胚胎冷凍時間對凍融胚胎移植結(jié)局的影響

梁慧枝，王治鴻，楊盼

1983年，澳大利亞學(xué)者Trounson和Mohr等采用程序化冷凍（slow cooling）技術(shù)成功保存了8-細(xì)胞期胚胎，成功實(shí)現(xiàn)了世界首例凍融胚胎妊娠。凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）提高了胚胎利用率及累積妊娠率，降低了多胎妊娠及卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyper-stimulation syndrome，OHSS）的發(fā)生率，可獲得與新鮮移植周期相當(dāng)甚至更好的妊娠結(jié)局，逐步成為輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)[1]。如今胚胎冷凍技術(shù)應(yīng)用于臨床已近四十年，目前的胚胎冷凍技術(shù)主要包括程序化冷凍和玻璃化冷凍。近年玻璃化冷凍技術(shù)發(fā)展迅速并被廣泛應(yīng)用，逐步取代程序化冷凍，目前已經(jīng)成為胚胎首選的冷凍方式[2]。但是長期冷凍保存對胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響仍存在爭議，需進(jìn)一步研究。為探討玻璃化冷凍保存時間對卵裂期FET結(jié)局的影響，本研究對激素替代周期卵裂期FET的3 847個周期的情況進(jìn)行回顧性分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧性分析2017年1月—2020年12月山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（本中心）進(jìn)行卵裂期胚胎玻璃化冷凍復(fù)蘇移植的3 847個周期，包括8 767枚凍融胚胎。根據(jù)胚胎凍存時間分為5組，≤1年組，（1～2]年組、（2～3]年組、（3～4]年組和＞4年組，比較5組一般情況、胚胎復(fù)蘇情況及妊娠結(jié)局的差異。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷為不孕癥，不孕原因主要是男方因素、女方輸卵管因素和排卵障礙；新鮮周期在本中心行長方案體外受精/卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（in vitro fertilization/intra cytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI）助孕治療，內(nèi)膜準(zhǔn)備方案為激素替代方案；取卵年齡≤40歲，移植時體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）18～23.9 kg/m2；夫妻雙方術(shù)前常規(guī)檢查未見明顯異常；有明確妊娠結(jié)局（除外結(jié)局失訪）。排除標(biāo)準(zhǔn)：有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史；男女任意一方染色體異常；患高血糖、高血壓、慢性消耗性疾病及自身免疫性疾病等全身性疾病；子宮解剖結(jié)構(gòu)異常，如子宮縱隔、宮腔粘連、子宮腺肌病和子宮肌瘤；患有代謝性疾病，如多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥和甲狀腺疾病；有不良習(xí)慣，如過度吸煙、酗酒和吸食毒品[3]。

1.2 研究方法

1.2.1 促排卵方案及卵裂期胚胎培養(yǎng)方法所有患者均采用激動劑長方案促排卵：月經(jīng)周期第2～4天或黃體中期使用促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRHa）14～21 d后，檢測血卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和雌二醇（estradiol，E2）水平，若垂體達(dá)降調(diào)節(jié)水平（FSH＜5 U/L，LH＜5 U/L，E2＜50 pg/mL）且子宮內(nèi)膜厚度＜5 mm，開始使用外源性促排卵藥物（重組卵泡刺激素或尿促性素），據(jù)卵泡發(fā)育情況調(diào)整藥物用量。卵泡成熟后在陰道超聲監(jiān)測下取卵，將卵母細(xì)胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)4～6 h，根據(jù)患者情況行常規(guī)IVF/ICSI，受精后16～20 h觀察受精情況，檢查是否存在原核（pronuclear，PN），根據(jù)原核數(shù)目分為0PN、1PN、2PN和多PN，出現(xiàn)2PN且卵周隙內(nèi)有2個極體者為正常受精，第3天（D3）用Edwards評分法[4]進(jìn)行卵裂期胚胎評分。新鮮周期胚胎移植后，如有≥1枚的可冷凍胚胎（4～8-細(xì)胞，卵裂球大小均勻，細(xì)胞碎片≤20%），征得患者同意后將胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍。

1.2.2 胚胎玻璃化冷凍、解凍方法①冷凍方法：從2～8℃冷藏 柜 中 取 出 冷 凍 試 劑ES（Equilibrium Solution）、VS（Vitrification Solution），室溫平衡30 min后，將D3胚胎置于ES中平衡8 min左右，待其形態(tài)恢復(fù)到原來的80%～90%時轉(zhuǎn)入VS中，在VS中沖洗數(shù)次，盡量除去ES液，隨后將胚胎裝入載桿、套上外套管后，迅速投入液氮，使胚胎隔離液氮。胚胎在VS中的時間以及投入液氮的整個過程≤1 min。②解凍方法：解凍試劑包括TS（Thawing Solution）、DS（Diluent Solution）、WS1（Washing Solution 1）和WS2這4種液體，提前30 min取出1 mL TS倒入雙凹皿中并置于37℃培養(yǎng)箱中預(yù)溫，其余3種液體分別置于室溫下4孔板中復(fù)溫。解凍時，將解凍胚胎移入裝有液氮的泡沫箱內(nèi)、拿掉外套管，利用載體將胚胎放入TS中，反復(fù)洗滌1 min，隨后依次在DS、WS1中平衡，在WS2中洗滌，最后將胚胎轉(zhuǎn)入G2培養(yǎng)液中培養(yǎng)2～3 h準(zhǔn)備移植。

1.2.3 胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)①新鮮周期：卵裂期胚胎按Edwards標(biāo)準(zhǔn)[4]分為4級：Ⅰ級胚胎，卵裂球大小均勻，無細(xì)胞死亡，碎片＜10%；Ⅱ級胚胎，卵裂球大小比較均勻，死亡卵裂球或碎片10%～20%；Ⅲ級胚胎，碎片或死亡卵裂球在20%～50%之間；Ⅳ級胚胎，碎片或死亡卵裂球＞50%。Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。②解凍周期：解凍后存活細(xì)胞數(shù)≥50%的卵裂期胚胎可視為復(fù)蘇成功。

1.2.4 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案所有納入患者均采用激素替代周期行FET。月經(jīng)期第3～5天B超檢查子宮附件無異常、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）陰性后，口服戊酸雌二醇遞增法，根據(jù)子宮內(nèi)膜生長情況適時調(diào)整用藥劑量。當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm時口服黃體酮膠囊（150 mg，2次/d）和地屈孕酮片（10 mg，2次/d）轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，3 d后對卵裂期胚胎進(jìn)行解凍、并對復(fù)蘇成功的胚胎進(jìn)行移植。35歲以下者移植胚胎數(shù)不超過2個，35歲及以上或反復(fù)種植失敗[5]（recurrent implantion failure，RIF）者移植胚胎數(shù)不超過3個[6]。

1.2.5 診斷標(biāo)準(zhǔn)胚胎移植2周后血hCG≥10 U/L，但超聲未見宮內(nèi)妊娠囊者診斷為生化妊娠。胚胎移植4周后陰道超聲探及宮腔內(nèi)一個或多個妊娠囊者診斷為臨床妊娠；于宮腔外探及妊娠囊者診斷為異位妊娠，包括宮外妊娠及宮內(nèi)外同時妊娠。妊娠不足28周、胎兒體質(zhì)量不足1 000 g而自然終止妊娠者診斷為流產(chǎn)。宮腔內(nèi)同時有2個或2個以上胎兒的診斷為多胎妊娠。

1.3 觀察指標(biāo)①一般資料：包括患者取卵年齡、移植年齡、移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)。②實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)：包括胚胎存活率（解凍后胚胎存活數(shù)/解凍胚胎數(shù)×100%）、胚胎完好率（解凍后胚胎完好數(shù)/解凍后胚胎存活數(shù)×100%）、優(yōu)質(zhì)胚胎率（優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/存活2PN胚胎數(shù)×100%）、著床率（妊娠囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%）。③臨床指標(biāo)：包括臨床妊娠率（臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，臨床妊娠包括宮內(nèi)妊娠和異位妊娠）、流產(chǎn)率（流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%）、異位妊娠率（異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，含宮內(nèi)外復(fù)合妊娠）、活產(chǎn)率（活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%）、多胎妊娠率（多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%）、分娩孕周及胎兒出生體質(zhì)量、男孩出生比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。定量資料均符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Bonferroni法；定性資料用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。在多因素分析上，采用二分類Logistic回歸分析FET結(jié)局的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者的一般資料比較各組移植日子宮內(nèi)膜厚度和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組取卵年齡、移植年齡、移植胚胎數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，≤1年組和（1～2]年組的取卵年齡大于其他組，＞4年組的移植年齡大于其他組，（3～4]年組、＞4年組的移植胚胎數(shù)大于≤1年組和（1～2]年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組患者的一般資料比較 （±s）

表1 各組患者的一般資料比較 （±s）

注：a與≤1年組比較，P＜0.05；b與（1～2]年組比較，P＜0.05；c與（2～3]年組比較，P＜0.05；d與（3～4]年組比較，P＜0.05。

組別 周期數(shù) 取卵年齡（歲） 移植年齡（歲） 移植日子宮內(nèi)膜厚度（mm） 移植胚胎數(shù)（枚） 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（枚）≤1年組 2 169 30.24±4.21 30.68±4.28 9.97±1.36 2.24±0.62 1.20±0.76（1～2]年組 1 130 30.04±4.02 30.94±4.16 9.98±1.35 2.28±0.66 1.16±0.74（2～3]年組 328 29.35±3.80ab 30.78±4.00 9.93±1.34 2.35±0.64 1.28±0.83（3～4]年組 102 28.36±3.52ab 31.58±3.43 10.25±1.49 2.45±0.64ab 1.34±0.88＞4年組 118 28.53±3.35ab 33.20±3.19abcd 10.02±1.33 2.53±0.64ab 1.21±0.88 F 15.192 17.766 1.215 8.872 2.254 P 0.000 0.000 0.302 0.000 0.062

2.2 各組患者胚胎及著床指標(biāo)的比較各組解凍后胚胎存活率、胚胎完好率、優(yōu)質(zhì)胚胎率以及著床率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 [%（n/n）]

2.3 各組患者臨床結(jié)局比較（2～3]年組臨床妊娠率、活產(chǎn)率均高于≤1年組、（1～2]年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組異位妊娠率、流產(chǎn)率和多胎妊娠率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

表3 各組患者的臨床結(jié)局比較 [%（n/n）]

2.4 各組新生兒結(jié)局比較各組分娩孕周、新生兒出生體質(zhì)量、出生男孩占比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組新生兒結(jié)局比較

2.5 影響臨床妊娠和活產(chǎn)的多因素分析分別以臨床妊娠（賦值：0=無，1=有）及活產(chǎn)（賦值：0=無，1=有）作為因變量，以取卵年齡、移植年齡、凍存時間、移植胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)為自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，取卵年齡、移植年齡和凍存時間對臨床妊娠、活產(chǎn)無顯著影響（P＞0.05），優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和移植胚胎數(shù)對臨床妊娠、活產(chǎn)有顯著影響（P＜0.05）。優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)每增加1枚，臨床妊娠的機(jī)會分別增加至1.493倍、1.223倍，活產(chǎn)的機(jī)會分別增加至1.371倍、1.179倍。見表5、6。

表5 臨床妊娠影響因素的二元Logistic回歸分析

3 討論

胚胎玻璃化冷凍保存簡單、高效、低損傷，逐漸取代程序化冷凍，成為胚胎冷凍保存的首選方式[7-8]。理論上講，保存在液氮（-196℃）中的細(xì)胞酶的活力幾乎完全被抑制，停止一切新陳代謝，可被長久保存[9]。有研究認(rèn)為，胚胎冷凍技術(shù)即使能保存細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的原有狀態(tài)，但仍會潛在影響生殖細(xì)胞和胚胎基因組結(jié)構(gòu)和功能的完整性，影響復(fù)蘇后細(xì)胞的正常分裂[10]。臨床工作中高濃度冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）有直接的細(xì)胞毒性作用；低濃度DMSO（≤10%）也會影響基因轉(zhuǎn)錄及表觀遺傳，引起持續(xù)的表觀遺傳差異[11]。雖然全世界報(bào)道了許多經(jīng)過極限胚胎冷凍時間后成功妊娠并分娩健康兒的案例[12]，但冷凍時間超過10年的活產(chǎn)均為個案報(bào)道。長期胚胎冷凍保存時間對FET子代安全性的影響尚不清楚，所以有必要對玻璃化冷凍胚胎長期保存后胚胎質(zhì)量與解凍后妊娠結(jié)局進(jìn)行回顧性分析。

3.1 凍存時間與胚胎復(fù)蘇有研究表明冷凍復(fù)蘇細(xì)胞的存活率隨著低溫儲存時間的延長而下降[13]。2011年Lavara等[14]報(bào)道在液氮中保存15年的玻璃化冷凍胚胎仍可獲得良好的存活率、妊娠率和活產(chǎn)率。本研究顯示，各組解凍后胚胎存活率、胚胎完好率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明冷凍復(fù)蘇后胚胎的存活率并不會隨著儲存時間的延長而下降，未發(fā)現(xiàn)胚胎玻璃化冷凍時間延長對胚胎質(zhì)量有不良影響。

表6 活產(chǎn)影響因素的二元Logistic回歸分析

3.2 凍存時間與妊娠結(jié)局凍存時間與妊娠結(jié)局的關(guān)系尚無定論。有研究認(rèn)為玻璃化冷凍保存時間延長對妊娠結(jié)局有負(fù)面影響[15]。Li等[15]對24 698例患者進(jìn)行的單中心研究同樣表明，延長凍存時間降低了臨床妊娠和活產(chǎn)的可能性。2018年《冷凍胚胎保存時限的中國專家共識》同樣認(rèn)為，胚胎冷凍保存6年內(nèi)不影響復(fù)蘇后胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局[16]。同樣有研究認(rèn)為，5年內(nèi)低溫保存的卵裂期胚胎FET后的移植結(jié)局無顯著差異[17]。但是尚無足夠證據(jù)證實(shí)凍存時間超過6年對FET的安全性有影響。

本研究本想探討卵裂期胚胎長期玻璃化冷凍保存對妊娠結(jié)局的影響，尤其是超過6年的玻璃化冷凍保存對解凍移植結(jié)局的影響。但由于胚胎凍存時間＞4年的樣本量太小，為減少統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對胚胎冷凍保存時間為（4～5]年、（5～6]年、＞6年的樣本進(jìn)行了合并。結(jié)果表明，各組的著床率、流產(chǎn)率、異位妊娠率和多胎妊娠率相似；臨床妊娠率、活產(chǎn)率在不同凍存時間組之間有差異。對可能的相關(guān)影響因素進(jìn)行Logistic回歸分析顯示，取卵年齡、移植年齡、凍存時間均對臨床妊娠及活產(chǎn)無顯著影響（P＞0.05），移植胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)增加可一定范圍內(nèi)改善臨床妊娠和活產(chǎn)結(jié)局（P＜0.05）。即凍存時間不會對妊娠結(jié)局產(chǎn)生顯著影響，適當(dāng)增加卵裂期移植胚胎及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量可增加臨床妊娠率及活產(chǎn)率。這與Zhu等[18]的研究結(jié)論一致。

3.3 凍存時間與新生兒結(jié)局本研究表明采用玻璃化冷凍保存卵裂期胚胎，凍存時間對新生兒結(jié)局無顯著影響。劉艷麗等[19]分析8 338枚凍融胚胎的移植結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胚胎凍存時間不會影響新生兒的身長、出生體質(zhì)量，與本研究結(jié)論一致。新生兒健康指標(biāo)還包括是否有出生缺陷、身長以及各器官系統(tǒng)是否發(fā)育異常等，本研究以新生兒出生體質(zhì)量和分娩孕周作為考察其健康狀況的指標(biāo)，由此推斷胚胎玻璃化冷凍的凍存時間對新生兒結(jié)局無顯著影響，存在一定局限性。自然妊娠生育模式下，子代男/女性別比為106∶100～110.2∶100[20]。本研究中男孩占比為52.3%（291/556），即男/女性別比為109∶100，即卵裂期胚胎解凍移植的性別比接近自然妊娠模式。

綜上，本研究結(jié)果顯示卵裂期胚胎玻璃化冷凍保存時間延長對胚胎質(zhì)量、妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局無顯著影響，改善妊娠結(jié)局需移植優(yōu)質(zhì)胚胎，并合理限制胚胎移植數(shù)量。但本研究結(jié)果只針對合并組別后的＞4年組，且最長胚胎保存時間為7年。此外，本研究未對子代出生缺陷及子代遠(yuǎn)期影響進(jìn)行研究，因此胚胎凍存時間過長對卵裂期胚胎凍融移植是否有影響仍需進(jìn)一步探討。