水稻W(wǎng)OX家族基因鑒定及其種子在逆境萌發(fā)中的表達(dá)分析

張琪，張愛霞，賈俊婷，趙華，劉軍*，陳兵先*

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；2廣州國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南現(xiàn)代生物種業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510520）

0 引言

【研究意義】水稻（L.）作為主糧作物在保障我國糧食有效供給中發(fā)揮重要作用，其種子萌發(fā)和成苗質(zhì)量在很大程度上決定著植株的營養(yǎng)狀況和產(chǎn)量，因此，關(guān)于水稻萌發(fā)機(jī)理探究一直以來都是研究熱點(diǎn)之一（陳雅玲等，2020；常彥鵬等，2021；王丹丹和李娟，2021）。WOX（WUSCHELrelated homobox）蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持、胚胎發(fā)生與胚胎后期發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、初生和次生物質(zhì)代謝及抗逆響應(yīng)中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用（Wang et al.，2019；朱滿喜等，2020）。WOX蛋白含有60～66個氨基酸殘基組成的同源異型結(jié)構(gòu)域，具有“螺旋—環(huán)—螺旋—轉(zhuǎn)—螺旋”結(jié)構(gòu)，其中，第2個和3個螺旋組合形成的“螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋”能與特定DNA序列結(jié)合（Haecker et al.，2004；Mukherjee et al.，2009）。但目前家族基因在水稻生長發(fā)育和逆境脅迫下的功能仍不清楚，因此，鑒定水稻家族基因，并分析其在種子逆境萌發(fā)過程中的表達(dá)模式，對探究基因功能及培育水稻抗性品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】已有較多植物基因組中基因家族被鑒定，如從擬南芥（Lian et al.，2014）、番茄（李曉旭等，2016）、棉花（呂有軍等，2017）、玉米（鄭玲等，2019）、大豆（Hao et al.，2019）中分別鑒定獲得15、10、37、31和33個基因家族成員。近年來，較多非大宗作物的家族基因也被鑒定，如從苦蕎中鑒定獲得30個基因家族成員，不均勻分布在8條染色體上（候思宇等，2021）；從藜麥中鑒定獲得13個WOX轉(zhuǎn)錄因子，均含由34～60個氨基酸組成的Homeobox保守結(jié)構(gòu)域（朱滿喜等，2020）；從中華獼猴桃中鑒定獲得16個WOX轉(zhuǎn)錄因子，均屬于Homodomain超家族，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示其與菠蘿WOX轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系最近，與番茄WOX轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（付春等，2021）；從蘋果中鑒定獲得12個家族成員，其中，有11個基因分別定位在7條染色體上，1個基因未準(zhǔn)確定位（王楚堃等，2019）。有關(guān)植物基因功能的研究較多。在擬南芥中，和冗余調(diào)控花瓣和葉片的發(fā)育（Vandenbussche et al.，2009），基因在維持維管形成層的干細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)中發(fā)揮重要作用（Hirakawa et al.，2010）；基因受生長素誘導(dǎo)后在根中表達(dá)，推測其在維持根尖分生組織干細(xì)胞的穩(wěn)定性方面 發(fā) 揮 作 用（Gonzali et al.，2005；Sarkar et al.，2007）；和基因調(diào)控胚早期頂端子葉原基發(fā)育（Wu et al.，2007）。在水稻中，基因參與葉腋分生組織的形成（Tanaka et al.，2015）；基因在器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用，包括葉片側(cè)軸生長和維管系統(tǒng)形成、小穗內(nèi)外稃形態(tài)發(fā)生，以及分蘗和側(cè)根形成（Yoo et al.，2013）；基因促進(jìn)水稻分生組織向未分化狀態(tài)轉(zhuǎn)化，其功能與細(xì)胞分裂素的作用有關(guān)（Ohmori et al.，2013）；基因沉默后主根數(shù)量顯著增加，而過表達(dá)該基因可顯著抑制主根伸長，說明該基因也與根的發(fā)育有關(guān)（Li et al.，2020）；基因表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致葉片發(fā)育嚴(yán)重缺陷，同時也降低了維管束發(fā)育過程中參與活性細(xì)胞分裂素合成基因的表達(dá)水平（Yasui et al.，2018）；和基因可能在重力刺激反應(yīng)中發(fā)揮生長素下游靶標(biāo)的作用，并在控制水稻分蘗角度過程中發(fā)揮冗余作用（Zhang et al.，2018）；基因在新生冠根中表達(dá)，隨后在根分生組織的細(xì)胞分裂區(qū)域表達(dá)，從而參與調(diào)控水稻冠根的發(fā)生和生長（Zhao et al.，2009）；和基因在調(diào)控水稻側(cè)根原基發(fā)育中發(fā)揮相反作用，基因過表達(dá)可促進(jìn)側(cè)根直徑的增加，而突變體降低L型側(cè)根的直徑（Kawai et al.，2022）；干旱脅迫下水稻葉片和根中基因表達(dá)量上調(diào)，過表達(dá)基因可提高水稻的抗旱能力并可將開花期提早7～10 d（Minh-Thu et al.，2018）。【本研究切入點(diǎn)】雖然已有研究發(fā)現(xiàn)，水稻基 因 家 族 具 有13個 成 員（Nardmann et al.，2007），且部分基因在水稻發(fā)育中的功能已明確，但鮮見關(guān)于水稻家族基因的生物信息學(xué)分析及其在種子逆境萌發(fā)過程中表達(dá)模式的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對水稻家族基因進(jìn)行鑒定，對其結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系、保守序列等進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過實(shí)時熒光定量PCR（qRTPCR）檢測其在種子萌發(fā)期的時空表達(dá)模式及非生物脅迫下的表達(dá)模式，為深入探究水稻基因家族的生物學(xué)功能及水稻品種的遺傳改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的水稻品種為日本晴，其種子為本課題組種植生產(chǎn)。主要試劑：通用植物RNA提取試劑盒（RP3302）購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；Rever-Tra Ace Qpcr RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒（FSQ-301）購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；2×RealStar Green Fast Mixture（A301-10）購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；其他生化試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設(shè)備：Climacell人工氣候箱（MMM，德國）、Chemi-Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）、Nano-Drop ND2000超微量核酸蛋白分析儀（Thermo，美國）、實(shí)時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）、電泳儀（Bio-Rad，美國）和PCR儀（Bio-Rad，美國）。

1.2 材料處理

選取100粒飽滿的水稻種子放入覆蓋兩層濾紙的透明方形發(fā)芽盒中，加入10 mL種子吸脹溶液（即ddHO），置于培養(yǎng)箱，光/暗為12 h/12 h，溫度設(shè)置為：28℃（對照，CK）、15℃（低溫處理，T1）和42℃（高溫處理，T2）。將10 mL ddHO（CK）、200 mL ddHO（水淹處理，T3）、10 mL 100 mmol/L NaCl（鹽處理，T4）、10 mL 20% PEG6000（干旱處理，T5）分別加入發(fā)芽盒中，置于培養(yǎng)箱28℃，分別于2 d取種子和5 d取幼苗，用于后續(xù)RNA提取和qRT-PCR檢測。

1.3 水稻W(wǎng)OX基因家族成員鑒定及進(jìn)化分析

在植物信息數(shù)據(jù)庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）中下載水稻全基因組DNA序列、蛋白序列、gff3文件和編碼區(qū)（CDS）序列。水稻、擬南芥、玉米、番茄和楊樹WOX轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列來自PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/）。利用在線軟件Pfam（http：//pfam.xfam.org/）、NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和SMART（http：//smart.embl.de/）對候選序列蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，剔除不含完整同源異型結(jié)構(gòu)域的候選序列。利用MAGE 7.0中的ClustalW對上述物種中的基因家族成員進(jìn)行多序列比對，以鄰接法（Nerghbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并利用Evolview 2.0（https：//evolgenius.info//evolview-v2/#login）進(jìn)行注釋。

1.4 水稻W(wǎng)OX基因家族成員理化性質(zhì)分析

運(yùn)用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線工具分析水稻W(wǎng)OX家族蛋白的氨基酸序列長度、分子量和等電點(diǎn)（Gasteiger，2003）。利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對該家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.5 水稻W(wǎng)OX家族基因結(jié)構(gòu)、染色體定位及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

利用在線網(wǎng)站GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制水稻基因家族成員的內(nèi)含子、非編碼區(qū)（UTR）和外顯子結(jié)構(gòu)圖。根據(jù)水稻全基因組測序信息和標(biāo)注信息文件，對家族基因染色體位置可視化分析和精準(zhǔn)定位，并利用MapChart作圖。利用在線軟件Pfam（https：//pfam.xfam.org/）和MEME（http：//meme-suite.org）對水稻W(wǎng)OX家族蛋白序列的保守基序和功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，其中，MEME的參數(shù)設(shè)置Maxi-mum number of motifs為10，Occurrences of a single motif為zero or one per sequence。

1.6 水稻W(wǎng)OX家族基因啟動子順式作用元件分析

選取家族基因上游2000 bp的序列，利用在線工具plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對其順式作用元件進(jìn)行分析，參數(shù)為軟件默認(rèn)，相關(guān)數(shù)據(jù)使用TBtools作圖。

1.7 水稻W(wǎng)OX家族基因組織表達(dá)分析

利用Genevestigator（https：//www.genevestigator.com/gv/）數(shù)據(jù)庫中的Os_51k基因芯片數(shù)據(jù)，選取種子萌發(fā)和發(fā)育過程中胚、胚乳、幼苗和葉片的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)，并繪制表達(dá)熱圖，分析水稻家族基因的組織及誘導(dǎo)表達(dá)譜。

1.8 水稻W(wǎng)OX家族基因在逆境脅迫下表達(dá)分析

1.8.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈具體步驟如下：運(yùn)用植物總RNA快速提取試劑盒提取水稻種胚RNA，用NanoDrop分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和質(zhì)量。采用ReverTra Ace Qpcr RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.8.2 基因表達(dá)定量分析采用qRT-PCR檢測水稻種子在不同逆境脅迫下的相對表達(dá)量。qRT-PCR采用2×RealStar Green Fast Mixture（GenStar，A301-10）試劑盒。反應(yīng)體系20.0μL：2×RealStar Green Fast Mixture 10.0μL，10μmol/L正、反向引物0.8μL，5 ng/μL cDNA模板2.0μL，ddHO補(bǔ)充至20.0μL。擴(kuò)增程序：95℃，2 min；95℃，15 s；58℃，30 s；72℃，30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。每組試驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，相對定量用2計(jì)算。內(nèi)參基因?yàn)椤Ｔ囼?yàn)引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻W(wǎng)OX家族成員鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫鑒定獲得13個水稻基因家族成員（～）。為了分析水稻家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化規(guī)律，選取基因序列信息較完整的擬南芥（16個）、玉米（20個）、番茄（10個）和胡楊（17個）的家族基因序列作為參考，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖1所示。5個物種76條基因可聚為分成3個類群。根據(jù)模式植物擬南芥的分類標(biāo)準(zhǔn)（王俞程等，2015），將水稻基因家族成員分為遠(yuǎn)古進(jìn)化支（Ancient clade）、中間進(jìn)化支（Intermediate）和現(xiàn)代進(jìn)化支（WUS clade）。13個基因中僅有基因?yàn)檫h(yuǎn)古進(jìn)化支，推測該基因編碼蛋白具有更為保守的結(jié)構(gòu)和功能特性；中間進(jìn)化支包含6個成員，分別是、、、、和基因。現(xiàn)代進(jìn)化支也包含6個成員，分別是、、、、和基因，推測這6個基因是經(jīng)漫長自然選擇后演化出來的基因。

2.2 水稻W(wǎng)OX基因結(jié)構(gòu)分析及染色體定位結(jié)果

由圖2-A所示，是水稻基因家族中最長的基因，而、和為最短的基因。、、、和基因僅含有外顯子區(qū)域（CDS序列），無內(nèi)含子和UTR區(qū)域；、和基因具有3個被內(nèi)含子分割的外顯子區(qū)域，而、和基因具有較長的內(nèi)含子序列?？梢?，水稻家族成員間基因結(jié)構(gòu)存在較大差異，暗示水稻基因功能具有差異性和多樣性。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

圖1 基于不同物種WOX家族基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on WOX family gene sequence of different species

由圖2-B可知，13個基因不均勻地分布在水稻的1、3、4、5、7、8和11號染色體上，其余5條染色體上則不含該家族基因，其中1號染色體上的基因數(shù)量最多，含有4個成員；4和5號染色體上各有2個家族成員；3、8和11號染色體上各有1個基因分布，分別為、和。值得關(guān)注的是，和基因位于染色體的末端，只有和基因定位于染色體中端區(qū)域，說明大多數(shù)水稻基因家族成員傾向于分布在染色體的末端區(qū)域。

2.3 水稻W(wǎng)OX家族蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，13個基因的編碼區(qū)（CDS）長度差異較大，為603～1602 bp，平均長度為931 bp，其編碼蛋白由200～533個氨基酸殘基組成，平均含有312個氨基酸殘基；相對分子量為22.35～54.80 kD，平均為33.24 kD；理論等電點(diǎn)（pI）為5.94～11.64，平均為8.16，其中遠(yuǎn)古進(jìn)化支的OsWOX8蛋白pI最小（5.94），為酸性蛋白，中間進(jìn)化支的OsWOX13蛋白pI最大（11.64），分為堿性蛋白；13個水稻W(wǎng)OX家族蛋白均位于細(xì)胞核中（表2）。

2.4 水稻W(wǎng)OX保守結(jié)構(gòu)域與保守基序分析

由圖3-A可知，水稻W(wǎng)OX家族蛋白共含有10個保守基序，其中OsWOX12蛋白所含的保守基序最多，共有7個保守基序，其次是OsWOX7和OsWOX10，包含6個保守基序；OsWOX8蛋白僅含有2個保守基序。一些保守基序僅存在于少數(shù)進(jìn)化支中，如motif 6僅存在于現(xiàn)代進(jìn)化支中，而Motif 3、Motif 4和Motif 7、Motif 8、Motif 9和Motif 10存在于中間進(jìn)化支。值得關(guān)注的是，13個水稻W(wǎng)OX家族蛋白均具有Homodomain superfamily保守結(jié)構(gòu)域，同時均含有Motif 1和Motif 2，而這2個保守基序正是蛋白保守功能域homeobox中的序列。由于OsWOX8蛋白的保守結(jié)構(gòu)域中只含有Motif 1和Motif 2，表明這兩個基序是水稻W(wǎng)OX家族蛋白中最保守的序列。通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Motif 1末端含有8個連續(xù)高度保守的氨基酸：天冬酰胺（N）-纈氨酸（V）-苯丙氨酸（F）-酪氨酸（Y）-色氨酸（W）-苯丙氨酸（F）-谷氨酰胺（Q）-天冬酰胺（N）；motif 2的保守序列較短，前段含有2個保守氨基酸，即精氨酸（R）和色氨酸（W），中間含有一個保守的脯氨酸（P），中尾部含有一個保守連續(xù)的谷氨酸（E）-谷氨酰胺（Q）（圖3-B）。

圖2 水稻W(wǎng)OX家族基因結(jié)構(gòu)（A）及染色體定位（B）結(jié)果Fig.2 Rice WOX family gene structure（A）and chromosome mapping（B）

2.5 水稻W(wǎng)OX家族基因啟動子區(qū)域的順式作用元件分析結(jié)果

由圖4-A可知，13個基因均含有較多的光響應(yīng)元件及防御和脅迫相應(yīng)元件，除基因以外，其他基因均含有干旱響應(yīng)元件，85.0%的基因含有脫落酸響應(yīng)元件和厭氧誘導(dǎo)元件，76.9%基因含有茉莉酸甲酯誘導(dǎo)元件，其次分布比例較多的是生長素響應(yīng)元件、分生組織響應(yīng)元件及乙烯和赤霉素響應(yīng)元件。相比之下，其余元件在水稻基因家族中分布的數(shù)量和比例較低，比如高溫脅迫元件僅存在于基因啟動子區(qū)域中，而低溫脅迫元件只存在于基因中（圖4-A）。由上述推測，水稻基因家族成員主要在光合作用、生長發(fā)育、逆境脅迫、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。

對每個基因啟動子的順式作用元件進(jìn)行深入分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因啟動子所含的順式作用元件最多，有37個，主要包括G-box、GATA-motif、MYB等光響應(yīng)和防御脅迫響應(yīng)的元件?；騿幼铀捻樖阶饔迷钌?，共20個，除含有較多的光響應(yīng)和脅迫響應(yīng)元件外，也含有4個厭氧響應(yīng)元件（ARE）和2個生長素響應(yīng)元件（TGA-element）。此外，種子特異性反應(yīng)元件（RY-element）存在于、、和基因的啟動子中，推測這些基因參與水稻種子萌發(fā)的過程（圖4-B）。

2.6 水稻W(wǎng)OX家族基因在種子萌發(fā)及逆境脅迫下的表達(dá)情況

為了研究13個基因在水稻種子萌發(fā)和逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平，本研究從Genevestigator數(shù)據(jù)庫中獲取轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)，并繪制基因表達(dá)熱圖。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，該數(shù)據(jù)庫中僅存在9個基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)，未檢索到、、和基因的表達(dá)信息。由圖5-A可知，種子在萌發(fā)過程中，隨著種子吸脹時間的延長，基因在胚中的表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢，但在胚乳中表達(dá)量較低；和基因在吸脹4～8 h的胚中表達(dá)量較高，之后呈下降趨勢，但二者在吸脹4～24 h的胚乳中表達(dá)量均較高；、和基因在吸脹4～24 h的胚和胚乳中表達(dá)量均較低。如圖5-B所示，低溫脅迫下，基因在2個水稻品種IR29和K354的葉片和幼苗中均有一定程度的表達(dá)；除和基因在冷脅迫8 h的葉片中表達(dá)量較高外，其他基因均呈現(xiàn)較低的表達(dá)量。綜上所述，、和在水稻種子萌發(fā)過程的表達(dá)量較高，可能是參與萌發(fā)過程的關(guān)鍵基因；而基因可能在水稻冷脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證探索家族基因在種子萌發(fā)、幼苗形成及逆境脅迫下的表達(dá)情況，以吸脹2 d水稻種子和5 d幼苗的水稻種子為材料，并加入逆境脅迫條件，采用qRT-PCR檢測13個基因的表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示。在CK組中，、和基因在2 d種子中的相對表達(dá)量較其在5 d幼苗中的相對表達(dá)量高，結(jié)合啟動子序列分析的

結(jié)果，推測三者是調(diào)控萌發(fā)過程的關(guān)鍵基因；、和基因在5 d幼苗中的相對表達(dá)量高于其在2 d種子中的相對表達(dá)量；其余基因在種子和幼苗的相對表達(dá)量均處于較低的表達(dá)水平（圖6-A）。和基因在干旱處理下表達(dá)上調(diào)，二者在干旱處理5 d幼苗中的相對表達(dá)量分別是CK組的15.0倍和8.0倍（圖6-B和圖6-C）。基因在淹水處理5 d幼苗和干旱處理2 d種子中表達(dá)下調(diào)，與CK組相比，其相對表達(dá)量分別下降了93.2%和87.2%（圖6-D）?；蛟诟邷靥幚硐卤磉_(dá)上調(diào)，其在5 d幼苗的相對表達(dá)量是CK組的2.7倍；基因在干旱處理2 d種子中相對表達(dá)量較CK組降低86.9%，但在干旱處理5 d幼苗中的相對表達(dá)量是CK組的3.9倍（圖6-E）?；虻谋磉_(dá)水平受干旱脅迫的影響較大，其在干旱處理2 d種子和5 d幼苗中的相對表達(dá)量分別是CK組的12.5%和3.6倍（圖6-F）。、和基因在干旱處理2 d種子中的相對表達(dá)量較

CK組降低39%、97.8%和61%，但在干旱處理5 d幼苗中的相對表達(dá)量有不同程度的升高（圖6-G、圖6-H和圖6-I）。此外，基因在高溫處理2 d種子中表達(dá)下調(diào)，其相對表達(dá)量比CK組降低90.1%（圖6-H）。基因在低溫和干旱處理2 d種子中的相對表達(dá)量比CK組降低，但在高溫處理下相對表達(dá)量升高（圖6-J）?；蛟诟邷靥幚? d種子和5 d幼苗中的相對表達(dá)量是CK組的2.9倍和5.9倍，但其而在鹽脅迫處理5 d幼苗中相對表達(dá)量是CK組的5.0倍（圖6-K）?；蛟诟邷靥幚? d種子和5 d幼苗中的相對表達(dá)量分別是對照組的1.7倍和5.3倍（圖6-L）?；蛟诘蜏睾透邷靥幚? d種子中的相對表達(dá)量分別是CK組的5.3倍和7.7倍（圖6-M）?；蛟邴}處理2 d種子和5 d幼苗的相對表達(dá)量是CK組的5.1倍和9.6倍（圖6-N）。綜上所述，13個基因在不同逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征存在明顯差異，表明水稻基因家族功能具有多樣性。

表2 水稻W(wǎng)OX家族蛋白成員信息Table 2 Information of rice WOX family protein member

圖3 水稻W(wǎng)OX家族蛋白保守基序（A）及序列標(biāo)識圖（B）Fig.3 Rice WOX family protein conserved motif（A）and sequence identification diagram（B）

圖4 水稻W(wǎng)OX家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件分析結(jié)果Fig.4 Cis-acting element analysis of rice WOX family genes

圖5 水稻在種子萌發(fā)期（A）和低溫脅迫（B）下WOX家族基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平Fig.5 Transcriptional expression level of WOX family genes during rice seed germination（A）and cold stress（B）

圖6 水稻種子逆境萌發(fā)過程中WOX家族基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平Fig.6 Transcriptional expression level of WOX family genes during rice seed germination under stress

3 討論

WOX是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物干細(xì)胞的動態(tài)平衡調(diào)控、植物生長發(fā)育、組織器官的發(fā)生和形成及非生物脅迫響應(yīng)中具有重要調(diào)節(jié)作用（Stahl et al.，2009；Ji et al.，2010；Katsir et al.，2011）。盡管部分水稻基因家族成員的功能已有報(bào)道，但有關(guān)水稻整個WOX家族基因的生物信息學(xué)相關(guān)分析及在種子逆境萌發(fā)過程中的表達(dá)情況未見報(bào)道。本研究結(jié)構(gòu)域和基序分析結(jié)果表明，水稻13個WOX蛋白均Homodomain superfamily結(jié)構(gòu)，與番茄（李曉旭等，2016）、葡萄（王鵬飛等，2018）、玉米（鄭玲等，2019）、獼猴桃（付春等，2021）等物種的WOX結(jié)構(gòu)域類似，表明該結(jié)構(gòu)域在不同物種間存在高度保守性；13個水稻W(wǎng)OX家族蛋白序列中均含有保守基序Motif 1和Motif 2，而這2個基序也正是保守蛋白結(jié)構(gòu)域Homodomain的組成序列。與前人研究相比，水稻的保守結(jié)構(gòu)域和保守基序與擬南芥和葡萄WOX家族蛋白（王鵬飛等，2018）類似，但與其他物種略有不同，如番茄（李曉旭等，2016）、蘋果（王楚堃等，2019）和中華獼猴桃（付春等，2021）的WOX家族蛋白的Homeodomain結(jié)構(gòu)域中均含有Motif 1；毛竹WOX家族蛋白均含有Motif 1和Motif 3，這兩個保守基序共同組成Homodomain結(jié)構(gòu)域（李晨曦等，2016）。參考模式植物擬南芥的分類標(biāo)準(zhǔn)（王俞程等，2015），本研究結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可知，水稻基因家族成員分為遠(yuǎn)古進(jìn)化支、中間進(jìn)化支和現(xiàn)代進(jìn)化支，與蘋果（王楚堃等，2019）、中華獼猴桃（付春等，2020）、苦蕎（侯思宇等，2021）等較多作物的家族基因系統(tǒng)分類結(jié)果一致，但毛竹基因家族基因系統(tǒng)分類結(jié)果（李晨曦等，2016）存在一定差異，即系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中只含有現(xiàn)代進(jìn)化支和古老進(jìn)化支，缺乏中間進(jìn)化支。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在水稻古老進(jìn)化支僅含基因，而在中間進(jìn)化支和現(xiàn)代進(jìn)化支均含有6個基因。該結(jié)果與藜麥的家族基因進(jìn)化規(guī)律（即2個基因?qū)儆谶h(yuǎn)古支，4個基因?qū)儆谥虚g支和7個基因?qū)儆谶M(jìn)化支）（朱滿喜等，2020）類似。

種子萌發(fā)和幼苗建成質(zhì)量在較大程度上決定著作物生育后期的生物量和產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，水稻（Chen et al.，2020）和（Cho and Paek，2016）基因參與初生根的伸長和根系建成，和基因控制水稻側(cè)根原基（LRP）大小（Katsir et al.，2022）。但關(guān)于水稻家族基因如何調(diào)控水稻種子萌發(fā)和幼苗生長的研究尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，基因在萌發(fā)種子和幼苗中的表達(dá)量均較高，、基因在萌發(fā)種子的表達(dá)量高于其在幼苗中的表達(dá)量，而、和基因在幼苗中的表達(dá)量高于種子中的表達(dá)量。結(jié)合水稻家族基因啟動子順式作用元件的分析結(jié)果，上述基因中的和基因存在種子特異性反應(yīng)元件（RY-element），因此，推測這2個基因主要參與水稻種子萌發(fā)。低溫脅迫下，水稻萌發(fā)種子中和基因的表達(dá)量下調(diào)，而基因表達(dá)量上調(diào)，而其他基因的表達(dá)并未受到低溫脅迫的明顯影響。許多植物在低溫脅迫下家族基因表現(xiàn)相似的表達(dá)特征，如低溫脅迫下黃瓜葉片中基因的表達(dá)量升高，而、和基因的表達(dá)量下降（Han et al.，2021）；烏拉爾圖小麥在低溫脅迫下基因表達(dá)量顯著增加，、和基因表達(dá)量顯著降低（單強(qiáng)強(qiáng)等，2019）。但生長14 d的水稻幼苗在低溫處理6 h后，、、和基因表達(dá)量達(dá)較高水平（Cheng et al.，2014），與本研究結(jié)果有所不同，表明家族基因表達(dá)具有明顯的組織和時空表達(dá)特征。前人研究表明，在高溫和干旱脅迫下部分基因的表達(dá)呈現(xiàn)相似的表達(dá)模式，如基因在高溫和干旱脅迫下的表達(dá)量較高，過表達(dá)該基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的高溫和干旱抗性（Wu et al.，2009）。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下、、、和基因表達(dá)量不同程度的升高，但干旱脅迫下幼苗中、、、、和基因的表達(dá)量明顯升高，因此，和基因是在高溫和干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)的基因。Kawai等（2022）研究也發(fā)現(xiàn)，水稻幼苗根中基因的表達(dá)量隨著干旱程度增加而升高。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下大多數(shù)基因表達(dá)量未發(fā)生明顯變化，僅5 d幼苗中、和基因的表達(dá)量有不同程度的升高，與Cheng等（2014）研究發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下和基因在生長10 d的水稻幼苗中表達(dá)量顯著升高的結(jié)論相似。水淹脅迫是導(dǎo)致水稻生育過程中無氧呼吸的主要因素，許多應(yīng)激蛋白基因在這一過程中表達(dá)（Osakabe et al.，2014）。本研究的13個基因中，僅基因的表達(dá)受到淹水脅迫抑制，基因在萌發(fā)種子中有一定程度的升高，而其他基因均未發(fā)生明顯變化，表明家族基因中僅有較少基因參與水稻淹水脅迫萌發(fā)過程。

4 結(jié)論

相較于擬南芥和玉米，水稻基因家族成員在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化上較先進(jìn)，僅保留一個古老分支，且其啟動子區(qū)域均含有大量光響應(yīng)和脅迫響應(yīng)元件，推測水稻家族基因在功能上偏向于參與光合作用和逆境應(yīng)答方面?；蛟谒痉N子萌發(fā)、幼苗及各種非生物脅迫下呈現(xiàn)豐富多樣的表達(dá)模式，其中，和基因?yàn)檎{(diào)控種子萌發(fā)的關(guān)鍵基因。