異質(zhì)型乙酰輔酶A羧化酶及其生產(chǎn)3-羥基丙酸的研究進(jìn)展

張 鑫，丁鐘靈，王肖娜，程智怡，李幸雨，夏立志，徐曉玲，沈潔潔

(杭州師范大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

1957年，Wakil等從鴿子肝臟提取液中分餾純化獲得R1—R4 4種組分，其中R1在1958年被證明含有大量生物素，并參與了以乙酰輔酶A(acetyl-CoA，Ac-CoA)為底物的長(zhǎng)鏈脂肪酸合成.由此乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)被首次分離出來，并被證實(shí)參與生物體內(nèi)脂肪酸的合成[1].隨后越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ACCase廣泛分布于細(xì)菌、植物和動(dòng)物等絕大多數(shù)生物中，以生物素為輔因子，催化Ac-CoA羧化轉(zhuǎn)變?yōu)楸］o酶A(malonyl-CoA，M-CoA)，是脂肪酸從頭合成的起始限速酶[2-4].反應(yīng)底物Ac-CoA和產(chǎn)物M-CoA都是脂肪酸合成的原料，并且M-CoA所攜帶的丙二?；鶊F(tuán)作為二碳單元，直接參與脂酰鏈的延伸過程[3].

ACCase在結(jié)構(gòu)和來源上可分為同質(zhì)型和異質(zhì)型.同質(zhì)型ACCase主要存在于真核生物中，在多肽鏈中依次形成3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：生物素羧化酶(biotin carboxylase，BC)、生物素羧基載體蛋白(biotin carboxylase carrier protein，BCCP)和羧基轉(zhuǎn)移酶(carboxyltransferase，CT)[3-5].同質(zhì)型蛋白復(fù)合體以同型二聚體形式發(fā)揮活性[4]，整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、保守、不易解離.異質(zhì)型ACCase主要存在于原核生物中，是由不同基因編碼的多個(gè)亞基所組成的多酶復(fù)合酶.ACCase因其在脂肪酸合成中的關(guān)鍵作用及其在原核、真核生物中的結(jié)構(gòu)差異而受到人們的廣泛關(guān)注，在新型抗生素篩選、合成和油脂生產(chǎn)[3,5]中均開展了大量研究.

近年來，在一些嗜熱古細(xì)菌、絲狀不產(chǎn)氧光合細(xì)菌(filamentous anoxygenic phototrophs，F(xiàn)APs)等中發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)型ACCase還參與一種新型固定二氧化碳的3-羥基丙酸循環(huán)[6].該循環(huán)的起始兩步反應(yīng)是異質(zhì)型ACCase催化Ac-CoA羧化生成M-CoA，隨后被丙二酰輔酶A還原酶(malonyl-CoA reductase，MCR)還原而生成標(biāo)志性中間代謝產(chǎn)物3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)[7].3-HP是一種重要的平臺(tái)化合物，能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丙烯酸、丙烯腈和1,3-丙二醇等有價(jià)值的化學(xué)物質(zhì)[8-10].值得關(guān)注的是，3-HP的化學(xué)合成普遍存在能耗高、毒性大、副產(chǎn)品多等缺陷，利用代謝工程途徑生產(chǎn)3-HP的生物法[7,10-12]逐漸成為熱點(diǎn)研究方向.以葡萄糖為碳源合成3-HP的途徑中，基于起始兩步反應(yīng)合成3-HP的生物法是力學(xué)上較有利的短合成途徑.

本文回顧并總結(jié)近年來參與脂肪酸從頭合成和3-羥基丙酸循環(huán)異質(zhì)型ACCase的組成、亞基結(jié)構(gòu)、催化及其表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)，以擴(kuò)展對(duì)ACCase結(jié)構(gòu)與功能多樣性、分子進(jìn)化的理解.此外，本文介紹了以3-羥基丙酸循環(huán)的起始兩步反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過基因工程方法，由異質(zhì)型ACCase合成3-HP的范例，以期為綠色、高效開發(fā)3-HP提供理論依據(jù)和策略.

1 異質(zhì)型ACCase組成的多樣性

1.1 異質(zhì)型ACCase亞基數(shù)目的多樣性

異質(zhì)型ACCase在不同微生物中的亞基編碼基因不同.例如，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中ACCase包含α亞基和β亞基，其中α亞基是由BC和BCCP組成的雙結(jié)構(gòu)域蛋白，其編碼基因有3個(gè)，分別是accA1—A3.β亞基行使CT蛋白的功能，其編碼基因有6個(gè)，分別是accD1—D6.這6個(gè)亞基為細(xì)胞膜脂質(zhì)的合成提供不同酰基，如丙酰、乙酰或丁醛基團(tuán).這些產(chǎn)物為脂肪酸合成途徑提供底物，催化產(chǎn)生細(xì)胞壁中的分枝菌酸和細(xì)胞包膜中的多甲基分支脂肪酸[13-15].天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)中編碼ACCase亞基的基因種類豐富，轉(zhuǎn)錄翻譯得到的產(chǎn)物發(fā)揮活性功能，為聚酮合成途徑提供代謝產(chǎn)物[16].本實(shí)驗(yàn)室研究的光合綠絲菌(Chloroflexusaurantiacu)[17]和光合玫瑰菌(Roseiflexuscastenholzii)[18]是FAPs的兩個(gè)典型菌株，這兩個(gè)菌株基因組上編碼ACCase亞基的基因眾多，轉(zhuǎn)錄翻譯后的蛋白質(zhì)催化3-羥基丙酸循環(huán)的起始反應(yīng).

1.2 異質(zhì)型ACCase亞基組成的多樣性

不同原核生物中異質(zhì)型ACCase的亞基組成具有多樣性.按照亞基組成主要分為以下3類：第一類以大腸桿菌(Escherichiacoli)[19]、光合綠絲菌和光合玫瑰菌中的ACCase為例，都是由BC、BCCP、α-CT和β-CT亞基組成，是最常見的組合方式.第二類以天藍(lán)色鏈霉菌[20]和結(jié)核分枝桿菌[14]中的ACCase為例，由α亞基、β亞基和特殊ε亞基組成，分別行使BC-BCCP、CT和輔助功能.其中，ε亞基特異性結(jié)合β亞基形成β-ε復(fù)合體，進(jìn)一步促進(jìn)β亞基與α亞基的結(jié)合，增強(qiáng)整體ACCase的活性.第三類以參與3-羥基丙酸循環(huán)的極性嗜熱金屬球菌(Metallosphaerasedula)[21]和嗜熱耐酸古細(xì)菌(Acidianusbrierleyi)[22]中的ACCase為例，由α、β和γ共3個(gè)亞基組成，分別行使CT、BC和BCCP的催化作用，同時(shí)具有羧化Ac-CoA和丙酰輔酶A兩種底物的功能(圖1).

有趣的是，非禾本科單子葉植物和雙子葉植物(如擬南芥)等真核生物質(zhì)體中也存在異質(zhì)型ACCase，由核基因組編碼的BC、BCCP、α-CT亞基和質(zhì)體基因組編碼的β-CT亞基一起組裝加工形成高分子量的復(fù)合體[23](圖1).盡管這些植物ACCase是屬于異質(zhì)型，但其氨基酸序列更接近于真核同質(zhì)型[24].

圖1 不同物種中異質(zhì)型ACCase的亞基組成特點(diǎn)Fig.1 Characteristics of subunits composition of heteromeric ACCase in different species

2 異質(zhì)型ACCase的結(jié)構(gòu)與功能

2.1 異質(zhì)型ACCase的催化反應(yīng)

圖2 ACCase的催化反應(yīng)Fig.2 Catalytic reaction of ACCase

2.2 整體異質(zhì)型ACCase及亞基復(fù)合體的蛋白大分子

體內(nèi)異質(zhì)型ACCase是由多個(gè)亞基組裝形成的較大復(fù)合體.目前完整的異質(zhì)型ACCase全酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)還未解析，可能的原因是該復(fù)合物不穩(wěn)定、易解離.但也有文獻(xiàn)報(bào)道，在以3-羥基丙酸循環(huán)為唯一固碳進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)的極性嗜熱金屬球菌M.sedula和嗜熱耐酸古細(xì)菌A.brierleyi中，純化得到完整的異質(zhì)型ACCase.Hügler等[21]通過DEAE-Sepharose色譜法、苯基超糖色譜法、陰離子交換柱、凝膠過濾色譜法等純化方法得到微量M.sedulaACCase復(fù)合體.該復(fù)合體是由57 kDa的α亞基、57 kDa的β亞基和18.6 kDa的γ亞基組成的α4β4γ4結(jié)構(gòu)，分子量為(560±50)kDa.Chuakrut等[22]利用ACCase生物素化的特性，從A.brierleyi細(xì)胞破碎上清液中，通過鏈霉素親和層析特異性純化含有生物素的蛋白，再結(jié)合凝膠色譜進(jìn)一步純化得到ACCase復(fù)合體.該復(fù)合體是由分子量分別為62、59、20 kDa的α、β、γ亞基組成的α4β4γ4結(jié)構(gòu)，分子量約為540 kDa.同樣的，亞復(fù)合體BC-BCCP和CT的分子量也較大.Broussard等[25]通過凝膠排阻層析法(size-exclusion chromatography，SEC)觀察到大腸桿菌BC-BCCP亞復(fù)合物約為640 kDa.Lin等[14]觀察到結(jié)核分枝桿菌的CT(AccD5)是一個(gè)六聚體，分子量約為360 kDa.

2.3 BC-BCCP亞復(fù)合物及其單個(gè)亞基結(jié)構(gòu)

BC和BCCP負(fù)責(zé)完成生物素的羧化.目前只在大腸桿菌中報(bào)道了異質(zhì)型BC-BCCP亞復(fù)合體的結(jié)構(gòu)[40].該亞復(fù)合物由4個(gè)BCCP單體作為分子夾，將2個(gè)BC同二聚體連接，從而形成一個(gè)(BC)4(BCCP)4異八聚體(圖3).BC亞基由N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain)、ATP結(jié)合區(qū)域(ATP-binding domain)和C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain)組成.每個(gè)BC單體都有一個(gè)完整且獨(dú)立的活性催化中心[25].BCCP大約由80個(gè)氨基酸組成，具有保守的AMKM序列，其中K是生物素結(jié)合位點(diǎn)[4,25].該位點(diǎn)突變?yōu)镃ys或Arg，可部分回補(bǔ)ACCase的活性喪失[26].上述復(fù)合體中的BCCP是富含β折疊的獨(dú)立結(jié)構(gòu)，其C端結(jié)構(gòu)域上還存在一個(gè)由約10個(gè)殘基組成、形狀類似于“拇指(thumb)”結(jié)構(gòu)(圖3)，可蓋住BC活性中心，以起到封閉底物的作用[25-26].BCCP的N端結(jié)構(gòu)域高度靈活，與CT亞基結(jié)合，起到轉(zhuǎn)錄抑制劑的作用.BC-BCCP亞復(fù)合物中，BC∶BCCP=1∶1，這與其他文獻(xiàn)中通過生化分析觀察到大腸桿菌中BC∶BCCP=1∶2的結(jié)果不一致[24].可能的原因是在該復(fù)合體的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建中，BC和BCCP編碼基因之間添加了非天然的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site，RBS)，從而引起亞基的異常表達(dá).

a—d： BCCP-BC復(fù)合物的表面圖，BC表示為紫色和橙色，BCCP表示為青色、綠色、淡藍(lán)色和藍(lán)色，b是向右旋轉(zhuǎn)90°的側(cè)視圖、c是b向右旋轉(zhuǎn)90°的側(cè)視圖、d是a逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°的俯視圖；e：BC單體和兩個(gè)BCCP(青色和綠色)卡通圖，BC單體的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域分別表示為淺藍(lán)色、淺橙色和淺粉色，每個(gè)BCCP中AMKM中的K表示為紅色，每個(gè)BCCP中的拇指結(jié)構(gòu)用紅色虛線圈出.

2.4 CT亞復(fù)合物結(jié)構(gòu)

CT負(fù)責(zé)將生物素上的羧基轉(zhuǎn)移到受體，使之羧化，從而完成ACCase后半部分的催化反應(yīng).受體通常是帶有有機(jī)酸的輔酶A酯，主要是Ac-CoA[3]；小部分細(xì)菌中還以丙酰輔酶A[21]和丁酰輔酶A[14]為受體.因此CT在ACCase中具有選擇?；鶈卧墓δ埽彩茿CCase亞基中最不保守的組分.由于其較差的保守性，目前CT對(duì)?；孜锏倪x擇還未有詳細(xì)了解.

革蘭氏陰性菌株大腸桿菌和革蘭氏陽性菌株金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中異質(zhì)型CT的晶體結(jié)構(gòu)都觀察到以α-CT和β-CT組成的異質(zhì)四聚體(α-CT)2(β-CT)2結(jié)構(gòu)[41].α-CT和β-CT形成的二聚體組成CT亞單位的一個(gè)活性中心，其中α-CT結(jié)合羧化的生物素，β-CT結(jié)合Ac-CoA[24,36].β-CT的N端有一個(gè)特殊的鋅指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是由4個(gè)Cys排列形成四面體硫，包裹Zn2+離子，形成一條“鋅帶”(圖4)，起著封閉底物結(jié)合活性位點(diǎn)蓋子的功能[36].Kozaki等[37]發(fā)現(xiàn)將鋅指結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵殘基Cys突變?yōu)锳la，可顯著降低CT活性，說明異質(zhì)型CT-Zn結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涿富畹陌l(fā)揮具有重要作用.同時(shí)鋅指結(jié)構(gòu)域還起著結(jié)合DNA的作用.Benson等[38]發(fā)現(xiàn)CT結(jié)合DNA后，可阻止與羧化的生物素、Ac-CoA的結(jié)合，反之亦然，說明羧化的生物素、Ac-CoA、DNA結(jié)合CT是存在競(jìng)爭(zhēng)性的.此外，有的細(xì)菌中CT并不是以異質(zhì)四聚體形式存在，如結(jié)核分枝桿菌AccD5是一個(gè)六聚體，催化丙酰輔酶A和Ac-CoA的羧化；AccD6是一種同二聚體，催化Ac-CoA的羧化，并且無鋅指結(jié)構(gòu)域[13-15].

a—c：α-CT和β-CT復(fù)合物的表面圖，α-CT和β-CT分別表示為粉紅色和綠色，b是a向右旋轉(zhuǎn)180°后的側(cè)視圖，c是a逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°后的俯視圖；d：α-CT和β-CT復(fù)合物的卡通圖，黑色方框代表復(fù)合物的催化口袋，位于α-CT和β-CT復(fù)合物催化口袋中的關(guān)鍵氨基酸Gly表示為青色，β-CT中的4個(gè)Cys排列成四面體并包裹著Zn2+離子，Cys和Zn2+離子分別表示為紅色和灰色.

在催化過程中，α-CT和β-CT活性位點(diǎn)中的關(guān)鍵氨基酸Gly，構(gòu)成氧陰離子空穴穩(wěn)定底物，形成催化中間態(tài).金黃色葡萄球菌的CT結(jié)構(gòu)中，α亞基Gly199、Gly200和β亞基Gly207、Gly208的相鄰酰胺質(zhì)子作為氫鍵供體，構(gòu)成氧陰離子空穴，分別穩(wěn)定生物素、Ac-CoA中的咪唑陰離子、烯酸部分[36,39].在催化底物Ac-CoA羧化后，產(chǎn)物從CT活性口袋中游離出去.CT仍保持活性，對(duì)游離的生物素具有催化作用[39].

3 異質(zhì)型ACCase的遺傳和生化調(diào)控

異質(zhì)型ACCase催化Ac-CoA羧化是脂肪酸從頭合成和3-羥基丙酸循環(huán)的關(guān)鍵步驟，是微生物正常存活、生長(zhǎng)和繁殖必需的生化反應(yīng)之一.為了維持細(xì)胞內(nèi)異質(zhì)型ACCase及其亞基的表達(dá)水平和活性處于適宜狀態(tài)，微生物通常利用遺傳和生化方式對(duì)其進(jìn)行調(diào)控.

3.1 異質(zhì)型ACCase的遺傳調(diào)控

由于異質(zhì)型ACCase參與不同微生物中的不同生理代謝，其亞基的表達(dá)機(jī)制差異大.在脂肪酸從頭合成中，E.coliBC和BCCP的編碼基因相鄰，位于同一操縱子內(nèi)，可在同一啟動(dòng)子下協(xié)調(diào)表達(dá)[25]；而α-CT和β-CT在不同操縱子中，二者的表達(dá)依賴于其他機(jī)制.在3-羥基丙酸循環(huán)中，C.aurantiacu的α-CT和β-CT反而位于同一操縱子內(nèi)，可在同一啟動(dòng)子下協(xié)同表達(dá)；2個(gè)BC和1個(gè)BCCP的編碼基因相距較遠(yuǎn)，其表達(dá)遵循不同機(jī)制.R.castenholzii基因組中存在2個(gè)α-CT和2個(gè)β-CT的編碼基因，其中1個(gè)α-CT(WP_012119678.1)和1個(gè)β-CT(WP_012119679.1)緊密排列，可進(jìn)行共表達(dá)；而另1個(gè)α-CT(WP_012121414.1)和β-CT(WP_041330882.1)相距太遠(yuǎn)而依賴于其他的表達(dá)機(jī)制.A.brierleyiACCase的β亞基(WP_110270072.1)、γ亞基(WP_110270071.1)和α亞基(WP_110270070.1)依次排列在基因組上，其中β亞基終止密碼子的最后一個(gè)堿基是γ亞基起始密碼子的第1個(gè)堿基[22].三者位于同一操縱子內(nèi)，協(xié)調(diào)表達(dá).

異質(zhì)型ACCase的活性受自身亞基的正調(diào)控.E.coliACCase亞基基因過表達(dá)，整體活性增加，提高了產(chǎn)物水平和脂肪酸合成的速率[40].Miyahisa等[41]異源表達(dá)谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)異質(zhì)型ACCase的2個(gè)亞基，可提高大腸桿菌M-CoA的水平，促進(jìn)下游產(chǎn)物的生成速率.Madoka等[42]過表達(dá)單個(gè)亞基β-CT，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)其他亞基的表達(dá).盡管上述文獻(xiàn)報(bào)道過表達(dá)單個(gè)或多個(gè)亞基可促進(jìn)整體酶活，但也有研究表明過表達(dá)單一亞基對(duì)異質(zhì)型ACCase的表達(dá)無影響或是起負(fù)調(diào)控作用.Shintani等[43]單獨(dú)過表達(dá)BC亞基，發(fā)現(xiàn)并沒有引起B(yǎng)CCP蛋白水平的提高，也沒有導(dǎo)致脂肪酸合成速率的顯著增加.Cheng等[44]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)過表達(dá)E.coliBCCP，反而降低了胞內(nèi)異質(zhì)型ACCase的水平.此外，異質(zhì)型ACCase亞基的表達(dá)也受自身的調(diào)控，如E.coliCT通過結(jié)合編碼α-CT和β-CT亞單位的mRNA，以抑制自身的翻譯.這種蛋白質(zhì)與RNA之間的相互作用是由β-CT的鋅指結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的[45-46].

3.2 異質(zhì)型ACCase的生化調(diào)控

生物體內(nèi)存在不同的生化反應(yīng)，以調(diào)控異質(zhì)型ACCase及其亞基的表達(dá).首先，在脂肪酸從頭合成過程中，ACCase催化的底物和產(chǎn)物都是脂肪酸合成的原料，并且產(chǎn)物M-CoA直接參與?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)共價(jià)連接的脂酰鏈的延伸，而含有較長(zhǎng)脂酰鏈的ACP對(duì)異質(zhì)型ACCase的活性具有別構(gòu)調(diào)節(jié)作用.Davis等[47]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中異質(zhì)型ACCase的活性被含有C6—C20酰基衍生物的ACP別構(gòu)抑制，而不會(huì)被缺乏?；糠值腁CP抑制.其次，BCCP的調(diào)節(jié)蛋白，如生物素-蛋白連接酶(如BirA)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白PⅡ家族等，對(duì)異質(zhì)型ACCase的表達(dá)存在調(diào)控.apo-BCCP(不結(jié)合生物素、無活性的BCCP)在生物素-蛋白連接酶的催化作用下，催化生物素與之共價(jià)連接，生成holo-BCCP(結(jié)合生物素、有活性的BCCP)，因此增強(qiáng)該酶活性可提高多酶復(fù)合體的表達(dá).過表達(dá)E.coliBCCP導(dǎo)致胞內(nèi)ACCase水平降低[44].而過表達(dá)生物素-蛋白連接酶，增強(qiáng)了holo-BCCP的豐度，上調(diào)了復(fù)合酶的表達(dá)[48]，說明生物素合成途徑和BCCP的生物素化在整個(gè)異質(zhì)型ACCase功能中的重要性和必要性.holo-BCCP的另一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白P家族是2-酮戊二酸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，參與氮代謝的調(diào)控.PⅡ在ATP的供能下，直接與holo-BCCP相互結(jié)合起作用[49]，從而導(dǎo)致ACCase整體組裝效率和酶活的降低[50].再次，底物的反饋?zhàn)饔脤?duì)ACCase亞基表達(dá)也有影響.E.coliCT結(jié)合自身亞基的mRNA而抑制自身翻譯的作用，可被充足的底物Ac-CoA消除[45].此外，亞基的磷酸化和去磷酸化也會(huì)影響異質(zhì)型ACCase的表達(dá)水平[51].

4 異質(zhì)型ACCase在3-HP生產(chǎn)中的工程應(yīng)用

在一些嗜熱古細(xì)菌、FAPs中發(fā)現(xiàn)的ACCase參與一種新型的3-羥基丙酸循環(huán)，其標(biāo)志中間物3-HP由ACCase和MCR催化合成.3-HP是合成多種藥物和化工產(chǎn)品的重要前體，具有廣泛的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值.研究者期望通過異源重構(gòu)上述兩步反應(yīng)，以綠色生物合成方式生產(chǎn)3-HP.因合成3-HP的直接底物為M-CoA，故將3-羥基丙酸循環(huán)起始兩步生化反應(yīng)稱為丙二酰輔酶A途徑.很多底盤生物(如大腸桿菌、酵母)中已重構(gòu)該途徑，以生產(chǎn)3-HP[7,52-53].Rathnasingh等[52]過表達(dá)大腸桿菌K-12異質(zhì)型ACCase的編碼基因accABCD、生物素連接酶bira與C.aurantiacumcr，發(fā)酵產(chǎn)生的3-HP達(dá)到1.6 mmol/L.Kildegaard等[54]在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)體內(nèi)重構(gòu)丙二酰輔酶A途徑，發(fā)酵產(chǎn)生3-HP.

3-HP的重要性和丙二酰輔酶A途徑短、力學(xué)上有利的優(yōu)勢(shì)受到越來越多研究者的關(guān)注，因此目前已明確底盤生物體內(nèi)產(chǎn)生3-HP的代謝過程：內(nèi)源性葡萄糖(glucose)通過糖酵解轉(zhuǎn)化為丙酮酸(pyruvic acid),丙酮酸通過丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)生成Ac-CoA,Ac-CoA經(jīng)ACCase羧化而轉(zhuǎn)化為M-CoA，后者被MCR催化產(chǎn)生最終的產(chǎn)物3-HP[55](圖5).

圖5 宿主體內(nèi)丙二酰輔酶A途徑合成3-HP的代謝支路及ACCase的調(diào)控Fig.5 M-CoA pathway and regulation of ACCase in the host cell

盡管已有很多文獻(xiàn)報(bào)道底盤生物體內(nèi)重構(gòu)丙二酰輔酶A途徑可生產(chǎn)3-HP，但生物法合成3-HP的產(chǎn)量較低.底物M-CoA在該途徑中的供給量不足，M-CoA是通用的中間代謝產(chǎn)物，存在多條競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑，如脂肪酸的合成、聚酮化合物的合成、黃酮的合成等[56].而ACCase是體內(nèi)催化生成M-CoA的關(guān)鍵酶，因此增強(qiáng)異質(zhì)型ACCase活性對(duì)提高M(jìn)-CoA的供應(yīng)具有重要意義.基于異質(zhì)型ACCase的催化機(jī)制和調(diào)控機(jī)理，增強(qiáng)其活性的方法如下：

第一，過表達(dá)異質(zhì)型ACCase所有亞基基因，提高整體復(fù)合酶的表達(dá)水平和酶活.Rathnasingh等[52]在大腸桿菌中過表達(dá)C.aurantiacuDSM 635的mcr基因，以葡萄糖為唯一碳源搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生0.71 mmol/L的3-HP；基于此，過表達(dá)大腸桿菌K-12異質(zhì)型ACCase的編碼基因accABCD和生物素連接酶bira，增強(qiáng)底盤生物體內(nèi)ACCase表達(dá)水平及其整體活性，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生3-HP的產(chǎn)量提高約2倍，為1.6 mmol/L.Nguyen等[53]以Ⅱ型甲烷諾菌作為生物反應(yīng)器，過表達(dá)內(nèi)源ACCase基因，增強(qiáng)了整體ACCase活性，促使其反應(yīng)速率加快，提高了M-CoA前體的供應(yīng)，顯著增加了3-HP的產(chǎn)率.

第二，過表達(dá)部分亞基，增強(qiáng)多酶復(fù)合體的酶活.Cheng等[57]通過構(gòu)建含有2個(gè)C.glutamicumACCase亞基基因的表達(dá)質(zhì)粒于大腸桿菌BL21(DE3)中，在25℃和0.25 mmol/L IPTG條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生大量亞基蛋白；隨后添加NaHCO3和生物素，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生3-HP的最高水平為1.8 g/L；5L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵，產(chǎn)生3-HP的最高水平可達(dá)10.08 g/L.

第三，過表達(dá)異質(zhì)型ACCase的正調(diào)節(jié)蛋白，提高其活性.Lian等[48]在極端嗜熱菌Pyrococcusfuriosus中過表達(dá)M.sedula異質(zhì)型ACCase、MCR和丙二酰半醛還原酶(malonic semialdehyde reductase)的編碼基因，以麥芽糖和二氧化碳為碳源，發(fā)酵產(chǎn)生40 mg/L 3-HP；基于此，過表達(dá)M.sedula的生物素-蛋白連接酶BPL，促進(jìn)BCCP亞基的生物素化，提高P.furiosus體內(nèi)生物素化ACCase水平，增強(qiáng)整體酶活，使得發(fā)酵產(chǎn)生的3-HP水平提高為原來的8.2倍.

5 結(jié)論與展望

異質(zhì)型ACCase是脂肪酸合成和3-羥基丙酸循環(huán)的限速酶，是微生物體內(nèi)重要的多酶復(fù)合體.盡管本文介紹了異質(zhì)型ACCase催化、調(diào)控和工業(yè)應(yīng)用的一些背景，但異質(zhì)型ACCase復(fù)合體的組裝、底物和中間產(chǎn)物傳遞、產(chǎn)物產(chǎn)生的細(xì)節(jié)、不穩(wěn)定易解聚的原因尚不明確，異質(zhì)型ACCase的結(jié)構(gòu)信息亟需完整.目前已有報(bào)道可提取極性嗜熱金屬球菌M.sedula[21]和嗜熱耐酸古細(xì)菌A.brierleyi[22]中的穩(wěn)定異質(zhì)型ACCase復(fù)合物，但未有關(guān)于其三維空間結(jié)構(gòu)的報(bào)道.

市售的3-HP主要由化工合成而來，但仍然不能滿足工業(yè)化應(yīng)用的要求；化工合成長(zhǎng)期以來造成的資源損耗和環(huán)境污染非常嚴(yán)重，亟需開發(fā)綠色新型可持續(xù)性生物合成3-HP的工藝.目前，生物合成3-HP的原料主要是以廉價(jià)的葡萄糖和甘油為碳源，其中以葡萄糖為碳源合成3-HP的丙二酰輔酶A途徑是最具潛力和前景的生物法合成途徑.作為該途徑的關(guān)鍵酶之一，異質(zhì)型ACCase的催化機(jī)制和調(diào)控機(jī)理的深入研究將有助于以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，結(jié)合調(diào)控機(jī)理，合理定向地改造ACCase，解決生物合成3-HP產(chǎn)量低的問題，為生物合成3-HP的工業(yè)市場(chǎng)提供新思路和新方法.