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    2-脫氧葡萄糖聯(lián)合奧希替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975耐藥性、糖酵解水平表達(dá)和增殖活性的影響*

    2022-10-10 14:47:06胡海峰雒小佳
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床 2022年19期
    關(guān)鍵詞:奧希替尼糖酵解稀釋液

    胡海峰,雒小佳

    延安大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科二病區(qū),陜西延安 716000

    肺癌是我國(guó)發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌患者的80%,約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期,5年生存率很低,患者生存時(shí)間和生活質(zhì)量亟待提高[2-4]。奧希替尼在國(guó)內(nèi)獲批的適應(yīng)證是既往使用表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療時(shí)或治療后出現(xiàn)疾病進(jìn)展,并且經(jīng)檢驗(yàn)確認(rèn)存在EGFR T790M 突變陽(yáng)性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性成人NSCLC[5]。奧希替尼已經(jīng)成為各大指南推薦的首選靶向藥,可延長(zhǎng)肺癌患者生存時(shí)間[6]。但是奧希替尼也存在腫瘤耐藥的問題,一旦出現(xiàn)腫瘤耐藥,奧希替尼的療效就明顯下降,肺癌開始加重。2-脫氧葡萄糖是天然抗代謝物類抗菌藥物,具有能夠抑制病毒感染、酵母發(fā)酵、病菌及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生理藥理效應(yīng)[7],具有抗病毒、抗菌、抗癌、抗癲癇、抗衰老等作用,用于預(yù)防病毒及病原菌感染等,可防治單純皰疹病毒(HSV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒等病原菌引起的傳染病,主要用于各種畜禽病毒病、免疫抑制病的預(yù)防和治療,也可用于細(xì)菌及支原體感染的輔助治療,在醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景[8]。因此,本研究探討2-脫氧葡萄糖聯(lián)合奧希替尼對(duì)NSCLC細(xì)胞株H1975耐藥性、糖酵解水平表達(dá)情況的影響。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 將NSCLC細(xì)胞株H1975(美國(guó)國(guó)家細(xì)胞庫(kù))經(jīng)過體外誘導(dǎo)處理48 h后,37 ℃,建立奧希替尼(0.5 μmol/L)繼發(fā)性耐藥NSCLC細(xì)胞株H1975-OR[9]。

    1.2方法 用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)藥物處理后的細(xì)胞凋亡率,評(píng)估藥物的促凋亡能力。

    1.2.1MTT 法檢測(cè)不同細(xì)胞對(duì)奧希替尼的敏感性[10](1)MTT 溶液的配制方法:通常,此法中的MTT水平為5 mg/mL。因此,可以稱取MTT 0.5 g,溶于100 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)或無酚紅的培養(yǎng)基中,用0.22 μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌,放置于4 ℃避光保存即可。在配制和保存的過程中,容器最好用鋁箔紙包住。(2)配制MTT時(shí)用PBS(pH=7.4)溶解。(3)PBS配方:NaCl 8 g,KCl 0.2 g,Na2HPO41.44 g,KH2PO40.24 g調(diào)pH為7.4,定容1 μL。(4)收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,每孔加入100 μL,鋪板使待測(cè)細(xì)胞密度調(diào)整為1 000~10 000/孔。(5)5%的CO2,37 ℃孵育,至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物。一般5~7個(gè)梯度,每孔100 μL,設(shè)3~5個(gè)復(fù)孔。(6)5%的CO2,37 ℃孵育16~48 h,倒置顯微鏡下觀察。(7)每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL,即0.5% MTT),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng),可先離心后棄去培養(yǎng)液,小心用PBS沖2~3遍后,再加入含MTT的培養(yǎng)液。(8)終止培養(yǎng),小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。(9)每孔加入100 μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量各孔的吸光度(A)值。(10)同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜),對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。細(xì)胞存活率=藥物處理組A值/對(duì)照組A值×100%。

    1.2.2siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染[11](1)提前1 d將細(xì)胞種植在24孔板中,以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度在30%左右為宜,轉(zhuǎn)染前全培養(yǎng)基總量為0.45 mL。(2)取0.67 g(50 pmol)的siRNA,加入一定量無血清稀釋液,充分混勻,制成RNA稀釋液,終體積為25 μL。注意:無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM、無血清DMEM或1640培養(yǎng)基。(3)取1 L的EntransterTM-R4000,然后加入24 μL無血清稀釋液體,充分混勻,制成EntransterTM-R4000稀釋液,終體積為25 μL。室溫靜置5 min。(4)將EntransterTM-R4000稀釋液和RNA稀釋液充分混合(可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上)混合,室溫靜置15 min。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成。(5)將50 L轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴入0.45 mL全培養(yǎng)基(可含10%血清和抗菌藥物)的細(xì)胞上,前后移動(dòng)培養(yǎng)皿,混合均勻。注意:采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率。(6)轉(zhuǎn)染后6 h觀察細(xì)胞狀態(tài),如狀態(tài)良好可不必更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24~96 h得到結(jié)果。

    1.2.3糖酵解水平的檢測(cè) 采用比色法檢測(cè)細(xì)胞外乳酸濃度。將細(xì)胞株H1975-OR、細(xì)胞株H1975接種于96孔板(104/孔,100 μL),待細(xì)胞貼壁后加入奧希替尼處理48 h。收集細(xì)胞和培養(yǎng)基,參照試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測(cè)培養(yǎng)基中的乳酸濃度。

    1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的耐藥性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞株H1975-OR、細(xì)胞株H1975單細(xì)胞懸液接種于96孔板,3×103/孔;培養(yǎng)24 h后,加入含相應(yīng)濃度奧希替尼的培養(yǎng)液每孔200 μL,每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔;繼續(xù)培養(yǎng)72 h,仔細(xì)吸棄各孔培養(yǎng)液,每孔加入RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL和CCK-8試劑10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)1 h;在酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)儀上于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的A值,采用Graphpad Prism 6.0軟件計(jì)算各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

    2 結(jié) 果

    2.1細(xì)胞株H1975-OR與細(xì)胞株H1975對(duì)奧希替尼的敏感性 細(xì)胞株H1975-OR對(duì)奧希替尼的敏感性為(0.95±0.18)μmol/L,低于細(xì)胞株H1975的(6.99±1.88)μmol/L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2奧希替尼對(duì)細(xì)胞株H1975-OR和細(xì)胞株H1975增殖活性的影響 采用同一水平的奧希替尼(3 μmol/L)處理細(xì)胞株H1975-OR和細(xì)胞株H1975,細(xì)胞株H1975-OR增殖活性被抑制程度低于細(xì)胞株H1975。見圖1。

    圖1 細(xì)胞株H1975-OR和細(xì)胞株H1975在奧希替尼作用后的細(xì)胞存活曲線

    2.3細(xì)胞株H1975-OR與細(xì)胞株H1975糖酵解水平比較 細(xì)胞株H1975-OR的糖酵解水平為(20.87±0.86)mmol/L,低于細(xì)胞株H1975的(25.93±2.94)mmol/L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.42-脫氧葡萄糖可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞株H1975-OR對(duì)奧希替尼的耐藥性 當(dāng)2-脫氧葡萄糖的水平為4 mmol/L時(shí),細(xì)胞株H1975-OR對(duì)奧希替尼的IC50值為(1.39±0.11)μmol/L,與奧希替尼敏感細(xì)胞株H1975的(1.01±0.19)μmol/L相似。

    2.5奧希替尼對(duì)細(xì)胞株H1975-OR抗增殖效果 細(xì)胞株H1975-OR的細(xì)胞存活率如下:G1期,(0.046±0.020)%;G2期,(0.178±0.028)%;G3期,(0.395±0.082)%;G4期,(0.724±0.048)%。

    3 討 論

    自工業(yè)時(shí)代以來,肺癌的發(fā)病率和病死率逐年上升,且速度極為驚人。肺癌是目前中國(guó)惡性腫瘤中病死率最高的一種癌癥[12]。NSCLC相對(duì)于小細(xì)胞肺癌,發(fā)病慢,癌癥的擴(kuò)散速度較慢,但是一般發(fā)現(xiàn)即是晚期,非常難以控制和治療?;颊咴谠缙诔霈F(xiàn)肺部癥狀時(shí),就應(yīng)該及時(shí)就醫(yī),以提前預(yù)防和干預(yù)治療[13-14]。NSCLC主要包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞肺癌,與小細(xì)胞癌相比,癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂較慢、擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚。根據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,大多數(shù)的患者在發(fā)現(xiàn)的時(shí)候就已處于中晚期,治療相對(duì)不易,存活率也不高[15]。NSCLC的發(fā)病原因主要有吸煙、職業(yè)暴露所致、環(huán)境接觸、電離輻射、既往肺部慢性感染、遺傳等因素,其中吸煙是肺癌成因中最重要的一種因素,因?yàn)橄銦熤泻写罅繉?duì)肺部有害的物質(zhì),長(zhǎng)期吸煙,對(duì)肺部的損傷是不可逆的??傊?,NSCLC由于病情發(fā)展較慢,較容易延誤治療,患者在出現(xiàn)早期疑似癥狀的時(shí)候,就應(yīng)該及時(shí)去正規(guī)醫(yī)院進(jìn)行診斷,通過X線檢查、支氣管鏡檢查、細(xì)胞學(xué)檢查等現(xiàn)代醫(yī)療手段,進(jìn)行確診,如果確定是肺癌,也要保持積極樂觀的心態(tài),進(jìn)行治療干預(yù),防止病情的進(jìn)一步惡化[16]。

    目前隨著多項(xiàng)臨床研究的開展,奧希替尼已被推薦用于肺癌的一線治療。在對(duì)奧希替尼耐藥的患者進(jìn)行的基因檢測(cè)中,H1975繼發(fā)突變是常見的耐藥突變,占15%~20%[17-18]。分順式突變和反式突變,多以順式突變?yōu)橹?。但奧希替尼是一種靶向藥物,該藥耐藥之后如何用藥對(duì)于患者至關(guān)重要,因此本研究探討2-脫氧葡萄糖聯(lián)合奧希替尼對(duì)NSCLC患者細(xì)胞株H1975耐藥性、糖酵解水平的影響[19]。

    2-脫氧葡萄糖的一種衍生物是一種抗代謝物,也是正粘病毒、副粘病毒及皰疹病毒囊膜的重要組成成分,具有干擾病毒特異性糖蛋白的合成,有效抑制皰疹單病毒、RNA和DNA包膜病毒、乳腺癌細(xì)胞增殖等功效。

    本研究結(jié)果顯示,細(xì)胞株H1975-OR對(duì)奧希替尼的敏感性為(0.95±0.18)μmol/L,低于細(xì)胞株H1975的(6.99±1.88)μmol/L(P<0.05)。細(xì)胞株H1975-OR的糖酵解水平為(20.87±0.86)mmol/L,低于細(xì)胞株H1975的(25.93±2.94)mmol/L(P<0.05)。當(dāng)2-脫氧葡萄糖水平為4 mmol/L時(shí),細(xì)胞株H1975-OR對(duì)奧希替尼的IC50值為(1.39±0.11)μmol/L,接近奧希替尼敏感細(xì)胞株H1975的(1.01±0.19)μmol/L。奧希替尼對(duì)細(xì)胞株H1975-OR作用后,細(xì)胞存活率如下:G1期,(0.046±0.020)%;G2期,(0.178±0.028)%;G3期,(0.395±0.082)%;G4期,(0.724±0.048)%。

    綜上所述,2-脫氧葡萄糖逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞對(duì)奧希替尼的繼發(fā)性耐藥,其機(jī)制與抑制細(xì)胞糖酵解進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡增加有關(guān)。

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