基于質(zhì)量源于設(shè)計理念和信息熵賦值法優(yōu)化枸杞子抗氧化功能性提取物的工藝△

侯憲捷，曾文俊，丁建寶，李艷萍，馬建龍，楊銳，楊晉，4*

1.北方民族大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021；

2.國家民委化工技術(shù)基礎(chǔ)重點實驗室，寧夏 銀川 750021；

3.寧夏五行科技有限公司，寧夏 銀川 750002；

4.寧夏天然藥物工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021；

5.寧夏大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，寧夏 銀川 750021

中藥作為我國獨特的醫(yī)療衛(wèi)生資源，在保障人民健康方面發(fā)揮著不可替代的作用。但中藥生產(chǎn)過程中的不確定性、質(zhì)量控制的復(fù)雜性，以及長期以來產(chǎn)品質(zhì)量依靠終端檢驗，忽略了對原料質(zhì)量屬性和生產(chǎn)工藝過程的理解，造成中藥制劑的質(zhì)量不穩(wěn)定[1-2]。因此，提升和穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量、加速中藥生產(chǎn)工藝的標(biāo)準(zhǔn)化、促進中藥工業(yè)向現(xiàn)代化科技升級，需要更加科學(xué)和系統(tǒng)的方法。

質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）理念是目前國際公認的先進控制理念，是一種以預(yù)期目標(biāo)為導(dǎo)向、基于系統(tǒng)性風(fēng)險管理的開發(fā)方法[3]。該理念將質(zhì)量控制重心轉(zhuǎn)移至原料控制和生產(chǎn)過程控制，通過評估可能影響質(zhì)量的變量，確定有針對性的策略，使產(chǎn)品質(zhì)量始終處于可接受的范圍，為藥品質(zhì)量的風(fēng)險管理和持續(xù)改進提供了方法[4-5]。在QbD 理念指導(dǎo)下，可以通過以下策略對全過程進行風(fēng)險防控，明確各工藝所影響的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進而實現(xiàn)產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性和可控性：1）確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）；2）辨識關(guān)鍵原料屬性（CMA）和關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPPs）；3）建立關(guān)鍵工藝單元數(shù)學(xué)模型；4）構(gòu)建工藝穩(wěn)定的設(shè)計空間；5）不斷改進控制策略[6-11]。

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實，具有滋補肝腎、益精明目的功效[12]?，F(xiàn)代研究認為，枸杞子通過抗氧化來實現(xiàn)長壽[13-14]。大量的研究結(jié)果表明，枸杞子的抗氧化活性是枸杞多糖和小分子化合物的協(xié)同作用[15-18]，提取方法不同可能會影響提取物的抗氧化活性[17-18]。因此，以抗氧化活性為CQA，在QbD 理念指導(dǎo)下，研究和優(yōu)化枸杞子抗氧化功能性提取物（AOE）的工藝，建立數(shù)學(xué)模型并確定設(shè)計空間，制定提取工藝的控制策略，為開發(fā)以生物活性為導(dǎo)向的枸杞子提取物工藝優(yōu)化和控制方法提供參考。

中藥“形之于外”的藥性是藥材整體化學(xué)物質(zhì)群綜合生物效應(yīng)的體現(xiàn)[4]。前期的研究也表明，枸杞子中小分子化合物以不同途徑發(fā)揮抗氧化作用[19]。以單一指標(biāo)作為CQA 來評價制備工藝的優(yōu)劣具有片面性，大多研究選取多個指標(biāo)成分，再通過主觀或客觀賦權(quán)法得到綜合評價指標(biāo)，對中藥提取工藝進行優(yōu)化[20-21]。主觀賦權(quán)法主要根據(jù)經(jīng)驗進行判定，受研究者的主觀影響大[22]。客觀賦權(quán)法經(jīng)過對實驗數(shù)據(jù)的整理、計算和分析，得到權(quán)重系數(shù)，數(shù)據(jù)可靠性更高[23]。信息熵作為一種廣泛使用的客觀賦權(quán)法，能清晰地反映實驗數(shù)據(jù)的客觀規(guī)律、降低了主觀因素對實驗結(jié)果的影響，已經(jīng)在多種中藥提取工藝優(yōu)化研究中取得良好的效果[21,23-28]。

本研究采用信息熵理論，計算枸杞子提取物體外鐵離子還原能力（FRAP）、清除2,2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS）和羥自由基（OH·）能力的信息熵和權(quán)重系數(shù)，確定提取物體外抗氧化能力（M），結(jié)合總固形物質(zhì)量，作為CQAs；在QbD 理念指導(dǎo)下，析因分析初步篩選CPPs，通過Box-Behnken 設(shè)計建立CQAs 和CPPs 之間的數(shù)學(xué)模型，建立并優(yōu)化AOE制備工藝的設(shè)計空間，在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)，為大工業(yè)生產(chǎn)和制備工藝的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FD-1C-50 型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；手動移液器（德國Eppendorf 公司）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher 公司）；FA2004 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

2,4,6-三(2-吡啶基) 三嗪（TPTZ，批號：190516）、ABTS（批號：190826）購于上海泰坦科技有限公司；三氯化鐵（FeCl3）六水化合物（批號：180615）、冰醋酸（批號：170823）、過硫酸鉀（K2SO4批號：190816）、硫酸亞鐵（FeSO4）七水合物（批號：200425）購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；鹽酸（純度：36%）、水楊酸（純度：99%）、過氧化氫（H2O2，純度：30%）購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；維生素C（批號：190315，上海泰坦科技有限公司）。

枸杞子購于寧夏中寧縣，經(jīng)寧夏農(nóng)林科學(xué)院李彥龍高級工程師鑒定為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實，樣品保存于北方民族大學(xué)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

稱取枸杞子20.0 g，以去離子水為提取溶劑，采用水提法，濾過，合并提取液，減壓濃縮，定容至100 mL 量瓶中，從中精密吸取濃縮液，凍干后，即為樣品，待測。

2.2 抗氧化能力測定

供試品溶液的制備：取枸杞子提取物樣品200 mg，以去離子水溶解并定容至10 mL 量瓶中，搖勻，稀釋成質(zhì)量濃度分別為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 mg·mL-1的溶液。

2.2.1FRAP測定 FRAP工作液配制：將0.3 mol·L-1醋酸緩沖液、10mmol·L-1TPTZ溶液、20mmol·L-1FeCl3溶液以10∶1∶1混合，即得工作液。

FRAP 測定：分別吸取不同質(zhì)量濃度供試品溶液0.2 mL 于試管中，并加入工作液3.9 mL。在37 ℃下孵育10 min后，在593 nm處測定吸光度，每組平行3 次，以維生素C 溶液為陽性對照。在FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算供試品溶液對應(yīng)的FeSO4濃度[29-30]，方程為Y=1.018 5X+0.062 2（r=0.999 8）。

2.2.2ABTS 自由基清除能力測試 ABTS 基液的配制：將7 mmol·L-1的ABTS溶液和2.45 mmol·L-1的K2SO4溶液以1∶1 混合，于暗處孵育12～16 h，即得。

ABTS工作液的制備：將ABTS基液用去離子水稀 釋（20～40 倍）至波長734 nm 處吸光度為（1.000±0.005），即得。

ABTS 自由基清除能力測試：取不同質(zhì)量濃度供試品溶液0.2 mL 于試管中，加入工作液3.9 mL，室溫下孵育5 min，測量反應(yīng)混合物在734 nm 處的吸光度，去離子水做空白對照，以維生素C 溶液為陽性對照，并計算1/半數(shù)抑制率（IC50）[31-32]。

2.2.3OH·清除能力測試 按照順序依次加入供試品溶液0.2 mL，9 mmol·L-1FeSO4溶液、9 mmol·L-1水楊酸溶液各1 mL于試管中，然后加入8.8 mmol·L-1H2O2溶液1 mL 啟動反應(yīng)。37 ℃孵育30 min，于510 nm 處測定反應(yīng)溶液的吸光度，去離子水做空白對照，以維生素C溶液為陽性對照，并計算1/IC50值[31,33]。

2.3 信息熵賦值法綜合評價提取物的M

首先建立原始數(shù)據(jù)矩陣，經(jīng)過歸一化處理之后得到指標(biāo)概率矩陣，然后計算出各指標(biāo)的熵和權(quán)重系數(shù)，某一項評價指標(biāo)下的數(shù)據(jù)之間差異性越大，熵越小，權(quán)重系數(shù)反而越大，最后將指標(biāo)概率矩陣中的數(shù)據(jù)加權(quán)處理，即可得到綜合評價指標(biāo)[23-24]，具體步驟如下。

1）建立原始矩陣(Xij)mn。

xij表示第j次實驗時第i個評價指標(biāo)的取值。

2）將原始矩陣X轉(zhuǎn)化為指標(biāo)概率矩陣(Pij)mn。

3）計算第i個評價指標(biāo)的信息熵（H）。

4）計算第i個評價指標(biāo)的權(quán)重（W）。

5）依據(jù)各指標(biāo)的W，計算M。

2.4 總固形物質(zhì)量測定

按照《中華人民共和國藥典》2020 年版（四部）“2201 浸出物測定法”項下方法測定，精密量取枸杞子提取液5 mL，置于已經(jīng)干燥恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴蒸干后，于105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中放置30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算總固形物質(zhì)量[34]。

2.5 CQAs和CPPs水平的篩選

以工藝可控性較強的料液比（A）、提取次數(shù)（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）為考察因素，各因素水平見表1，采用24-1分式析因設(shè)計篩選CPPs，實驗設(shè)計見表2，每種設(shè)計組合重復(fù)2次，結(jié)果見表3。

表1 枸杞子提取工藝因素水平

表2 AOE的提取工藝24-1分式析因設(shè)計及各批次FRAP、ABTS IC50、OH·清除能力IC50、總固形物和M值

2.6 CQAs和CPPs水平的模型建立

為確立提取工藝中CQAs 和CPPs 的相關(guān)性，設(shè)計四因素三水平的Box-Behnken 試驗，因素水平見表4、結(jié)果見表5。通過Design Expert 10.0.7軟件進行擬合，得到回歸模型M值：Y1=0.031+5×10-4A-5.833×10-4B+1.667×10-4C+8.917×10-4D+5×10-4AB+5×10-4AC -1×10-3AD+1×10-3BC+7.5×10-4BD+2×10-3CD+1.642×10-3A2+1.017×10-3B2-1.608×10-3C2+7.767×10-3D2，（r=0.949 3）；總固形物：Y2=11.90+1.45A+2.85B+0.63C-0.049D-0.84AB-0.65AC-1.77AD+0.46BC-0.54BD+0.64CD-8.883×10-3A2-2.41B2-0.58C2+1.35D2（r=0.867 8，RAdj2=0.735 7）。方差分析見表6，由表6 可知D 對抗氧化能力具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1），B 對總固形物質(zhì)量具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）；BD 與CD 對抗氧化能力影響稍強，AB 與AD 對總固形物質(zhì)量影響稍強。三維響應(yīng)面圖見圖1～2。由圖1可知，隨著溫度的上升抗氧化能力上升明顯，其余參數(shù)無明顯變化。由圖2可知，隨料液比、溫度的上升固形物含量上升，當(dāng)提取次數(shù)達到一定程度時，固形物含量上升緩慢。

圖1 AOE的M三維響應(yīng)面圖

圖2 AOE總固形物質(zhì)量三維響應(yīng)面圖

表4 AOE Box-Behnken因素水平

表5 AOE Box-Behnken試驗設(shè)計

表6 AOE Box-Behnken試驗設(shè)計分析結(jié)果

2.7 設(shè)計空間的建立、優(yōu)化及驗證

通過Design Expert 10.0.7 軟件建立顯著影響因素B、D的設(shè)計空間，將優(yōu)化目標(biāo)定位總固形物質(zhì)量＞11 g（＞44%），M＞0.032。但由于模型預(yù)測值與真實值之間存在一定的誤差，可能導(dǎo)致設(shè)計空間的邊界具有不確定性，故在定義設(shè)計空間參數(shù)時加入置信水平α=0.05 的置信區(qū)間，結(jié)果應(yīng)用Overlay Plot 展示，將A 固定為高水平，在不同水平C 下的設(shè)計空間，結(jié)果見圖3?？梢钥闯觯珻在2 h設(shè)計空間的自由度最大。將2個設(shè)計空間重疊，圖4中交叉區(qū)域即為操作空間。結(jié)合實際情況選取3個操作空間內(nèi)的優(yōu)選點進行放大10倍驗證實驗，3個驗證點的選取及驗證

圖3 AOE設(shè)計空間隨提取次數(shù)和提取溫度的變化趨勢

圖4 AOE設(shè)計空間圖

注：*P＜0.05,**P＜0.01。實驗結(jié)果見表7。其中抗氧化活性測試RSD＜3%，總固形物質(zhì)量RSD＜5%。由表7可知，預(yù)測值與實際值較為接近，表明該模型的適應(yīng)性較好。

表7 AOE設(shè)計空間試驗結(jié)果驗證

3 討論

本研究以QbD 理念為基礎(chǔ)，采用信息熵理論綜合多個評價指標(biāo)，對AOE 工藝進行優(yōu)化。枸杞子中含有豐富的黃酮、類胡蘿卜素及綠原酸等物質(zhì)和多糖，由于不同工藝制備的提取物中這些天然抗氧化劑的含量不同，進而提取物表現(xiàn)出不同的抗氧化活性。因此，筆者選取FRAP測試、ABTS自由基清除能力和OH·清除能力來測試不同提取物的抗氧化活性，并通過信息熵理論對3 種抗氧化測試進行綜合評價。通過1 個指標(biāo)綜合反映提取物的M，與總固形物質(zhì)量一同作為CQAs。采用24-1分式析因設(shè)計篩選CPPs。從表3 可以看出，提取溫度對于抗氧化活性具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），料液比和提取次數(shù)對于固形物具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。因此，將料液比、提取次數(shù)、提取溫度作為CPPs。CQAs 和CPPs 之間數(shù)學(xué)模型的建立可以反映出兩者的相互關(guān)聯(lián)，揭示不同CPPs 對CQAs 所造成的影響，增強對工藝過程的理解，為之后的工藝優(yōu)化和控制策略建立提供參考。

通過Box-Behnken 設(shè)計建立CPPs 對CQAs 的數(shù)學(xué)模型，擬合出兩者之間關(guān)系的響應(yīng)面，以此描述CPPs對CQAs的影響效應(yīng)。由表5～6可知，M和總固形物質(zhì)量這兩種模型具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1，P＜0.00 1）；失擬項的P值均大于0.05，表明兩種模型均可以接受；r分別為0.949 3 和0.867 8，RAdj2分別為0.898 5 和0.735 7，表明兩種模型與數(shù)據(jù)擬合度良好。其中，提取溫度對M的影響十分顯著，其余參數(shù)并無顯著影響；提取次數(shù)對總固形物質(zhì)量具有顯著影響，而料液比與提取時間之間的交互作用對總固形物質(zhì)量的影響相對較弱。根據(jù)兩個回歸方程進行繪圖分析，由圖1～2 可知，提取溫度對應(yīng)的曲面坡度較陡，提取次數(shù)對應(yīng)的曲面坡度比較平緩，表明提取溫度對信息熵M值的影響顯著；隨著提取次數(shù)的增加，總固形物質(zhì)量增加；總固形物質(zhì)量隨料液比的增加也有所上升，而隨提取溫度變化不明顯。在析因分析和方差分析中均顯示，提取溫度對抗氧化能力有顯著性影響，提取次數(shù)對總固形物質(zhì)量有顯著影響。在枸杞子水提物中，主要成分為枸杞多糖，其次為酚類、黃酮類等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有較高的抗氧化活性；其擴散系數(shù)隨溫度升高而升高，進而使水提物的抗氧化活性增強[35-39]。有研究顯示，在料液比達到1∶20時，枸杞多糖的提取率達到最大并趨于平緩。本研究中料液比遠遠小于1∶20，枸杞多糖的溶解度比較低，而枸杞水提物中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達97.54%，因此，增加提取次數(shù)可以顯著提升總固形物的含量[39-40]。

設(shè)計空間被定義為能夠保障產(chǎn)品質(zhì)量的輸入變量和工藝參數(shù)的多維空間組合與相互作用，并不是一個固定的參數(shù)[41]。由圖3可以看出，兩者皆是在料液比為1∶8、提取時間2 h 時表現(xiàn)出最大的自由度。因此，將兩者重疊，交叉區(qū)域為同時滿足2種條件的設(shè)計空間，即圖4中交叉區(qū)域。通過放大10倍對設(shè)計空間的驗證表明，基本符合優(yōu)化目標(biāo)。設(shè)計空間的準(zhǔn)確與否取決于CQAs 和CPPs 之間的數(shù)學(xué)模型是否準(zhǔn)確，建立更加精準(zhǔn)的數(shù)學(xué)模型直接影響設(shè)計空間是否可靠。因此，選用合適的工具預(yù)測CQAs 與CPPs 在工藝過程中的質(zhì)量傳遞規(guī)律，可以構(gòu)建出更加穩(wěn)定、精確的設(shè)計空間。此外，設(shè)計空間并不是穩(wěn)定不變的，設(shè)計空間的建立是一個長期的過程，在產(chǎn)品的整個生命周期中，隨著工藝研究的不斷深入，所獲取的新的知識可被用來不斷改進設(shè)計空間[42]。

控制策略是在對當(dāng)前產(chǎn)品和過程充分理解的基礎(chǔ)上，制定出一套行之有效的控制方案，其目的是保障產(chǎn)品的質(zhì)量和性能。上述提取工藝研究表明，提取次數(shù)和提取溫度這2 個CPPs 對提取工藝有顯著性影響，對CPPs 的有效控制是保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、可控的關(guān)鍵。在提取過程中提取次數(shù)對總固形物的含量影響較大，可適當(dāng)增加提取次數(shù)來獲得較多的總固形物。圖2 表明，當(dāng)提取次數(shù)較低時，可適當(dāng)增加料液比來補償提取液中總固形物質(zhì)量的下降。而提取溫度的控制，對于制備物體外抗氧化活性的影響較為顯著，可以采用控溫性能良好的設(shè)備對溫度進行實時監(jiān)控。