鈷取代的鏈狀Strandberg結構磷鉬酸鹽的合成及其對Aβ錯誤折疊聚集過程的調節(jié)

滑繼愛衛(wèi)雪曼張 娜陳鵬舉馬 翔＊,,4

(1太原工業(yè)學院化學與化工系，太原030008)

(2海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院老年病科，上海200081)

(3太原工業(yè)學院生化藥學實驗室，太原030008)

(4南京大學配位化學國家重點實驗室，南京210023)

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)作為蛋白錯誤折疊類疾病中最為典型的代表[1]，近年來逐漸成為生物無機化學與藥物化學研究的熱點領域[2]。由淀粉樣蛋白(Aβ)錯誤折疊聚集而形成的老年斑是AD主要的病理特征[3-4]。處于非β折疊構象狀態(tài)的Aβ是大腦內一種正常代謝的膜蛋白，能夠參與特定的生理活動[5-6]。然而，當處于病理狀態(tài)時，例如腦內存在錯誤折疊的Aβ模板或者金屬離子處于紊亂狀態(tài)，Aβ可以轉化成為具有極強神經(jīng)毒性的富含β錯誤折疊的聚集體[7-10]。此外，新生的金屬-Aβ蛋白復合物能夠催化產(chǎn)生大量的活性氧物種(ROS)，而ROS也被認為是造成神經(jīng)元損傷的重要誘導物質[2,10-11]。因此，抑制Aβ的錯誤折疊聚集過程以及消除ROS被認為是治療AD的關鍵。

據(jù)報道，Aβ錯誤折疊聚集體的形成途徑是可以被調節(jié)的[12]，其中小分子化合物(如dopamine、calmidazolium chloride以及鉑類配合物等)可以抑制Aβ的纖維化[13-16]。近來，多金屬氧酸鹽(POMs)被發(fā)現(xiàn)可以用來抑制蛋白的錯誤折疊。曲曉剛教授課題組報道了一系列基于Dawson結構的Aβ聚集抑制劑[17-19]。劉杰教授也利用納米級的鉬簇成功干預了Aβ的聚集過程[20]。我們設計了一種有機無機雜化的基于Keggin結構的POM，其可以通過氫鍵等非共價作用力調控Aβ聚集體的β錯誤折疊構象，進而使聚集體瓦解[21]。然而，迄今為止，上述設計的POMs都是單功能調節(jié)劑，沒有直接的抗氧化作用。藥物化學最新觀點認為，之所以用單靶點藥物治療AD這種多病因疾病難以取得理想的療效，是因為疾病的多因子特點和細胞補償機制使單靶點作用不足以促成發(fā)病系統(tǒng)的復原[22]。因此，復合Aβ構象調節(jié)能力和抗氧化功能的分子可能會更有效地應對這些棘手的問題。

在本文中，我們將介紹一例新設計、合成的一維線狀納米尺度的鈷取代磷鉬酸鹽化合物(H2en)6{[Co(H2O)4](P2Mo5O23)}3·11H2O(簡 稱CoPM,en=乙 二胺)。據(jù)我們所知，CoPM是第一例純無機的一維鏈狀鈷取代的Strandberg結構POM，其內部還存在有趣的循環(huán)鏈節(jié)。CoPM能夠破壞Aβ聚集體的β折疊構象，并且還能夠消除其產(chǎn)生的ROS。作為概念的驗證，多功能分子CoPM為治療AD提供了一種新的思路和方法，具有較大的潛在應用價值和理論研究意義。

1 實驗部分

1.1 試劑

所用的試劑均為分析純試劑，購買后直接使用。氯化鈉(NaCl)、鹽酸(HCl)、醋酸鋅(Zn(OAc)2)、氯化銅(CuCl2)、氯化鈷(CoCl2)、十二水合磷酸氫鈉(Na2HPO4·12H2O)、en(C2H8N2)、二 水 合 鉬 酸 鈉(NaMoO4·2H2O)、人Aβ40購自麥克林化學試劑公司(中國)。硫黃素T(ThT)、2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、神經(jīng)生長因子7S(NGF-7S)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自Sigma-Aldrich試劑公司(美國)。Aβ40、Zn(OAc)2和CuCl2的儲備溶液按照文獻報道的程序進行配制[16]。所有溶液均通過Milli-Q超純水制備系統(tǒng)所制備的超純水配制，并通過0.22 μm過濾器(微孔隙)過濾。神經(jīng)元嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)來源于American Type Culture Collection(ATCC)。

1.2 合成

首先，分別制備了2種溶液A和B。溶液A：NaMoO4·2H2O(2.416 g，10.00 mmol)和Na2HPO4·12H2O(2.399 g，6.70 mmol)在攪拌下溶解在水(30 mL)中。溶 液B：CoCl2(1.300 g，10.00 mmol)和en(0.10 mL，1.49 mmol)在攪拌下溶解在水(30 mL)中。攪拌10 min后，將得到的溶液B加入到溶液A中，于室溫下再攪拌10 min，然后使用HCl(6 mol·L-1)調節(jié)pH=5.0。所得混合液在95℃下回流1 h，而后熱過濾。所得濾液置于室溫下敞口揮發(fā)。1周后，有無色透明晶體從溶液中析出，表征其結構為Strandberg結構化合物H6P2Mo5O23[23]。然后使用塑料薄膜密封燒杯，以防止溶液進一步揮發(fā)。大約3周后，無色透明晶體轉化為粉紅色晶體，晶體照片見圖S1插圖(Supporting information)，產(chǎn)率基于Na2MoO4·2H2O計算，約為25%。元素分析(C12H106Co3Mo15N12O92P6)理論值(%)：C 3.90，N 4.55，H 2.89；測試值(%)：C 3.85，N 4.48，H 2.77。

1.3 實驗方法

1.3.1 X射線衍射數(shù)據(jù)的收集與結構精修

衍射數(shù)據(jù)于296 K下，在Bruker Apex-2衍射儀CCD探測器上收集，使用MoKα射線(λ=0.071 073 nm)。使用SAINT方法進行數(shù)據(jù)運算[24]。采用了常規(guī)的洛倫茲修正和偏振校正。使用SADABS法進行多掃描吸收校正[25]。該結構采用直接方法求解，并在F2上使用全矩陣最小二乘進行細化。剩下的原子是在F2上連續(xù)的全矩陣最小二乘細化得到的并經(jīng)傅里葉合成。所有計算均使用SHELXL-97程序包運行[26]。CoPM的單晶和結構精修數(shù)據(jù)在表1中展示。

表1 CoPM的單晶和結構精修數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic and structural refinements data for CoPM

CCDC：1944799。

1.3.2 常規(guī)表征

紅外光譜使用KBr壓片在NICOLET iS10紅外光譜儀上4 000～400 cm-1范圍內掃描。元素分析由PQEXCeⅡICP-MS進行。熱重分析(TGA)在STA449F3 TG-DSC分析儀上進行。將含有或不含CoPM(200 μmol·L-1)的Aβ40(200 μmol·L-1)、D2O/H2O/DMSO-d6混合液(10∶85∶5，V/V)于37℃孵育24 h，離心得到上清液。上清液的1H NMR譜由Bruker DRX-600核磁共振譜儀測試。

1.3.3 生化實驗

ThT熒光法：將Aβ40(20 μmol·L-1)溶解在Tris緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl+150 mmol·L-1NaCl，990 μL)中并與Zn(OAc)2(4 μL，10 mmol·L-1)混合。然后分別加入CoPM(最終濃度為0～25 μmol·L-1)，并在37℃水溶液中孵育24 h。每個樣品(300 μL)被分別注入到96孔黑色板(康寧Costar公司)的一個孔中。每個孔同時加入ThT溶液(2 μL，5 mmol·L-1)，并在37℃再孵育1 h。熒光強度(λex=415 nm，λem=485 nm)由Varioskan Flash microplate reader(Thermo Scientific)記錄。數(shù)據(jù)由至少3個獨立實驗的平均值±標準差表示。

比濁度法：樣品的制備方法如上所述。每個樣品都被注入一個96孔透明板(康寧Costar公司)的孔中。記錄位于405 nm處的吸光度來反映溶液的濁度。數(shù)據(jù)以3個獨立實驗的平均值±標準差表示。

形態(tài)學分析：樣品的制備方法與ThT熒光法相同。在室溫下，在300目的碳涂層銅網(wǎng)上滴加1滴樣品溶液(10 μL)。2 min后，除去多余的溶液，并使用醋酸鈾酰(10 μL，0.01 g·mL-1)染色，然后用二次水(10 μL)洗滌。樣品在JEOL JEM-2100 LaB6(HR)透射電子顯微鏡(TEM)上進行觀測(100 kV)。

圓二色譜(CD)法：將Aβ40(20 μmol·L-1)溶解在Tris緩沖液中，并分別加入Zn(OAc)2或者CuCl2(40 μmol·L-1)。然后將CoPM(20 μmol·L-1)加入上述溶液中，在37℃下孵育24 h。樣品溶液的CD光譜在

JASCO J-810 automatic recording spectropolarimeter(日本東京)上測量，測量范圍為190～260 nm。以Tris緩沖溶液的結果為陰性對照。

ROS抑制實驗：DCFH-DA儲備液(1 mmol·L-1)和辣根過氧化物酶(HRP，4 μmol·L-1)用Tris緩沖液按照文獻方法制備[27]。將含有Aβ40(20 μmol·L-1)的溶液 與CuCl2(40 μmol·L-1)混 合，并 加 入CoPM(20 μmol·L-1)。然后，在樣品中加入抗壞血酸溶液(10 μmol·L-1)，并于37℃下孵育10 min。將以上樣品(200 μL)注入到96孔黑色板的一個孔中。然后將HRP(0.04 μmol·L-1)和DCFH-DA(100 μmol·L-1)注入孔中，并在37℃下避光孵育。熒光強度(λex=485 nm，λex=650 nm)由Varioskan Flash microplate reader(Thermo Scientific)從0到2 400 min每隔10 min測量1次。其他實驗對照組均按上述方法進行分析。

MTT法：用于測試神經(jīng)毒性和突觸功能障礙的PC12細胞如文獻方法進行培養(yǎng)[28]。分化成熟的PC12細胞與Aβ40(20 μmol·L-1)以及CoPM(20 μmol·L-1)共孵育24 h，而后采用MTT法評價CoPM對Aβ聚集體神經(jīng)毒性的抑制性效果。其他對比組均按上述方法進行分析。數(shù)據(jù)以至少3個獨立實驗的平均值±標準差表示。

細胞形態(tài)學分析：用于此形態(tài)學分析的PC12細胞如上所述制備。培養(yǎng)24 h后，用熒光倒置顯微鏡捕捉這些細胞的形態(tài)學照片。

統(tǒng)計分析方法：結果來自3個獨立的實驗，并以獨立實驗的平均值±標準差表示。結果采用雙倍方差分析(*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001)進行比較。

2 結果與討論

2.1 晶體結構

通過X射線單晶衍射對CoPM的結構進行表征分析，其鍵長數(shù)據(jù)見表S1。如圖1a所示，X射線單晶衍射結構分析顯示，CoPM是由Strandberg結構的磷鉬氧簇[P2Mo5O23]6-和鈷配合物[Co(H2O)4]2+交替連接而形成。有趣的是，CoPM并不是一個簡單的一維鏈化合物，事實上，如圖1b和1c所示，CoPM鏈的每個循環(huán)單元包含3個{[Co(H2O)4](P2Mo5O23)}4-最小結構單位，這些結構單位各自的延展方向與配位環(huán)境均不相同(見鍵價和(BVS)計算部分)，這在POM化學中是非常少見的。如圖1d所示，[P2Mo5O23]6-簇可以被認為是一個由5個接近共平面的{MoO6}八面體(Mo—O：0.169 0(9)～0.251 1(9)nm)通過共角/共邊而形成的扭曲的褶環(huán)，褶環(huán)中心上各配位了一個{PO4}四面體(P—O：0.149 3(9)～0.157 7(9)nm)。如圖1e所示，[Co(H2O)4]2+作為一個連接體通過與2個相鄰的[P2Mo5O23]6-極點位置上的P配位而形成一維無限延展結構。據(jù)我們所知，CoPM是第一例純無機一維鈷取代Strandberg型多聚磷鉬酸鹽。CoPM的紅外譜圖及熱重分析圖見圖S1和S2。

圖1 (a)CoPM的一維鏈狀結構多面體示意圖;(b)CoPM最小循環(huán)單元多面體結構示意圖;(c)CoPM最小循環(huán)單元球棍結構示意圖;(d)[P2Mo5O23]6-多面體結構示意圖;(e)CoPM中鈷離子的配位環(huán)境示意圖Fig.1(a)Combined polyhedral/ball-and-stick view of the 1D linear structure of CoPM;(b)Polyhedral view of one CoPM subunit in the crystal;(c)Ball-and-stick representation of one CoPM subunit in the crystal;(d)Polyhedral view of one[P2Mo5O23]6-;(e)Polyhedral view of the coordination mode of Co ions in CoPM

根據(jù)文獻報道的方法，我們進一步計算了CoPM中Co和P的氧化態(tài)(Vi)[29]。簡單地說，CoPM中陽離子i的氧化態(tài)計算公式如下：

其中sij表示陽離子i和陰離子j之間的鍵價，rij表示表S1中列出的實測鍵長，而r0′則表示2個離子間鍵長的理論值，B設定為0.37[29]。Mo—O鍵長的理論值來自于文獻，其中的r0′(Mo6+—O)和r0′(Mo5+—O)分別為0.191 5和0.184 8 nm，r0′(P5+—O)為0.162 4 nm,r0′(Co2+—O)為0.169 2 nm[29-30]。如表S2所示，CoPM中Co和P的Vi分別為2.019和4.955。此外，每個Strandberg結構磷鉬氧簇由一個Mo5+和4個Mo6+構成。

目前，基于POMs的不同結構，其與Aβ相互作用的分子作用機制可概括為2種類型：第1類即通過POMs上的過渡金屬離子(例如鈷離子[18]、鎘離子[31])與Aβ上咪唑基團直接發(fā)生配位作用，進而影響Aβ的聚集。第2類即POMs通過其富氧表面[21]或靜電作用[20,32]干預構成β折疊所必需的Aβ之間氫鍵的形成，進而影響其聚集過程。CoPM的分子設計同時滿足上述2種作用模式所需的結構基礎。

首先，CoPM的鏈節(jié)中含有大量鈷離子，這些鈷離子與構筑塊上的2個氧原子及4個配位水形成較為穩(wěn)定的六配位八面體構型。當與咪唑基相遇時，根據(jù)軟硬酸堿理論可知，配位能力稍弱的水分子會被咪唑基團取代，從而使得鈷離子與Aβ形成更穩(wěn)定的配合物[18]。因此，我們使用核磁共振譜研究了CoPM孵育后Aβ聚集體的咪唑基信號。如圖2a所示，位于δ=6.8、7.5和8.0處的幾組峰對應于Aβ上咪唑殘基的3個氫的核磁信號[16]。然而，如圖2b所示，在與CoPM共孵育后，1H NMR信號發(fā)生了很大的變化，這表明Aβ上的咪唑基團的化學環(huán)境受到了較大的影響，尤其是3號位的氫幾乎消失，說明CoPM與Aβ間存在配位作用。

圖2 Aβ40(a)及其與CoPM在37℃和pH 7.4條件下共孵育(b)24 h后的1H NMR譜圖Fig.2 1H NMR spectra of Aβ40 in the absence(a)and presence(b)of CoPM after incubation at 37℃and pH 7.4 for 24 h

其次，作為純無機POMs，CoPM的構筑塊具有很高的負電荷和豐富的表面氧原子[33]。CoPM中的70個氧原子可分為端氧Ot、二重橋氧Oμ2、三重橋氧Oμ3和四重橋氧Oμ4。如圖3所示，BVS為0～1.60之間的O原子可以作為質子供體；而BVS為1.90～2.00之間的O原子具有比較密集的電子云，可以作為質子的受體。因此，CoPM表面的O原子可以與其他質子供體或者受體(例如蛋白等)相互作用形成氫鍵。一般來說，POMs構筑塊上會有離域的質子附著，這種現(xiàn)象在POM化學中很常見，在許多文獻中均有報道，例如[H3W12O40]5-[33]和[Ni(enMe)2]3[H6Ni20P4W34(OH)4O136(enMe)8(H2O)6]·12H2O[34]。

圖3 CoPM最小重復單元中O的BVSFig.3 BVS of O atoms in the CoPM unit

此外，CoPM的BVS計算也表明，其最小重復單元內的3個基本單元所處的配位環(huán)境均不相同，有著不同的BVS。

2.2 Aβ錯誤折疊的抑制作用

由于Zn2+可以有效地誘導Aβ錯誤折疊聚集過程，因此，我們通過比濁度法和ThT熒光法研究CoPM對Zn2+誘導的Aβ的β折疊形成的抑制作用。濁度可反映溶液中所有類型蛋白聚集體的整體水平；ThT熒光法被廣泛用于檢測這些聚集體中的β折疊體的含量[35]。首先，Aβ與Zn2+共孵育而獲得富含各種聚集體的懸濁液。然后，在這些懸濁液中加入不同濃度的CoPM，孵育1 d，以測試其對已形成的β折疊構象的影響。如圖4所示，隨著CoPM濃度的增加，ThT熒光急劇下降，這表明Aβ的錯誤折疊聚集過程被逆轉了。另一方面，這些溶液的濁度也在某種程度上隨著CoPM的加入而降低。考慮到CoPM對β折疊聚集體的綜合影響，我們選擇20 μmol·L-1進行后面的實驗。

圖4 一系列濃度梯度的CoPM對Zn2+誘導的Aβ40錯誤折疊聚集體的干預效果：比濁法(左,柱狀圖)和ThT熒光法(右,線狀圖,λex=415 nm,λem=480 nm)Fig.4 Intervention effect of a series of concentration gradients of CoPM on Zn2+-induced Aβ40 misfolded aggregates：turbidimetry(left,histogram)and ThT assay(right,line graph,λex=415 nm,λem=480 nm)

2.3 形態(tài)學分析

接下來，我們使用TEM觀察CoPM對Zn2+、Cu2+以及自聚集誘導的Aβ錯誤折疊聚集體微觀形態(tài)的影響。如圖5a～5c所示，在各種誘導因素存在的情況下，與對照組相對照，這些溶液中均出現(xiàn)了纖維絲狀的蛋白聚集體，這是富含β錯誤折疊蛋白構象的典型特征[35]。這些結果可以印證，在上述條件下，孵育液中存在著大量的富含β折疊構象的Aβ聚集體。然而，如圖5d～5f所示，在CoPM存在下，沒有纖維絲狀物質出現(xiàn)，取而代之的是一些類似油狀印記的無定形態(tài)物質。

圖5 CoPM對各種因素誘導形成的Aβ40(20 μmol·L-1)聚集體影響的TEM圖Fig.5 TEM images for the effect of CoPM on Aβ40(20 μmol·L-1)aggregates induced by various factors

2.4 Aβ構象調節(jié)

進一步，我們利用CD譜驗證CoPM對Zn2+、Cu2+以及自聚集誘導的Aβ錯誤折疊體構象的影響。如圖6所示，Aβ40與Cu2+共孵育后，在約215 nm處檢測到一個負峰，表明Cu2+誘導形成了β折疊構象[32]。用Zn2+孵育后的Aβ?lián)碛幸粋€較Aβ40+Cu2+組更強的CD譜峰。這表明，Zn2+誘導效應更加強烈。而在CoPM存在下，無論是Zn2+還是Cu2+孵育組，這個CD譜峰都出現(xiàn)了明顯的衰退。這說明CoPM可以抑制金屬離子誘導的Aβ的β折疊相關構象轉化。此外，CoPM處理的Aβ40組的負CD譜峰也比單獨的Aβ40弱，這可能意味著CoPM也可以抑制Aβ的自聚集。目前，大多數(shù)報道的單功能螯合劑只能防止金屬離子誘導的構象錯誤折疊，而不能與Aβ本身相互作用，因此對Aβ的自聚集束手無策[36]。以上結果表明，CoPM是通過調節(jié)β折疊構象而非螯合機制起作用的。

圖6 CoPM對各種因素誘導形成的Aβ40聚集體構象影響的CD譜圖Fig.6 CD spectra for the effect of CoPM on the conformation of Aβ40 aggregates induced by various factors

2.5 抑制ROS的產(chǎn)生

ROS是導致AD的另一個關鍵神經(jīng)毒性物種[2]。Cu2+-Aβ復合物能夠有效地催化ROS的產(chǎn)生，并對神經(jīng)元造成損傷[37]。因此，我們使用2′，7′-二氯熒光素(DCF)熒光法檢測CoPM對Cu2+介導的ROS生成的抑制作用。DCFH-DA本身沒有熒光，它可以在HRP存在下與ROS反應，生成具有熒光的物質DCF。因此，體系中DCF熒光的強弱可以揭示Cu2+-Aβ復合物誘導產(chǎn)生的ROS的總量[38]。如圖7所示，從始至終，CoPM與Cu2+-Aβ復合物共孵育組的DCF熒光強度明顯低于Cu2+-Aβ復合物對照組，這表明含有CoPM組的ROS總產(chǎn)量遠遠低于無CoPM組的ROS產(chǎn)出量。此結果說明CoPM可以有效地抑制體系中ROS的生成[39]。

圖7 ZnPM、Cu2++Aβ、Cu2++Aβ+CoPM、CM、CoPM與純水孵育組和對照組的DCF熒光強度隨時間的變化曲線Fig.7 Variation curves of DCF fluorescence intensity with time for ZnPM,Cu2++Aβ,Cu2++Aβ+CoPM,CM,CoPM,and pure water incubation group and control group

以往文獻中報道，某些構象調節(jié)劑也可以通過瓦解Cu2+-Aβ復合物而減少其ROS的產(chǎn)生，但其本身并無抗氧化作用[32]。因此，CoPM是通過瓦解能產(chǎn)生ROS的聚集體而抑制體系產(chǎn)生ROS，還是本身具備抗氧化性？這需要驗證。如圖7中插圖所示，單獨使用CoPM的實驗組產(chǎn)生的ROS明顯減少，甚至低于環(huán)境對照組。然而，同構型的鋅取代的多金屬氧酸鹽(H2en)6{[Zn(H2O)4](P2Mo5O23)}3(ZnPM)則能夠產(chǎn)生大量的ROS[40]。以上實驗結果揭示，CoPM的結構并不影響實驗組HRP的活性，并且CoPM本身即具有抗氧化功能。有趣的是，鉬酸鈷(CM)也在一定程度上具有抗氧化能力。而CoPM的抗氧化作用優(yōu)于CM，這說明CoPM獨特的結構使其具有更強的抗氧化能力。綜上，與以往文獻報道的單功能螯合劑和調節(jié)劑相比，CoPM抑制ROS的機制是不同的[41]。一方面，CoPM可以像單功能螯合劑或者調節(jié)劑一樣通過解聚Cu2+-Aβ復合物來減少ROS的產(chǎn)生[41]；另一方面，CoPM自身就具有抗氧化特性，能夠將環(huán)境中的ROS清除。據(jù)我們所知，CoPM是首例同時具有錯誤折疊構象調節(jié)和抗氧化多功能的POM，這將拓展POM在抗蛋白錯誤折疊疾病中的應用。

2.6 細胞毒性的抑制

我們以常用的PC12細胞為模型[42]通過MTT實驗研究CoPM對Aβ40和金屬離子誘導的Aβ40聚集體細胞毒性的抑制作用。如圖8所示，PC12細胞在Zn2+/Cu2+處理的Aβ40環(huán)境下孵育后，其存活率相當?shù)?小于40%或30%)，這也與文獻報道一致，并提示這些Zn2+/Cu2+處理過的Aβ40聚集體對PC12細胞具有相當高的毒性[43]。相比之下，在CoPM存在下，相應的PC12細胞存活率達到約60%。此外，與單純Aβ40孵育組相比，有CoPM的Aβ40孵育組的細胞存活率將近70%。在以往的研究中，大多數(shù)單功能螯合劑只能通過競爭金屬離子而抑制它們對Aβ錯誤折疊的誘導作用，而螯合劑本身并不能與Aβ產(chǎn)生相互作用。因此，這些單功能螯合劑對Aβ自聚集體沒有影響，屬于間接作用機制[44-45]。而以上結果表明，CoPM不但可以抑制由金屬離子誘導而產(chǎn)生的Aβ錯誤折疊聚集體的神經(jīng)毒性；還能夠直接作用于Aβ自聚集本身，削弱它們的細胞毒性，這也是CoPM與以前的抗AD螯合劑之間的最為顯著的功能差異。

圖8 MTT法檢測CoPM對各種因素誘導產(chǎn)生的Aβ聚集體的細胞毒性抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of CoPM on the cytotoxicity of Aβ aggregates induced by various factors by MTT assay

接下來，我們通過觀察PC12細胞形態(tài)學變化，進一步研究CoPM對Aβ40自聚集和金屬離子誘導的Aβ40錯誤折疊聚集體的細胞毒性的抑制。如圖9所示，PC12細胞(對照組)呈多邊形，其中大多數(shù)細胞有厚而長的突觸，并與其他細胞連接而形成網(wǎng)絡。在與Zn2+/Cu2+誘導或自聚集的Aβ錯誤折疊聚集體孵育24 h后，PC12細胞呈現(xiàn)出球形，神經(jīng)突觸收縮，神經(jīng)元的樹突狀網(wǎng)絡被破壞(圖9a、9c和9e)。特別是與Aβ40+Cu2+孵育組，其神經(jīng)元上的突觸斷裂，細胞體開始膨脹并變成球形。與之相對，在CoPM存在的情況下，盡管仍有淀粉樣斑塊的沉積，但PC12的細胞形態(tài)盡可能保持完整(圖9b、9d和9f)，并且細胞體增大的趨勢也受到了抑制。細胞體多為梭形，突觸清晰可見。此外，神經(jīng)元的突觸網(wǎng)絡也被保留了下來。有研究報道，Aβ可以誘導產(chǎn)生突觸毒性，導致神經(jīng)元突觸的損傷和功能障礙，因此對突觸的保護在抗AD中也是非常重要的內容[46]。以上結果表明，CoPM可以保護神經(jīng)元，減輕Zn2+/Cu2+誘導或自聚集產(chǎn)生的Aβ錯誤折疊聚集體的毒害。

圖9 CoPM對各種因素誘導產(chǎn)生的Aβ聚集體的細胞毒性抑制作用的細胞顯微照片F(xiàn)ig.9 Cell micrographs of the cytotoxic inhibitory effect of CoPM on Aβ aggregates induced by various factors

3 結論

淀粉樣蛋白(Aβ)的聚集在阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機制中起著關鍵作用。β折疊構象是這些具有細胞毒性物質的核心結構。此外，由這些有害聚集體所產(chǎn)生的活性氧物種(ROS)是另一個重要的神經(jīng)退行性因子。本文介紹了一例納米線狀鈷取代的多聚磷鉬酸鹽(H2en)6{[Co(H2O)4](P2Mo5O23)}3·11H2O(CoPM)，它復合了構象調節(jié)和抗氧化雙功能。一方面，CoPM作為一種構象調制劑，不但可以抑制由金屬離子誘導產(chǎn)生的富含β錯誤折疊的Aβ聚集體；還能夠抑制Aβ的自聚集；另一方面，CoPM作為一種抗氧化劑，能有效抑制和消除Cu2+-Aβ復合物所產(chǎn)生的ROS。因此，CoPM可以保護神經(jīng)元，減輕錯誤折疊的Aβ聚集體和ROS等相關神經(jīng)毒性物種的侵害。

還有許多疾病，如帕金森病、亨廷頓病、2型糖尿病、克-雅病和新變異型克-雅病，也是蛋白質錯誤折疊類疾病[47-48]。其致病過程是相似的，即將蛋白質的構象轉化為疏水的β錯誤折疊結構，大量錯誤折疊的蛋白質和由其產(chǎn)生的ROS破壞大腦細胞和組織。由于大多數(shù)該類疾病是多病因的，均涉及蛋白質錯誤折疊和ROS氧化應激[48]，因此，CoPM的復合多功能設計思路亦有可能應用于抗其他蛋白錯誤折疊疾病藥物的開發(fā)[5,48]。Supporting information is available at http：//www.wjhxxb.cn