分光光度計法在甘蔗白條病致病菌菌液濃度測定上的應用

孔春艷，毛鈞，劉新龍，林秀琴，魏春燕，徐超華，李旭娟，劉洪博，李純佳，陸鑫

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所，南寧 530007）

0 引言

食糖是關系到我國國計民生的重要農(nóng)產(chǎn)品，歷年來，黨中央、國務院高度重視食糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而甘蔗（Saccharumspp.）是我國主要的制糖原料，其蔗糖產(chǎn)量占我國食糖總產(chǎn)量的90%左右[1]。甘蔗屬于無性繁殖作物，在甘蔗生產(chǎn)中經(jīng)過多年的連續(xù)種植，易受到黑穗病、梢腐病、銹病、褐條病、白葉病、白條病等多種重要病害帶來的嚴重威脅，導致甘蔗單產(chǎn)長期在低位徘徊。

甘蔗白條病是由白條黃單胞桿菌[Xanthomonas albilineans（Ashby）Dowson]引起的細菌性病害，是甘蔗三大細菌性病害之一[2-3]。X.albilineans屬γ 變形菌綱黃單胞菌屬，為革蘭氏陰性菌，菌體細長桿狀，大小0.25～0.3μm×0.6～1.0 μm，單生或成鏈，極生單根鞭毛；菌落形態(tài)為圓形，顏色呈淺黃色或蜜黃色，邊緣整齊，中間隆起，無流動性，專性好氧，最適生長溫度25～28 ℃，不僅有抗生素抗性，還具有較強的傳染性[4-5]。甘蔗白條病于1908 年在斐濟群島發(fā)生，首次于1911 年在澳大利亞出現(xiàn)文獻記錄，目前全球有包括巴西、印度、中國、泰國等66個國家和地區(qū)都相繼報道了該病害的發(fā)生[6-7]。我國于1980年在福建、廣東、臺灣省出現(xiàn)了此病害的報道[8]。甘蔗白條病在2007 年已被列為《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》的320號檢疫對象[9]。但近年來，該病害在我國廣西、云南、海南、浙江等蔗區(qū)均有報道發(fā)生，且在我國甘蔗主產(chǎn)區(qū)有擴大蔓延的趨勢[9-12]。X.albilineans侵染甘蔗植株后，產(chǎn)生粘液，堵塞蔗莖維管束，從而減緩水分和養(yǎng)分在甘蔗體內(nèi)的運輸速度，導致甘蔗生長緩慢，嚴重時造成植株壞死，該病的發(fā)生可導致10%～34%的甘蔗產(chǎn)量損失，對蔗糖產(chǎn)出率造成極大影響[7,13-15]。

為確保蔗糖的生產(chǎn)安全及蔗糖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，培育優(yōu)良的抗病品種是病害防控最經(jīng)濟、最有效的方法，也是一項重要的綠色防控措施[1,16-17]。在抗病品種選育過程中，如何快速、準確地鑒定育種親本和育種材料的抗性等級是育種工作成敗的關鍵。為保證甘蔗白條病抗性鑒定結(jié)果的準確性，提高接種工作的效率，首先需要解決的關鍵問題是確定白條黃單胞桿菌接種菌液的濃度。因此，研究并建立一種可以快速測定白條黃單胞桿菌菌液濃度的方法具有重要的現(xiàn)實意義。

常見的測定細菌菌液濃度的方法主要有比濁法、顯微鏡計數(shù)法和平板計數(shù)法[17-18]。比濁法雖然方便迅速，但容易受外界因素干擾，得到的結(jié)果較為粗略[17]。顯微鏡計數(shù)和平板計數(shù)法與比濁法相比，兩種方法雖然準確性較高，但均存在操作不便、耗時長等缺點[17-18]。此外，ATP 熒光計數(shù)法及流式細胞儀等新方法、新設備已成功用于測定細菌濃度，但這些新設備價格昂貴，在普通實驗室中并不常見[18-19]。曹國珍等研究表明細菌菌懸液的OD 值與菌液濃度之間呈正相關，通過測定細菌菌懸液OD 值可以確定菌液濃度[18,20-22]。鑒于此，本研究以白條黃單胞桿菌為研究對象，分別在4種特定波長下分析不同濃度的細菌菌懸液OD值與平板計數(shù)值，研究二者之間的線性關系，從中篩選出最優(yōu)標準曲線回歸方程。建立一種利用分光光度計快速測定白條黃單胞桿菌菌液濃度的方法，從而提高甘蔗白條病致病菌人工分離和接種鑒定試驗的效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、培養(yǎng)基

白條黃單胞桿菌菌株（LB-1）[23]由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所提供。

XAS固體、XAL液體培養(yǎng)基參考DAVIS等[24]所述成分，在云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室進行配制。

1.1.2 主要儀器

紫外可見分光光度計（型號UV-5800PC，上海元析儀器有限公司），生物安全柜（型號AC2-4S1，新加坡藝思高公司），恒溫培養(yǎng)箱（型號IFC-110-8，北京陸德恒泰商貿(mào)有限公司），恒溫振蕩器（型號THZ-C-1，蘇州培英實驗設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 白條黃單胞桿菌標準菌懸液的制備

將保存在-80 ℃的白條黃單胞桿菌凍存液解凍，取100μL 菌液放入1 mL XAL 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)18～24 h；再取100μL 震蕩培養(yǎng)好的菌液放入無菌XAS 固體培養(yǎng)基中，涂布均勻后放入28 ℃恒溫箱培養(yǎng)5 d，后用接種環(huán)以無菌操作挑取XAS固體培養(yǎng)基上的白條黃單胞桿菌單菌落，接種到在新的XAS固體培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，獲得純化的白條黃單胞桿菌。用10μL無菌吸頭挑取純化后的白條黃單胞桿菌單個菌落放入20 mL XAL液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)36～48 h，取全部菌液于3 500 r/min 離心15 min，去上清液，加入10 mL 無菌生理鹽水重懸細菌，制備成白條黃單胞桿菌標準菌懸液。

1.2.2 不同稀釋度菌懸液OD值測定

取5 支無菌試管，分別加入1、3、4、4.5、4.75 mL 無菌生理鹽水，再依次添加4、2、1、0.5、0.25 mL標準菌懸液，使每只試管內(nèi)混合液體積總量達到5 mL。充分混勻后，配制成一組菌懸液濃度梯度為80%、40%、20%、10%、5%的菌懸液，以無菌生理水為空白對照，各取1 mL菌懸液，在波長420 nm、450 nm、600 nm、660 nm 下用分光光度計進行OD 值測定，每個樣重復測定3次。

1.2.3 平板計數(shù)

吸取上述稀釋得到的不同濃度梯度的系列菌懸液，分別用無菌生理鹽水按10 倍比例稀釋成不同濃度菌液。選取菌落數(shù)在30～300 個的平板作為菌落總數(shù)測定的標準[18]，經(jīng)預實驗，從而確定稀釋度為80%、40%、20%取10-7菌懸液，為10%、5%取10-6菌懸液，用于菌落平板計數(shù)。各取1 mL不同稀釋度的菌懸液于一次性滅菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿3 次重復，涂布均勻后放入28 ℃恒溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)5 d。記錄下各平板上的菌落數(shù)，并乘以其對應的稀釋倍數(shù)，最終計算出不同濃度菌懸液的菌液濃度。

1.2.4 標準曲線建立與準確性驗證

在4 個波長下，以分光光度計測定的不同稀釋濃度白條黃單胞桿菌菌懸液OD 值為自變量x，以平板計數(shù)法獲得的對應稀釋濃度菌懸液細菌濃度為因變量y，分別建立二者間的標準曲線。

分別重新培養(yǎng)3 管白條黃單胞桿菌菌液（分別記為X-1、X-2和X-3），對其進行平板計數(shù)并于最佳測定波長下檢測其OD值，方法同上。將測定所得的不同濃度下白條黃單胞桿菌菌懸液OD值帶入標準曲線回歸方程所得到的值與實際平板計數(shù)值，二者之間進行對比驗證，評估標準曲線的準確性。

1.2.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖采用SPSS 21、Excel 2016軟件，結(jié)果以平均值±標準差來表示。回歸方程的誤差通過均方根誤差（RMSE）和相對均方根誤差（NRMSE）進行評價，回歸方程的決定系數(shù)（R2）作為建立回歸方程的參考指標[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 白條黃單胞桿菌平板計數(shù)與OD 值測定結(jié)果

根據(jù)比爾定律，溶液濃度過高或過低均會導致測定結(jié)果有偏差[18,20-22]，因此對不同波長下OD值范圍進行分析選擇，在4個波長下測定得到不同濃度的白條黃單胞桿菌菌懸液OD值與平板計數(shù)值的結(jié)果（表1）。

表1 不同濃度下白條黃單胞桿菌菌懸液OD 值和平板計數(shù)值Table 1 OD and plate counting values of Xanthomonas albilineans bacterium suspensions under different concentration

2.2 測定波長的選擇與標準曲線的建立

在4 種測定波長條件下分別建立菌液OD 值與平板計數(shù)結(jié)果的標準曲線和線性回歸方程。結(jié)果如圖1所示，4 種測定波長對應的線性回歸方程決定系數(shù)R2均大于0.95，表明白條黃單胞桿菌細菌數(shù)量與OD 值之間均呈現(xiàn)出較好的線性關系[18,20-22]。

圖1 分別在420 nm（a）、450 nm（b）、600 nm（c）、660 nm（d）波長下的標準曲線回歸方程Fig.1 Regression equation of standard curve under the wavelength of 420 nm(a),450 nm(b),600 nm(c),660 nm(d)

其中，在波長420 nm 下，當OD 值為0.106～1.938 時，建立的回歸方程為y=6.1656x-0.2904，RMSE=0.49×108cfu/mL，NRMSE=9.29%，R2=0.9882；在波長450 nm 下，當OD 值為0.094～1.786 時，建立的回歸方程為y=6.7107x-0.1623，RMSE=0.42×108cfu/mL，NRMSE=7.97%，R2=0.9918；在波長600 nm 下，建立的回歸方程為y=11.263x+0.117，RMSE=0.26×108cfu/mL，NRMSE=4.93%，R2=0.9967；在波長660 nm 下，建立的回歸方程為y=13.779x+0.1487，RMSE=0.30×108cfu/mL，NRMSE=5.69%，R2=0.9957。

根據(jù)決定系數(shù)最大化和均方根誤差最小化原則，在4 個波長下，當波長為600 nm 時，線性回歸方程的決定系數(shù)R2值最大，為0.9967；RMSE值最小，為0.26×108cfu/mL，NRMSE值最小，為4.93%。因此，確定測量白條黃單胞桿菌菌液濃度的最佳波長為600 nm，最優(yōu)標準曲線建立的回歸方程為y=11.263x+0.117。

2.3 標準曲線的準確性驗證

在最佳波長600 nm 下，分別測定重新培養(yǎng)的3 管白條黃單胞桿菌菌液OD 值，將測定所得的OD 值帶入標準曲線回歸方程所得到的值與實際平板計數(shù)值，二者之間進行對比驗證。驗證結(jié)果表明，同一方法檢測得到的不同菌液樣本濃度差異顯著，而不同方法檢測得到的同一菌液樣本濃度差異不顯著（表2）。表明在600 nm 波長下通過測定白條黃單胞桿菌菌液的OD 值，建立最優(yōu)標準曲線回歸方程可以對菌液濃度進行非常準確估算。

表2 在600 nm 波長下建立的白條黃單胞桿菌標準曲線準確性驗證Table 2 Verification of standard curve accuracy established at 600 nm wavelength in Xanthomonas albilineans

3 討論與結(jié)論

甘蔗白條病是一種傳染性較強的細菌性種傳病害，主要通過帶病種苗的運輸進行遠距離傳播，也可能通過刀具等收獲工具進行傳播，還可通過氣流[26]、雨水[27]、甘蔗花序[28]、土壤[29]以及人畜活動等途徑進行傳播[30]。含有病菌的甘蔗容易通過調(diào)種或引種的方式在不同國家和國內(nèi)不同的蔗區(qū)之間傳播，這給甘蔗白條病的防治和檢疫帶來很大困難[1]。該病害通常在較長的潛伏期內(nèi)不表現(xiàn)癥狀，或癥狀表現(xiàn)不明顯，一旦遇到環(huán)境適合時便突然暴發(fā)，特別是當種植甘蔗品種為不抗病品種時，大面積暴發(fā)感染會造成嚴重產(chǎn)量損失[3,31]。

甘蔗作為一種高度雜合、遺傳背景復雜的無性繁殖作物，利用傳統(tǒng)雜交法改良甘蔗品種特性周期長、優(yōu)異性狀聚合育種幾率小，且近年來，甘蔗白條病發(fā)生越來越嚴重，分析其原因，與甘蔗品種抗病性較差、氣候條件適宜及防治不利等因素有關，其中，品種的抗病性差是主要因素之一[1,10,32-33]。在抗病品種選育過程中，抗病性鑒定是甘蔗抗病育種工作重要環(huán)節(jié)之一。甘蔗白條病的抗病性鑒定方法，可分為田間自然條件下抗性鑒定和人工接種抗性鑒定。其中，由于田間自然條件下抗性鑒定中外界環(huán)境條件不可控，且調(diào)查周期長，因此鑒定結(jié)果準確性不高；而通過人工接種進行抗病鑒定篩選，可以縮短調(diào)查時間，便于控制發(fā)病因素，可以準確地反映材料抗性水平[1,5]。

為了測定白條黃單胞桿菌菌懸液濃度，在本研究的前期預試驗中，采用了顯微鏡直接觀測計數(shù)法來測定白條黃單胞桿菌菌液濃度，但由于該菌體積小，需要染色后方能在油鏡下進行觀察，故顯微計數(shù)法不適于白條黃單胞桿菌的濃度測定。此外，還采用平板計數(shù)法對白條黃單胞桿菌進行濃度測定，但由于該菌在在人工培養(yǎng)基中生長緩慢，一般至少培養(yǎng)4～6 d，平板計數(shù)法不僅耗時費力，且實驗安排稍有疏漏就會導致實驗結(jié)果不準確[4,17]。已有不少關于利用分光光度計法測定細菌菌液濃度方法的報道，該方法簡便、快速，且結(jié)果也可靠，而且分光光度法是一種很成熟的方法[18,34-35]。馬培培等利用分光光度計法實現(xiàn)對大腸埃希菌菌液濃度的快速測定[18]。劉國紅等通過分光度計法可以快速地檢測芽胞桿菌菌液濃度[22]。肖敏等也同樣利用分光光度計法快速確定金黃色葡萄球菌菌液濃度[34]。因此，本研究采用分光光度計法，分別在420 nm、450 nm、600 nm 和660 nm 波長下測定白條黃單胞桿菌菌懸液的OD 值，并建立標準曲線進行菌液濃度的估算，在4 個測定的波長中，確定白條黃單胞桿菌菌液濃度測定的最佳波長為600 nm，最優(yōu)回歸方程為y=11.263x+0.117。此外，利用分離培養(yǎng)的白條黃單胞桿菌菌懸液樣品檢測數(shù)據(jù)進一步驗證，結(jié)果顯示，最優(yōu)標準曲線的回歸方程預測值與平板計數(shù)值結(jié)果無顯著差異（P>0.05），表明分光光度計法測定白條黃單胞桿菌菌液濃度更為簡單、快速和準確。目前，本課題組已利用分光光度計法法測定和配制適當濃度的白條黃單胞桿菌菌懸液，完成了222 份甘蔗種質(zhì)資源的白條病抗性人工接種鑒定工作，從中篩選出‘臺98-0432’、‘28NG251’、‘K84-200’、‘F160’和‘桂糖11-2211’5個材料高度抗病，可作為抗性親本用于甘蔗抗白條病育種。

本研究建立了分光光度計法測定白條黃單胞桿菌菌液濃度的方法，該方法與傳統(tǒng)測定細菌菌液濃度方法相比，具有操作簡單、快速、準確等特點，可作為白條黃單胞桿菌菌液濃度的測定方法，也可為其它微生物濃度測定提供借鑒。