，2018）。已知的植物miRNA靶基因中，很多都是在生長發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子基因（Zhang et al.，2006a；Reichel et al.，2015）。Pandey等（2019）指出，植物miRNA可通過抑制細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵基因控制植物細(xì)胞發(fā)育的方向。動物miRNA的功能鑒定相對困難。由于“不完全匹配”的機制，動物miRNA的靶基因預(yù)測會產(chǎn)生大量的假陽性結(jié)果，必須經(jīng)過嚴(yán)格的試驗驗證才能確定。與植物一樣的是，動物miRNA的靶基因中也包含大量轉(zhuǎn)錄因子基因，并在生物體生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能（Vorozheykin and Titov，2020）。更多的研究表明，miRNA表現(xiàn)出能調(diào)控大多數(shù)生理和病理過程的潛力，包括發(fā)育階段的劃分、干細(xì)胞分化、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞生長和凋亡、激素分泌、脂類代謝、病變和癌癥等（Llave and Carrington，2002；Vikram et al.，2015）。此外，不同外部因子或內(nèi)部生理變化所導(dǎo)致的表達(dá)差異暗示了miRNA具有更廣泛的作用。近年來，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，miRNA具有多元化的調(diào)控路徑，甚至具備調(diào)控所有生理活動的潛力（Gebert and Macrae，2019）。

3.2 miRNA在昆蟲發(fā)育中的功能

作為生物體內(nèi)一類重要的調(diào)控因子，miRNA廣泛參與了昆蟲的生長發(fā)育、生殖、代謝、免疫防御等絕大多數(shù)的生理生化過程。在果蠅中，通過敲除AGO蛋白阻止miRNAs發(fā)揮功能，能顯著抑制其卵母細(xì)胞的形成（Azzam et al.，2012），且構(gòu)建基因缺失的突變品系能阻礙果蠅卵母細(xì)胞的成熟（Nakahara et al.，2005）。在褐飛虱（）中抑制基因的表達(dá)，獲得了與果蠅相似的表型（Zhang et al.，2013）。、等通過調(diào)節(jié)Notch信號通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，可阻止果蠅的生殖干細(xì)胞（Germline stem cells）分 化（Poulton et al.，2011；Li et al.，2012），而啟動生殖干細(xì)胞的分化也同樣需要miRNA的調(diào)控（如）（Pek et al.，2009）。昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育同樣需要miRNA的參與，如（Li and Carthew，2005）、（Loya et al.，2009）、（Weng and Cohen，2012）等；缺失這些miRNAs的表達(dá)則會導(dǎo)致神經(jīng)退行性功能缺失、神經(jīng)干細(xì)胞分化異常、信號傳導(dǎo)受阻等發(fā)育或功能缺陷。是參與昆蟲邊界形成的關(guān)鍵基因之一，能通過抑制基因的表達(dá)從而阻止果蠅翅芽盤（Wing imaginal discs）的細(xì)胞增殖；基因被抑制后，其靶基因大量表達(dá)，該基因又進(jìn)一步促進(jìn)了翅芽盤上背—腹軸向的分化（Becam et al.，2011）?；虻臅r序性表達(dá)從時間維度上控制了翅芽盤上的細(xì)胞增殖，缺失的果蠅翅尺寸會明顯減小（Caygill and Johnston，2008）。

miRNA對昆蟲變態(tài)發(fā)育中的激素代謝、蛻皮行為、組織降解和重建同樣具有重要的調(diào)控作用（Ylla et al.，2016；Belles，2017）。在果蠅的整個發(fā)育過程中，多個miRNAs的表達(dá)水平與蛻皮和變態(tài)過程密切相關(guān)。蛻皮激素功能通路中的關(guān)鍵基因能顯著上調(diào)、、等基因的表達(dá)水平，并抑制基因的表達(dá)，共同維護(hù)蛻皮過程的有序進(jìn)行（Sempere et al.，2002，2003）。能靶向果蠅中蛻皮激素的受體基因，從而形成一個反饋調(diào)控環(huán)，以維持蛻皮激素的適宜滴度并適時啟動或終止相應(yīng)的蛻皮過程（Varghese and Cohen，2007）。在家蠶（）中，同樣能作用于蛻皮激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的多個基因和步驟，共同維持生長發(fā)育的有序性（He et al.，2019a，2019b）。通過負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子dLMO來控制果蠅翅發(fā)育過程的細(xì)胞凋亡，塑造適宜的翅形（Epstein et al.，2017）；在褐飛虱的長、短翅型分化和發(fā)育中，基因能響應(yīng)寄主營養(yǎng)水平和胰島素受體基因的信號調(diào)控，通過調(diào)節(jié)基因的適宜表達(dá)水平來促進(jìn)種群向長翅化或短翅化發(fā)展（Li et al.，2021）。這也間接說明miRNA對昆蟲生理生化過程的調(diào)控作用存在一定的保守性，在今后的應(yīng)用實踐中，應(yīng)經(jīng)過合理的篩選和驗證，基于miRNA調(diào)控作用的藥劑開發(fā)可兼顧特異性和廣譜性雙重優(yōu)勢。

3.3 miRNA在植物抗病中的功能

miRNA不僅通過作用于轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控植物自身的生長發(fā)育，還參與植物與病原物的“斗爭”。這些致病微生物通過表達(dá)或誘導(dǎo)寄主植物表達(dá)某些miRNAs來抑制寄主的免疫防御，協(xié)同致病過程（Umbach and Cullen，2009）。例如丁香假單胞菌（）侵染擬南芥時，通過誘導(dǎo)寄主過表達(dá)來抑制自身防御基因和的轉(zhuǎn)錄，關(guān)閉植物的免疫過程（Niu et al.，2016）。黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus）通過編碼一種2b蛋白與寄主植物的AGO1蛋白競爭性結(jié)合，從而阻礙植物對自身miRNA的加工和修飾，導(dǎo)致由miRNA介導(dǎo)的寄主防御反應(yīng)受到抑制（Zhang et al.，2006b）。另一方面，植物在抵御致病微生物的侵染時，會有目的地上調(diào)或下調(diào)一些內(nèi)源性miRNAs的表達(dá)，用于激活自身免疫系統(tǒng)，以提高對病原物的抗性。當(dāng)煙草受到煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus）侵染時，通過降低自身的表達(dá)水平來促進(jìn)免疫基因的表達(dá)，以抵御該病毒（Jiang et al.，2019）。

利用基因編輯或轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可有目的地使植物過表達(dá)某些特定的miRNAs，從而沉默病原物的關(guān)鍵致病基因。該項技術(shù)已應(yīng)用于水稻、番茄、煙草等作物的品種選育（Schwab et al.，2006；Ossowski et al.，2008）。例如，在煙草基因組中插入人工構(gòu)建的miRNA前體序列，使其特異性地過表達(dá)目的miRNA片段，可以沉默馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y）的致病基因HC-Pro和馬鈴薯X病毒（Potato virus X）中的致病基因p25，最終削弱這兩種病毒對煙草的致病能力（Ai et al.，2011）。針對田間多種病害混合發(fā)生的現(xiàn)狀，可以針對病原物致病基因的保守序列構(gòu)建miRNA表達(dá)載體，以拓寬農(nóng)作物的抗病譜（Zheng and Qu，2015）。

4 miRNA的靶基因預(yù)測

隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，生物中大量miRNA被相繼鑒定出來。一些miRNAs通過作用于昆蟲、植物或病原微生物中的關(guān)鍵基因，從而調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育和植物-病原物的互作過程，在農(nóng)業(yè)害蟲防治和植物抗病免疫等方面顯示出非常好的應(yīng)用潛力?；赗NA沉默技術(shù)的生物農(nóng)藥研發(fā)也因此成為可持續(xù)植保發(fā)展的熱點研究領(lǐng)域。但如何從包含成百上千個miRNAs的生物轉(zhuǎn)錄組中準(zhǔn)確篩選和鑒定出對靶標(biāo)基因具有調(diào)控作用的mi-RNA成為限制該領(lǐng)域發(fā)展的一個難題。早在21世紀(jì)初期，Lai（2002）比對了果蠅中調(diào)控基因和基因的11個miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的miRNAs 5'端的前8個堿基（實際為靠近5'端的6個堿基）與靶基因序列能精確互補，稱這些堿基為種子序列（Seed region），并推測種子序列是miRNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的關(guān)鍵因素。這一發(fā)現(xiàn)確立了以種子序列為依據(jù)進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測的計算機理論基礎(chǔ)。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)比利用種子序列進(jìn)行預(yù)測更準(zhǔn)確的手段。近十幾年來，逐步確立了以種子序列為核心，miRNA-mRNA復(fù)合體的熱穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)為依據(jù)的理論體系，并誕生多種各具特色的預(yù)測軟件（Chen et al.，2018）。

4.1 根據(jù)miRNA-mRNA復(fù)合體的熱力學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測

miRanda是首個以miRNA與潛在靶基因之間熱力學(xué)穩(wěn)定性為依據(jù)進(jìn)行預(yù)測的軟件，該軟件不受物種限制，還可在Windows、Linux等多種操作平臺上進(jìn)行不聯(lián)網(wǎng)運行（Ahmadi et al.，2013）。miRanda強調(diào)miRNA與靶基因互補序列在進(jìn)化上的保守性，主要參考miRNA 5'端序列與靶序列之間C：G、A：U、G：U的配對情況進(jìn)行熱穩(wěn)定性評估，并構(gòu)建出相應(yīng)的打分矩陣，同時根據(jù)miRNA 5'端和3'端各自的互補特性進(jìn)行區(qū)別評分。用戶還可根據(jù)實際需要自行定義閾值，從而篩除不穩(wěn)定的復(fù)合體（Ahmadi et al.，2013；程爽等.，2018）。此后，更多基于熱力學(xué)穩(wěn)定性的miRNA靶基因預(yù)測軟件被相繼開發(fā)。例如，RNAhybrid算法強調(diào)根據(jù)結(jié)合能來推算最佳結(jié)合位點，并獲得最穩(wěn)定的配對模式，避免了miRNA和靶基因之間形成無關(guān)的復(fù)合體結(jié)構(gòu)（Krüger and Rehmsmeier，2006；Pio et al.，2014）。PITA算法僅根據(jù)靶基因的3′UTR對已形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行剔除（Beretta et al.，2017；Kertesz et al.，2017），但出現(xiàn)跨度較大的互補配對情況或較大的二級結(jié)構(gòu)時，該算法會產(chǎn)生一部分假陽性結(jié)果。

基于miRNA與靶基因的作用方式，以及不同miRNAs間的序列比對分析，Miranda等（2006）開發(fā)了第二代預(yù)測軟件——RNA22。該軟件是首個不使用同源保守信息進(jìn)行預(yù)測的軟件，具有很強的靈活性，可將靶點的預(yù)測范圍延伸至整個mRNA序列。RNA22以Rfam 3.0數(shù)據(jù)庫中miRNA成熟體為訓(xùn)練集合，采用一種模糊匹配的模式進(jìn)行預(yù)測。該算法將供試序列分割成靶點島（Target island），并依次評估與miRNA的結(jié)合情況來尋找假定結(jié)合位點（Miranda et al.，2006；Plotnikova and Skoblov，2018）。

4.2 根據(jù)物種間的序列保守性進(jìn)行預(yù)測

種子序列通常在物種之間的保守性很高，研究者可根據(jù)靶基因序列的同源性進(jìn)行預(yù)測。TargetScan是目前使用頻率最高的預(yù)測軟件。該算法提出了“假陽性率”的概念，并根據(jù)物種之間的保守性原則對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行二次評估（Agarwal et al.，2015）。TargetScan首先搜索并比對不同物種之間的mRNA 3'UTR序列的保守區(qū)域，然后根據(jù)miRNA與潛在靶標(biāo)的3'UTR及其周圍序列的互補程度進(jìn)行綜合評估（Lewis et al.，2005；Wu et al.，2017）。該算法以保守性為主要依據(jù)，其局限性在于不能對具有物種特異性的互補情況進(jìn)行有效預(yù)測。TargetScan S則是在TargetScan基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，不再對miRNA非種子序列區(qū)域與靶序列匹配的自由能進(jìn)行評估，而是增加對人類、鼠、狗、雞等一些進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的物種進(jìn)行保守性分析，進(jìn)一步提高了預(yù)測的準(zhǔn)確性（Huang et al.，2019）。

4.3 基于多個結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測

miRNA不僅可調(diào)控多個mRNAs，也可作用于同一mRNA的多個位點?；诖爽F(xiàn)象，對多個結(jié)合位點進(jìn)行同時預(yù)測時，可通過增加信噪比參數(shù)對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)?shù)睾Y除。盡管這種算法可能會過濾一些真實靶標(biāo)，但其優(yōu)勢在于預(yù)測結(jié)果更加準(zhǔn)確（Ritchie et al.，2009a，2009b）。PicTar主要應(yīng)用于脊椎動物和無脊椎動物中的miRNA靶基因預(yù)測，是多靶標(biāo)和多結(jié)合位點預(yù)測的代表算法。該算法不僅能同時評估多個結(jié)合位點，還對miRNA-mRNA結(jié)合能力進(jìn)行綜合評估，甚至允許種子序列出現(xiàn)不完全匹配的情況，并進(jìn)行區(qū)別打分（Sarker et al.，2011）。此外，該算法還考慮了結(jié)合位點的保守性因素，并關(guān)聯(lián)了多個網(wǎng)站的miRNA信息數(shù)據(jù)庫。

4.4 根據(jù)miRNA和mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行預(yù)測

一些miRNA通過降解mRNA來阻斷其翻譯過程（Ameres and Zamore，2013；Samad et al.，2017），因此，在miRNA表達(dá)活躍的區(qū)域，相應(yīng)的靶基因表達(dá)水平通常較低。檢測特定組織中miRNA與mRNA表達(dá)量的關(guān)系，也是靶基因篩選的一個重要手段（Jing et al.，2016；Ye et al.，2019）。該方法不同于匹配原則的算法，可以對基于序列互補原則而獲得的結(jié)果進(jìn)行二次篩選，另一個優(yōu)勢在于不單純依賴于3′UTR進(jìn)行預(yù)測。但在動物中，一些miRNAs并不能直接影響mRNA的表達(dá)水平，或者影響十分微弱，導(dǎo)致很多真實的結(jié)果被忽視，此時可用檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平代替對mRNA的檢測。

4.5 根據(jù)功能相關(guān)性進(jìn)行預(yù)測

miRNA參與了生物體內(nèi)大多數(shù)的生理生化過程（Llave and Carrington，2002；Lim et al.，2005），因此，可根據(jù)其功能分類對無關(guān)的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行剔除。mirBridge算法錨定一組或一類已知功能的mRNA，有針對性的對這些潛在靶標(biāo)進(jìn)行排查（Tsang et al.，2010）。此算法適用于一些具有特殊功能的基因或通路研究，但對于尚未進(jìn)行功能劃分的miRNA和mRNA無法預(yù)測。

4.6 根據(jù)miRNA信息庫尋找潛在靶標(biāo)

隨著miRNA-mRNA互作研究成果的不斷積累，一些研究者或機構(gòu)建立了多種miRNA數(shù)據(jù)庫，以整合miRNA及其靶基因的相關(guān)信息。starBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）網(wǎng)站較為全面的收錄了由miRNA介導(dǎo)的mRNA降解組和CLIP-Seq等高通量測序數(shù)據(jù)，包含了miRNA-mRNA、miRNA-lncRNA、miRNA-ceRNA等多種互作模式下的miRNA靶標(biāo)信息。ChIPBase（http：//deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/）偏向于探討miRNA的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，構(gòu)建了比較系統(tǒng)的“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-靶基因”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Tarbase（http：//microrna.gr/tarbase/）側(cè)重于收集已被試驗證實過的miRNA靶基因信息。此外，PMRD主要收錄植物miRNA的數(shù)據(jù)信息，miRGator v2.0則重點整合了疾病相關(guān)miRNA的研究結(jié)果。鑒于miRNA在序列和功能方面的保守性，收錄的研究結(jié)果被廣泛借鑒于當(dāng)前的研究。但受限于miRNA相關(guān)研究的不系統(tǒng)性，這些網(wǎng)站建立的數(shù)據(jù)庫仍不夠全面。

5 miRNA的靶基因驗證

盡管目前已存在大量各具特色的預(yù)測軟件，但這些算法主要依賴于miRNA與靶基因的互補潛力進(jìn)行預(yù)測，并強調(diào)種子序列的重要性。由于miRNAmRNA復(fù)合體允許一定程度的錯配、跳躍、G：U配對的情況出現(xiàn)，在很大程度上會出現(xiàn)許多錯誤的預(yù)測結(jié)果。在實際研究中，需要對預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析和驗證。

miRNA的靶基因驗證試驗最初是以線蟲體為研究對象，通過構(gòu)建miRNA缺失的突變體以獲得相反表現(xiàn)，從而證明miRNA與mRNA的調(diào)控關(guān)系（Lee et al.，1993）。這種方法受基因編輯技術(shù)等因素的局限，無法在生物中推廣使用。Vatolin等（2006）、Andachi（2008）將一段已知序列的特異性接頭連接至miRNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴增，進(jìn)一步通過定量分析或高通量測序的方法成功鑒定出、LIN-14等靶基因。

當(dāng)前驗證miRNA與靶基因的互作關(guān)系時，通常是人為構(gòu)建出一套表達(dá)系統(tǒng)用于模擬相應(yīng)的調(diào)控過程，并檢測mRNA表達(dá)的蛋白產(chǎn)物含量。報告基因檢測系統(tǒng)是驗證miRNA與靶基因互作時最常見的研究手段。當(dāng)miRNA與mRNA上的作用位點結(jié)合后，能有效抑制其翻譯過程，并顯著減少蛋白產(chǎn)物的含量（Huang et al.，2020；Li et al.，2021）。將包含潛在結(jié)合位點的一部分或全部序列連接至報告基因（通常為熒光素酶基因）CDS的下游，并將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行表達(dá)；同時將miRNA的模擬物或表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞系中，經(jīng)過一段時間后檢測熒光強度或者熒光素酶的活性。為核實miRNA與靶基因的作用位點，還可將結(jié)合位點序列進(jìn)行突變，從而反向觀察結(jié)合情況，檢測報告基因的表達(dá)水平，用以驗證預(yù)測位點的真?zhèn)危≧itchie et al.，2010；Ye et al.，2019）。當(dāng)細(xì)胞系內(nèi)源表達(dá)的miRNAs包含供試miRNA時，也可通過外源轉(zhuǎn)入miRNA的抑制劑（如Inhibitors或Sponge vectors）對其表達(dá)進(jìn)行抑制（Tang et al.，2017；Zhang et al.，2018）。經(jīng)過miRNA處理后的細(xì)胞系，報告基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可通過Western雜交、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行定量分析（任禹珂等，2021）。需要指出的是，報告基因檢測系統(tǒng)中miRNA和結(jié)合序列是在人工干預(yù)的異源系統(tǒng)里進(jìn)行相互作用，而在活體中miRNA和靶基因的表達(dá)均存在時空特異性；克隆到載體上的序列可能會因為二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而產(chǎn)生假陽性或假陰性的結(jié)果；細(xì)胞系內(nèi)復(fù)雜多樣的生理生化過程也可能會干擾試驗結(jié)果。

6 展望

病蟲害的頻繁發(fā)生一直是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要難題?；瘜W(xué)農(nóng)藥是當(dāng)前防治病蟲害的主要手段，但其不合理的使用造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題和人畜安全問題。選育抗病蟲品種往往費時費力，難以滿足生產(chǎn)的迫切需求?；赗NA沉默技術(shù)的RNA生物農(nóng)藥的研發(fā)帶來了新的農(nóng)藥革命，該方法可用于殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等多種新型農(nóng)藥的研制，并兼具特異性強、環(huán)境友好等特點，為可持續(xù)植保的發(fā)展提供了新的途徑（Dhandapani et al.，2019；Niehl and Heinlein，2019）。

鑒于miRNA在動物和植物中的重要功能，開發(fā)miRNA生物農(nóng)藥成為未來病蟲害防治的重要選擇。如何使目的miRNA成功作用于靶標(biāo)生物，是利用該技術(shù)進(jìn)行病蟲害防治的關(guān)鍵。目前主要總結(jié)了兩種miRNA遞送方式：一種是利用轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)使植物內(nèi)源表達(dá)目的miRNA片段，待病原物侵染或昆蟲取食時，miRNA進(jìn)入有害生物體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的功能，該方式被稱為寄主誘導(dǎo)的基因沉默（Hostinduced gene silencing）；另一種方式是將體外合成的功能性miRNA經(jīng)過穩(wěn)定性處理制作成相應(yīng)的殺菌劑或殺蟲劑，直接施用在作物上，該方式被稱為噴灑誘導(dǎo)的基因沉默（Spray-induced gene silencing）（Wang and Jin，2017；Zotti et al.，2018）。迄今為止，至少有5項基于RNAi原理的生物農(nóng)藥獲準(zhǔn)在田間投入使用，展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。但需要指出的是，并不是所有的植物都能通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育商業(yè)化的抗病蟲品種，也不可能做到同時防治多種病蟲害。對于外源施用的RNA生物農(nóng)藥，除了較高的生產(chǎn)成本外，在田間的穩(wěn)定性和持效性也一直是研究人員需要解決的難題。此外，為了避免脫靶效應(yīng)和潛在的安全風(fēng)險，miRNA的序列設(shè)計和靶基因的篩選均必須經(jīng)過嚴(yán)密的科學(xué)論證。

經(jīng)過十余年的發(fā)展，miRNA靶基因的預(yù)測和鑒定已發(fā)展成為一門較為系統(tǒng)的學(xué)科，為miRNA的功能鑒定和應(yīng)用研發(fā)提供了便利。本研究對當(dāng)前mi-RNA靶基因預(yù)測和驗證的研究方法進(jìn)行較為系統(tǒng)地概述和比較，不僅指出這些方法的優(yōu)勢和特色，還認(rèn)識到當(dāng)前研究手段的不足。通常，miRNA-mRNA復(fù)合體的形成需要考慮時間和空間上的特異性，因此，基于序列匹配的算法預(yù)測實際上并不能真實反應(yīng)生物體內(nèi)的相互作用模式?，F(xiàn)有的預(yù)測方法是在不丟失真實靶標(biāo)的原則下盡量剔除無關(guān)結(jié)果，但受限于目前的miRNA理論研究的不足，想要兼顧預(yù)測的靈敏度和精確度仍有較大的距離。鑒于各種算法各有其利弊，學(xué)者們通常利用多個算法或手段分別進(jìn)行預(yù)測后，再對結(jié)果集合進(jìn)行比對。

對于今后miRNA靶基因預(yù)測領(lǐng)域的發(fā)展，可著重關(guān)注以下3個方面：（1）miRNA和mRNA的互補配對要考慮表達(dá)時間和空間上的一致性；（2）盡管已有不少算法增加了RNA二級結(jié)構(gòu)分析，但對于較長序列的結(jié)構(gòu)預(yù)測仍缺乏準(zhǔn)確性，預(yù)測時也沒有考慮規(guī)避蛋白結(jié)合位點等功能區(qū)域；（3）miRNA-mRNA復(fù)合體的形成及穩(wěn)定性機制方面的研究仍不夠完善，現(xiàn)有的理論基礎(chǔ)不能很好的支撐新算法的研發(fā)。在驗證預(yù)測結(jié)果時，還應(yīng)注意以下情況：（1）miRNA過表達(dá)時通常能使其表達(dá)水平上調(diào)成百上千倍，可能會引起一些副作用并干擾了其他內(nèi)源基因的表達(dá)；（2）人工干預(yù)下的靶基因驗證系統(tǒng)往往忽略了miRNA和mRNA的組織特異性表達(dá)特性；（3）改變miRNA的表達(dá)水平可能導(dǎo)致上千個基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，但這種變化可能來自于靶基因變化而引起的間接調(diào)控；（4）不同miRNA在與靶基因結(jié)合過程中可能存在競爭或者協(xié)同作用，單一改變某個miRNA的含量可能無法模擬出真實的情況；（5）miRNA對靶基因的上調(diào)作用在目前的研究中往往被忽視。