染色體核型分析聯(lián)合CNV-seq在NT增厚胎兒產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

胡艷平，袁靜，李琴，周培，程龍鳳

胎兒頸項(xiàng)透明層（nuchal translucency，NT）指胎 兒頸后部皮下組織內(nèi)液體集聚的厚度；孕11～13+6周NT增厚是早期篩查胎兒染色體非整倍體的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)染色體核型分析無(wú)法檢出5～10 Mb以下的染色體微缺失/微重復(fù)，隨著拷貝數(shù)變異測(cè)序（copy number variation sequencing，CNV-seq）在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，我國(guó)專家共識(shí)建議對(duì)有介入性產(chǎn)前診斷指征或需求的孕婦，在其充分知情的前提下，可將CNV-seq作為一線的產(chǎn)前診斷方法供其選擇[1]。安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（我院）產(chǎn)前診斷中心以NT≥2.5 mm為界值，采用染色體核型分析聯(lián)合CNV-seq技術(shù)，探討其在NT增厚胎兒中的應(yīng)用。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象及分組選擇2020年1月—2021年10月就診于我院孕11～13+6周NT≥2.5 mm的單胎孕婦189例。根據(jù)是否合并其他介入產(chǎn)前診斷指征（高齡、血清學(xué)異常、超聲異常等）分為單純NT增厚組（119例）和非單純NT增厚組（70例）。根據(jù)NT厚度分為2.5 mm≤NT＜3.5 mm組（123例）和NT≥3.5mm組（66例）。孕婦及家屬充分知情選擇并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)室方法孕16～24周在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水21～23 mL，其中16～18 mL羊水進(jìn)行G顯帶染色體核型分析，5 mL羊水用于CNV-seq檢測(cè)。

1.2.1 染色體核型分析采用原位細(xì)胞培養(yǎng)法，常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片和G顯帶、全自動(dòng)掃描儀掃描、拍照，按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制參照ISCN（2020）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體核型分析。

1.2.2 CNV-seq方法患者羊水標(biāo)本進(jìn)行離心沉淀，取羊水中胎兒脫落細(xì)胞提取DNA，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行質(zhì)控，通過(guò)HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)。將染色體全基因組測(cè)序檢測(cè)到的基因組CNV，參照國(guó)際基因組CNV多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)Decipher、UCSC Genome Browser、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、International Standards for Cytogenomic Arrays（ISCA）等以及相關(guān)文獻(xiàn)評(píng)估CNV-seq結(jié)果是否有致病性，并附上相關(guān)文獻(xiàn)。檢測(cè)報(bào)告嚴(yán)格按照2019年中國(guó)低深度全基因組測(cè)序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)[1]進(jìn)行CNV-seq分級(jí)，CNV-seq結(jié)果有5個(gè)等級(jí)：致病性、可能致病性、臨床意義不明、可能良性及良性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定性資料用率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

189例NT增厚的胎兒中染色體核型檢出異常31例（檢出率16.40%），包括非整倍體24例（12.70%）和結(jié)構(gòu)異常7例（3.70%）；CNV-seq檢出致病性拷貝數(shù)變異（pathogenic copy number variations，pCNVs）38例（20.11%），其中非整倍體24例（12.70%），其他pCNVs 14例（7.41%），包括微缺失/微重復(fù)綜合征10例（5.29%）和染色體片段缺失/重復(fù)4例（2.12%）。CNVseq在158例染色體核型正常者中額外檢出pCNVs 9例（5.70%）。

2.1 染色體核型分析24例非整倍體中21-三體16例、18-三體5例、Turner綜合征3例，分別占染色體核型異常的51.61%（16/31）、16.13%（5/31）和9.68%（3/31）。7例染色體結(jié)構(gòu)異常中46,XX,t(11:15)(q14:q26)dup(11)(q14q25)、46,XY,der(8)、46,XX,?der(15),del(18)、46,XY,del(13)(q14,q34)、46,XY,dup(4)(q27q35)del(4)(p16)各1例，2例46，XX，inv(9)(p12q13)。染色體多態(tài)性8例。

2.2 CNV-seq結(jié)果分析CNV-seq檢出非致病性變異者19例（10.05%），其中臨床意義不明者13例（6.88%）、可能良性、良性者各3例。非單純NT增厚組pCNVs、染色體非整倍體檢出率均高于單純NT增厚組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），2組其他pCNVs檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。NT≥3.5 mm組pCNVs、染色體非整倍體檢出率均高于2.5 mm≤NT＜3.5 mm組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），2組其他pCNVs檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。14例其他pCNVs包括10例（5.29%）微缺失/微重復(fù)綜合征，4例（2.12%）非綜合征致病性片段缺失/重復(fù)，見(jiàn)表2。

表1 不同NT增厚類型及程度分組pCNVs分析[例（%）]

表2 14例其他pCNVs及染色體核型分析

3 討論

3.1 NT增厚核型分析研究表明，染色體異常發(fā)生率隨NT厚度的增加而增加；當(dāng)NT增厚合并其他超聲異常時(shí)胎兒染色體異常的發(fā)生率明顯增高[2]。NT增厚中染色體異常包括21、18和13三體綜合征，以及Turner綜合征、三倍體，微缺失/微重復(fù)綜合征和某些單基因?。ㄈ鏝oonan綜合征）[3]。在NT增厚的染色體異常胎兒中，50%為21三體綜合征，25%為18或13三體綜合征，10%為Turner綜合征，5%為三倍體，10%為其他染色體異常[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道NT值位于2.4～3.4 mm、3.5～4.4 mm、4.5～5.4 mm、5.5～6.4 mm及≥6.5 mm時(shí)，胎兒染色體核型異常的發(fā)生率分別為10%、12%、33%、46%和58%[5]。研究表明NT≥2.5 mm染色體核型異常發(fā)生率為14.63%，其中染色體核型非整倍體發(fā)生率13.41%[6]，本研究與文獻(xiàn)報(bào)道相似。非單純NT增厚組及NT≥3.5 mm組染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)（約2 1%）分別明顯高于單純N T增厚組和2.5 m m≤N T＜3.5 m m組。N T增厚合并其他指征或N T厚度≥3.5 m m時(shí)，對(duì)于焦慮的孕婦可選擇絨毛穿刺術(shù)（孕1 1～1 3+6周），早期診斷可降低孕婦終止妊娠帶來(lái)的傷害。由于絨毛穿刺對(duì)技術(shù)要求及風(fēng)險(xiǎn)高于羊膜腔穿刺術(shù)，本中心尚未開展絨毛穿刺術(shù)。本中心一般選擇1 8周后進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)，但針對(duì)N T≥3.5 m m或N T增厚合并超聲結(jié)構(gòu)異常的孕婦知情選擇可在孕1 6周后進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)。本研究染色體核型檢出7例染色體結(jié)構(gòu)異常的病例中3例染色體易位導(dǎo)致染色體重排時(shí)發(fā)生染色體片段缺失/重復(fù)，2例9號(hào)染色體臂間倒位，C N V-s e q可檢出染色體缺失或重復(fù)，但無(wú)法檢出染色體易位或倒位等。在我國(guó)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的產(chǎn)前機(jī)構(gòu)，針對(duì)N T增厚的胎兒染色體核型分析仍應(yīng)作為產(chǎn)前診斷的首要檢查方法。

3.2 致病性CNV分析隨著產(chǎn)前診斷檢測(cè)技術(shù)日益成熟，在NT增厚胎兒中pCNVs逐漸被發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)NT≥3.0 mm胎兒pCNVs風(fēng)險(xiǎn)隨NT厚度增加而增加[7]，pCNVs檢出率21.8%～25.9%，其中染色體非整倍體、其他pCNVs檢出率分別為16.93%～22.0%和3.9～4.91%[7-8]。文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)于NT≥3.5 mm染色體核型正常的胎兒，pCNVs檢出率為5%～6.8%[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)NT≥2.5 mm時(shí)，在染色體核型正常胎兒中額外檢出5.63%的pCNVs，與選擇NT≥3.0 mm胎兒或NT≥3.5 mm的胎兒研究相比基本相似。目前對(duì)NT界值作為介入性產(chǎn)前診斷的標(biāo)準(zhǔn)不一致，部分機(jī)構(gòu)以NT≥3.0 mm為界值[7-8]，部分以NT≥2.5 mm為界值[2,4,6,10]。本研究9例染色體核型正常者中3例NT厚度在2.5～3.0 mm者檢出pCNVs，且本研究發(fā)現(xiàn)其他pCNVs與NT增厚程度無(wú)明顯相關(guān)性，這與其他研究一致[8,11]，因此筆者推薦當(dāng)NT≥2.5 mm時(shí)，排除胎兒染色體非整倍體外，也應(yīng)關(guān)注是否具有微缺失/微重復(fù)。此外，本研究其他pCNVs與NT增厚合并其他指征亦無(wú)相關(guān)性，但非單純NT增厚組檢出率（11.43%）高于單純NT增厚組（5.04%），故認(rèn)為胎兒NT增厚合并其他指征者是CNV-seq檢查的重點(diǎn)對(duì)象，以避免漏診其他的pCNVs，但此結(jié)論仍需大樣本進(jìn)一步研究。

3.3 微缺失/微重復(fù)綜合征在NT增厚中最常見(jiàn)的pCNVs微缺失/微重復(fù)為22q11.2缺失、22q11.2重復(fù)、10q26.12q26.3缺失和12q21q22缺失[9]。22q11.2微缺失/微重復(fù)綜合征表型均存在外顯不全且高度可變，且存在相同或相似的臨床表型[12-13]。22q11.2微缺失綜合征主要與先天性心臟病、腭部異常等有關(guān)[13]，Tbox1轉(zhuǎn)錄因子（TBX1）基因缺失是心臟異常主要因素，本研究1例22q11.2微缺失綜合征合并胎兒心臟異常的表型，因此，產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)NT增厚合并心臟病的胎兒在排除非整倍體時(shí)，首先考慮是否合并22q11.2微缺失綜合征。本研究發(fā)現(xiàn)3例合并1q21.1微缺失綜合征，該綜合征患者的表型存在外顯不全且高度可變[14]，常見(jiàn)表型為面部畸形、小頭畸形和發(fā)育遲緩等。16p13.11微缺失/重復(fù)區(qū)域?yàn)樯窠?jīng)認(rèn)知障礙易感區(qū)，存在外顯不全，部分?jǐn)y帶者無(wú)明顯臨床癥狀[15-16]。綜上，NT增厚中微缺失/微重復(fù)綜合征表型多數(shù)為外顯不全或高度可變，即使胎兒與父母攜帶相同的致病性微缺失/微重復(fù)，也無(wú)法通過(guò)父母的表型準(zhǔn)確判斷胎兒出生后是否發(fā)病[1]。因此，在NT增厚檢出外顯不全的微缺失/微重復(fù)綜合征的胎兒，在超聲結(jié)構(gòu)正常且染色體核型正常的情況下，主要的難點(diǎn)是產(chǎn)前咨詢對(duì)其表型的預(yù)判，需充分告知孕婦及家屬胎兒出生后的可能表型，使其知情并選擇是否繼續(xù)妊娠。

綜上，隨著NT增厚或合并其他介入產(chǎn)前診斷指征，胎兒染色體異常風(fēng)險(xiǎn)增加，主要為染色體非整體異常風(fēng)險(xiǎn)增加，但與其他pCNVs無(wú)明顯相關(guān)，由于本研究樣本量及其他pCNVs檢出數(shù)量少，結(jié)果可能存在偏倚，仍需大樣本進(jìn)一步研究。染色體核型分析聯(lián)合CNV-seq可避免染色體結(jié)構(gòu)異常及染色體微缺失/微重復(fù)的漏診，建議臨床采用并積累經(jīng)驗(yàn)提高診斷準(zhǔn)確率。