Herpud1在盆底肌萎縮模型中的表達研究

肖雅，洪莉，閔潔，湯劍明，李素廷，陳茂，黃筱雨

女性盆底功能障礙(pelvic floor dysfunction，PFD)是由于盆底支持組織薄弱而引起的一系列病癥，包括壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)、盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)、肛門失禁、下尿路感覺異常、排便功能障礙以及與盆腔器官相關的慢性疼痛綜合征等[1]。陰道分娩和衰老是PFD的重要危險因素，據(jù)統(tǒng)計，50%的產(chǎn)婦有不同程度的SUI和POP，且發(fā)病率隨著年齡的增長而增加[2]。已有研究表明，陰道分娩可能通過損害骨盆支持組織，如肌肉、結締組織和神經(jīng)結構，導致PFD[3]。經(jīng)陰道分娩后，POP、SUI和膀胱過度活動癥的累積發(fā)生率與盆腔肌肉力量相關[4]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)多次陰道分娩小鼠盆底肌中T 型鈣離子通道(TH)編碼基因CACNA1H特異性降低，敲除小鼠CACNA1H基因(Cacna1h-/-)后出現(xiàn)多部位肌肉萎縮和肌肉功能下降，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 (endoplasmic reticulum stress，ERS) 激活。 ERS可能是該疾病潛在的治療靶點[5]。

未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)是一種細胞應激反應系統(tǒng)，當未折疊或錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管腔內(nèi)積聚時被激活，從而導致ERS[6]。這一機制的最終目標是通過減少蛋白質(zhì)翻譯、增加蛋白質(zhì)降解和提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力來恢復細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。越來越多的證據(jù)表明，這一過程與肌肉萎縮的調(diào)節(jié)有關，而參與UPR的各種因素也被證明促進了肌肉萎縮[7]。同型半胱氨酸誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(Herpud1)是一種54 kDa的跨膜蛋白，定位于ER膜上，是一種應激反應蛋白[8]。早期研究證明Herpud1在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)線粒體功能方面起著重要作用[9]。Herpud1的誘導不僅提高了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力，減輕了蛋白質(zhì)超載，還參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關降解(ER-associated degradation，ERAD)多蛋白復合物的形成，有助于穩(wěn)定復合物并促進未折疊蛋白的有效降解，可以阻止ERS引發(fā)的細胞凋亡[9-10]。Herpud1在應激條件下通過穩(wěn)定依賴于三磷酸肌醇受體(IP3R)的Ca2+信號來保護細胞免于死亡[11]。Nogalska A等[12]的研究表明Herpud1在散發(fā)性包涵體肌炎中的誘導可以作為一種代償機制，以改善受影響肌肉纖維的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能；敲除Herpud1的小鼠表現(xiàn)出對葡萄糖負荷的不耐受，并且降低了胰島素依賴性葡萄糖攝取、GLUT4 易位至質(zhì)膜[13]，這可能與肌肉的萎縮相關。綜上，Herpud1可能通過提高骨骼肌在應激環(huán)境下的耐受能力來保護肌纖維免受損傷，目前尚無Herpud1在PFD發(fā)病機制中的相關研究。本研究旨在探討Herpud1在盆底肌萎縮模型與正常小鼠中的表達差異，為進一步探究其在PFD發(fā)病機制中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 小鼠的飼養(yǎng)和實驗按照武漢大學的機構指南和規(guī)定進行。所有涉及動物的操作均經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院機構動物保護利用委員會批準。野生型雌性C57BL/6J小鼠(WT組)購自武漢大學動物實驗中心，Cacna1h-/-小鼠(TH-null組)購自杰克遜實驗室(Stock 013770；Bar Harbor,ME,USA)。分別各取10只4月齡未生產(chǎn)過的兩種類型小鼠，體重20～23 g，平均(21.5±1.5) g。兩組小鼠的周齡及體重比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.1.2 實驗細胞及處理 小鼠C2C12成肌細胞購自南京科佰生物科技有限公司。C2C12小鼠成肌細胞增殖培養(yǎng)采用高糖(4.5 g /L) (DMEM)生長培養(yǎng)基(GM)，含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素。當細胞密度達90%左右時轉入分化培養(yǎng)基(DMEM+2%馬血清，1%青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)4 d，NNC 55-0396(Sigma-Aldrich)干預24 h、48 h。

1.1.3 主要試劑和儀器 抗Herpud1抗體(Abcam)；免疫組化試劑盒、肌肉組織固定液(武漢賽維爾生物科技有限公司)；BCA 蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；蛋白上緩沖液(谷歌生物技術有限公司)；正置熒光顯微鏡(日本，Olympus)；ChemiDoc成像系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，Inc.)；尿動力學檢查儀為Power lab 多導電生理記錄儀；微量注射泵(長沙健源醫(yī)療科技有限公司，JZB-1800D 型)。

1.2 方法

1.2.1 尿動力學檢測 采用1.5%異氟烷對小鼠進行氣體麻醉后取仰臥位固定。將小兒留置針去除針芯，注射生理鹽水排氣，丁卡因膠漿潤滑表面后行小鼠導尿。導尿手法為:一手拿顯微鑷，鉗夾尿道外口，向上提起以繃直尿道，另一手拿留置針輕輕插入尿道，進針約1～1.2 cm。導尿成功后，空針抽吸排空小鼠膀胱，連接延長管及三通，三通外接測壓管和微量注射泵。管道連接成功后體內(nèi)置零，然后開啟微量注射泵向膀胱內(nèi)灌注生理鹽水，泵水速度為 1 mL/h。觀察膀胱壓力變化，同時檢查小鼠有無尿液溢出，此時的壓力為膀胱漏尿點壓(bladder leak point pressures，BLPP)。以尿道口出現(xiàn)第1滴液體為準，記錄當時的膀胱容量和膀胱內(nèi)壓分別為最大膀胱容量(MBC)和BLPP。重復上述實驗 3 次。檢測完畢后，用碘伏消毒尿道外口。

1.2.2 盆底肌取材 采用斷椎法處死小鼠后，打開盆腔，暴露盆底，分離筋膜與脂肪組織，取盆底肛提肌組織沿中線分成兩塊，約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，反復、多次用生理鹽水沖洗，一塊采用肌肉固定液固定標本，常規(guī)石蠟包埋、切片;另一塊快速放入-80℃冰箱中低溫保存。

1.2.3 免疫組織化學染色 按免疫組化試劑盒說明進行相關操作。切片在 60℃ 加熱 30 min 抗原修復，用分級醇系脫蠟再水化，一抗按照1∶100 比例稀釋。光鏡下觀察，細胞漿或胞膜中有棕色顆粒為陽性表達。免疫活性用積分光密度(IOD)值量化，平均密度用ImagePro Plus 6.0版本軟件通過高分辨攝取圖像信號，測定灰度值，用平均灰度值表示Herpud1蛋白的表達強弱，平均密度=IOD/面積。

1.2.4 Western blot檢測 取小鼠盆底肌組織液氮研磨后加入蛋白裂解液，充分混勻后4℃、12 000 r /min離心5 min，取上清，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品的蛋白濃度，加入適量5×蛋白上樣緩沖液后煮沸8 min使蛋白變性，使用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本，然后將凝膠上分離的蛋白電轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗Herpud1抗體(1∶3 000稀釋)4℃孵育過夜，PBS漂洗3遍后，二抗室溫孵1h，再次PBS漂洗3遍。用增強的化學發(fā)光底物處理免疫反應帶，并使用ChemiDoc成像系統(tǒng)進行分析，實驗獨立重復3次以上。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組小鼠尿動力學檢測結果

盆底肌肉支撐膀胱或尿道并控制膀胱頸過度活動，盆底肌薄弱或受損可能導致SUI[14-15]。因此，我們檢測了野生型和盆底肌萎縮模型小鼠的尿動力學，可用來間接評估盆底肌功能。尿動力學檢測顯示：與WT組相比，TH-null組小鼠的BLPP值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；MBC測定顯示，與WT組相比，TH-null組的MBC值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)。這提示T型鈣通道敲除小鼠(TH-null)出現(xiàn)盆底肌支持功能下降。詳見表1和圖1。

注：A：MBC統(tǒng)計分析；B ：BLPP統(tǒng)計分析(****與WT組比較，P<0.0001)。

表1 兩組小鼠尿動力學檢測值

2.2 兩組小鼠盆底肌中Herpud1蛋白水平表達情況

Western-blot檢測結果顯示，TH-null組小鼠較WT組Herpud1表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見下頁圖2A和2B。免疫組化結果顯示，與前期研究結果一致[14-15]，通過顯微鏡觀察可見到TH-null組肌纖維面積較WT組小鼠更細小，且TH-null組免疫化學活性也同樣明顯低于WT組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見下頁圖2C和2D。

2.3 NNC處理后Herpud1表達變化

本團隊前期研究表明T型鈣離子通道抑制劑NNC處理以時間和濃度梯度的方式促進C2C12細胞的肌管萎縮與凋亡[5]。具體表現(xiàn)為MYHC免疫熒光染色肌管數(shù)目變少，直徑變小，萎縮相關指標表達增高。因此接下來，本研究中C2C12分化4 d后予以NNC處理24 h和48 h，檢測細胞Herpud1蛋白表達水平變化。結果顯示NNC以時間梯度的方式抑制Herpud1的表達。見圖3。

3 討論

PFD是一組普遍且令人痛苦的疾病，它導致膀胱、子宮陰道穹窿和直腸異常下降，包括尿失禁、大便失禁和POP等。作為老年女性的一個主要健康問題，POP和尿失禁接受單次手術的終生風險為11.1%，并且再次手術的比例很大[16]。PFD的生理病理機制復雜，有許多危險因素，其中妊娠和陰道分娩作為PFD發(fā)生發(fā)展的重要發(fā)病因素已經(jīng)得到了廣泛的證明[17-18]。隨著人口老齡化以及“二孩”、“三孩”政策的開放，PFD在我國的發(fā)病率必然呈增高的趨勢，因此探究PFD的發(fā)病機制對于疾病的防治具有重大意義。

盆底肌在盆底支撐中起關鍵作用，肛提肌作為盆底肌肉中最大、最重要的肌群，在肌肉纖維方向承受了盆底最大的壓力[19]。妊娠時子宮因重力下移，比未妊娠時更大的力量直接作用于肛提肌等支持系統(tǒng)，肛提肌等在向下的壓力作用下而被拉伸，盆底肌肉長時間過度伸展，甚至超出神經(jīng)纖維牽張極限而失去神經(jīng)支配。分娩過程中，胎頭、胎臀娩出時，盆底肌承受極限牽拉甚至出現(xiàn)撕脫，對盆底肌造成嚴重的機械損傷[20]，這種損傷可能是多次分娩相關的機械損傷引起盆底肌功能缺陷的主要因素。本研究團隊前期研究中發(fā)現(xiàn)，多次分娩后小鼠盆底肌肌纖維直徑下降，肌力減退，CACNA1H的表達特異性降低。本文首先通過模擬人體尿道置管檢測TH-null小鼠尿動力變化，發(fā)現(xiàn)TH-null小鼠的BLPP、MVB均較WT組相比明顯降低，也進一步證明TH-null小鼠可以做為PFD的動物模型。與此同時，前期研究發(fā)現(xiàn)TH-null小鼠中存在ERS激活和自噬抑制，而ERS抑制劑可以減輕T通道抑制劑引起的損傷和自噬抑制從而成為可能的治療靶點[5]，且ERS引起細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，進而引起線粒體相關凋亡發(fā)生[21]。研究表明ERS的過度激活會介導骨骼肌萎縮[22]。Herpud1分子被認為是ERS損傷中的調(diào)節(jié)分子，Herpud1在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)線粒體功能方面起著重要作用。本研究結果顯示，在TH-null小鼠和NNC誘導的成肌細胞肌管萎縮模型中，Herpud1表達水平均明顯下降(見圖2和圖3)，由此可推測CACNA1H的敲除或抑制引起的Herpud1表達下降，從而使ERS過度激活，細胞內(nèi)鈣離子失衡，進而引發(fā)細胞凋亡和盆底肌萎縮。

注：A.小鼠盆底肌Herpud1蛋白的 Western-blot分析條帶；B.小鼠盆底肌Herpud1蛋白的Western-blot定量分析(****與WT組比較，P<0.0001)；C和D.小鼠盆底肌免疫組織化學染色和定量分析(***與WT組比較，P<0.001)。

注：A.C2C12不同處理組中Herpud1蛋白的 Western-blot分析條帶；B.C2C12不同處理組中Herpud1蛋白的 Western-blot定量分析(***與WT組比較，P<0.001)。

本研究存在一定的局限性，由于缺乏人體組織研究和基因層面對Herpud1表達進行干預，本研究僅初步證實Herpud1在盆底肌萎縮模型中表達下降，可能參與盆底肌萎縮過程，仍需進一步研究證實。