嘌呤能受體X1與肺腺癌預(yù)后及免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性研究

于運(yùn)亮，王莉莉，李 婷，封建凱，*

(1．濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東煙臺 264100；2．煙臺市煙臺山醫(yī)院病理科，山東 煙臺264000)

ATP受體在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，細(xì)胞外ATP可與受體結(jié)合直接影響癌癥進(jìn)展[1]。嘌呤能受體X1(purinergic receptor，P2RX1)作為ATP門控離子通道受體家族成員，與免疫細(xì)胞激活、腫瘤進(jìn)展及炎癥因子的釋放等有關(guān)[2-4]。P2RX1作用于酸性核磷蛋白32A可影響乙?；{(diào)控分子H3的富集進(jìn)而促進(jìn)白血病的發(fā)生[5]。胰腺癌肝轉(zhuǎn)移TME中ATP受體P2RX1陰性的中性粒細(xì)胞亞群浸潤增多，該中性粒細(xì)胞通過表達(dá)PDL1等免疫抑制分子介導(dǎo)胰腺癌肝轉(zhuǎn)移[6-7]。目前，關(guān)于P2RX1是否參與非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)的發(fā)生、發(fā)展的研究鮮有報道。NSCLC包 括 肺 鱗 癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)和肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)兩種組織類型，本研究綜合分析發(fā)現(xiàn)P2RX1的表達(dá)與LUAD患者預(yù)后及TME中免疫細(xì)胞的浸潤有關(guān)，為NSCLC的免疫治療提供了新的分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究流程圖

本研究從UCSC(http://xenabrowser.net)數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)集，隨后提取P2RX1基因在各個樣本中的表達(dá)數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)集進(jìn)行轉(zhuǎn)換后，剔除單個腫瘤小于10個樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)后分析，并利用R軟件包對數(shù)據(jù)集進(jìn)行篩選分析，具體分析流程圖如圖1。

圖1 分析流程圖

1.2 NSCLC中P2RX1的表達(dá)水平

TIMER在線數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)可用于檢測腫瘤組織中免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)的浸潤情況，可量化分析免疫細(xì)胞浸潤比例。利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫“Diff Exp”模塊分析TCGA數(shù)據(jù)庫來源的32種癌癥中正常組織和腫瘤組織P2RX1的表達(dá)差異?；赥CGA和GTEx數(shù)據(jù)庫，利用GEPIA 2.0數(shù)據(jù)庫“Expression DIY”模塊進(jìn)一步驗(yàn)證P2RX1在NSCLC及其亞型中的表達(dá)。

1.3 預(yù)后分析

LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org/)包含了多種癌癥的數(shù)據(jù)和臨床信息，集成了針對TCGA數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)組學(xué)樣本。GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)同樣是基于TCGA數(shù)據(jù)庫開發(fā)而來的癌癥在線研究數(shù)據(jù)庫。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)病人的ID信息查找臨床隨訪信息。本研究利用GEPIA 2.0數(shù)據(jù)庫對477例LUAD患者和480例LUSC患者進(jìn)行預(yù)后分析，利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證，并分析P2RX1的表達(dá)與LUAD患者腫瘤純度(指腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞所占的比例)、分期等臨床病理因素之間的關(guān)系。利用MethSurv數(shù)據(jù)庫(https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)對不同甲基化CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析，將P2RX1甲基化模式與LUAD患者的不同臨床病理特征(民族、種族、年齡、生存等)和基因亞區(qū)域相關(guān)聯(lián)，以熱圖的形式對P2RX1中單個CpG進(jìn)行聚類分析。隨后，進(jìn)一步分析TCGA來源的每個CpG位點(diǎn)的P2RX1的甲基化水平與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 富集分析

利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org)下載包含P2RX1表達(dá)水平的基因芯片數(shù)據(jù)集，篩選LUAD中與P2RX1正相關(guān)的前100個共表達(dá)基因。篩選UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)中與P2RX1正相關(guān)基因的前100個，與上述LinkedOmics數(shù)據(jù)庫篩選的基因取交集，共得到79個共表達(dá)基因在兩組數(shù)據(jù)集中均存在。對此79個共表達(dá)基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析。利用R軟件包“clusterProfiler”“ggplot2”“circlize”“enrichplot”等工具進(jìn)行分析并繪圖。

1.5 核心基因的篩選與預(yù)后分析

STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org)是分析目的基因與蛋白相互作用的在線檢索數(shù)據(jù)庫，包含已證實(shí)的和可以預(yù)測的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的生物數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)資源。本研究將篩選的79個基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫，物種選擇類型為“Homo sapiens”，置信度選擇“Medium 0.400”，相互作用最大數(shù)選擇10，得到基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Cytoscape軟件。利用Cytoscape插件“CytoHubba”挑選出與周圍基因具有高度連通性的前10個基因作為核心基因，隨后根據(jù)互相作用節(jié)點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行降序排序。利用GEPIA 2.0分析核心基因在LUAD和正常肺組織中的表達(dá)差異，并分析核心基因的表達(dá)與LUAD患者總生存期(overall survival，OS)之間的關(guān)系。

1.6 P2RX1的表達(dá)與免疫浸潤的相關(guān)性

本研究利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫分析P2RX1與腫瘤純度及浸潤在TME中的B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的相關(guān)性，分析經(jīng)腫瘤純度校準(zhǔn)后P2RX1與B細(xì)胞標(biāo)記基因CD19、CD79A和CD79B的相關(guān)性。下載TIMER 2.0中32種癌癥的免疫細(xì)胞浸潤得分?jǐn)?shù)據(jù)，利用R軟件包“estimate”、“circlize”等工具分析并可視化P2RX1與32種腫瘤中47種常見免疫檢查點(diǎn)、免疫和基質(zhì)綜合評分(ESTIMATE Score)、免疫細(xì)胞評分(Immune Score)和基質(zhì)評分(Stromal Score)之間的相關(guān)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)分析均通過R3.6.3軟件進(jìn)行。正常肺組織和NSCLC組織之間P2RX1的表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)。生存分析用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)分析。使用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析P2RX1與免疫細(xì)胞浸潤、免疫細(xì)胞/基質(zhì)評分、免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P2RX1在NSCLC中低表達(dá)

TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫顯示P2RX1在正常肺組織中的表達(dá)明顯高于LUAD和LUSC患者(圖2A)。GEPIA 2.0數(shù)據(jù)庫顯示與正常肺組織比較，P2RX1在LUAD和LUSC患者中表達(dá)下調(diào)(圖2B)。另外，與正常肺組織比較，P2RX1在近端炎癥型、近端增殖型和終末呼吸單位型3種不同LUAD亞型中的表達(dá)顯著下調(diào)(圖2C)；在基底型、經(jīng)典型、原生型和分泌型4種LUSC亞型中的表達(dá)亦顯著下調(diào)(圖2D)。

圖2 P2RX1在NSCLC中的表達(dá)水平

2.2 P2RX1低表達(dá)的LUAD患者預(yù)后不良

GEPIA 2.0數(shù)據(jù)庫及LinkedOmics結(jié)果均顯示P2RX1高表達(dá)的LUAD患者OS較長(圖3A和B)，而P2RX1的表達(dá)與LUSC患者OS無明顯相關(guān)關(guān)系(P=0.099)。P2RX1的表達(dá)與LUAD患者腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖3C，r=-0.5402，P=1.299×10-38)，與LUAD患者的T分期(圖3D，P=3.856×10-4)、病理分期(圖3E，P=9.66×10-3)、N分期(圖3F，P=0.154×10-2)有關(guān)。

圖3 P2RX1的表達(dá)與LUAD患者預(yù)后關(guān)系

2.3 P2RX1甲基化與LUAD患者預(yù)后有關(guān)

MethSurv數(shù) 據(jù)庫顯示P2RX1中cg12709970位 點(diǎn)甲 基 化 水 平 較 低，而cg06475633、cg22506042、cg14116792等CpG位點(diǎn)甲基化水平較高(圖4A)。在這些CpG位點(diǎn)中，cg06475633(圖4B)和cg03368358(圖4C)甲基化水平高的患者總生存期較短，預(yù)后較差。

圖4 P2RX1中CpG位點(diǎn)甲基化水平

2.4 P2RX1共表達(dá)基因參與免疫調(diào)控

對LinkedOmics和UALCAN數(shù)據(jù)庫篩選的79個基因(相關(guān)系數(shù)r＞0.5，P＜0.01)進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示這些基因主要參與B細(xì)胞受體信號通路、原發(fā)性免疫缺陷信號通路等(圖5A)；參與白細(xì)胞分化、淋巴細(xì)胞分化、T細(xì)胞激活、白細(xì)胞激活等多種生物學(xué)進(jìn)程(圖5B和E)；參與構(gòu)成足小體等(圖5C)；主要富集于磷脂結(jié)合、核苷三磷酸酶調(diào)控、GTP酶激活等多種分子功能(圖5D和F)。

圖5 LUAD中P2RX1共表達(dá)基因的富集分析

2.5 核心基因與LUAD患者預(yù)后有關(guān)

根據(jù)前文的篩選條件得到10個核心基因的順序依次為BTK、IKZF1、SASH3、CD79B、CD19、ZAP70、IL10RA、CD79A、WAS和CYTIP(圖6A)。利用GEPIA 2.0分析上述核心基因在LUAD中的表達(dá)，結(jié)果顯示除CD79B、CD19和CD79A外，其余7個核心基因在LUAD中的表達(dá)均顯著下調(diào)(P＜0.05，圖6B)。對核心基因進(jìn)行預(yù)后分析，結(jié)果顯示除IL10RA和WAS(圖6I和K)外，其余8個核心基因低表達(dá)的患者OS均明顯縮短(圖6C～L)。

圖6 核心基因的篩選與預(yù)后分析

2.6 P2RX1與多種免疫細(xì)胞浸潤及免疫檢查點(diǎn)相關(guān)

TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫顯示在LUAD中P2RX1與腫瘤純度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P均＜0.05，圖7A)。經(jīng)腫瘤純度校準(zhǔn)后，P2RX1的表達(dá)與B細(xì)胞標(biāo)記基因CD19、CD79A和CD79B呈正相關(guān)關(guān)系(P均＜0.05，圖7B～D)。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)在LUAD中P2RX1的表達(dá)與ADORA2A、BTLA、BTNL2、CD160、CD200、CD200R1、CD244、CD27、CD276、CD40等 呈 正 相 關(guān) 關(guān) 系(圖7E，P＜0.05)。

圖7 P2RX1的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤及免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性分析

2.7 P2RX1與免疫/基質(zhì)評分正相關(guān)

利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫和R3.6.3軟件為免疫細(xì)胞/基質(zhì)比例等評分并作圖，結(jié)果顯示除彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBC)、多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)、急性髓細(xì)胞樣白血病(LAML)等外，其他20多種腫瘤TME中P2RX1的表達(dá)與免疫/基質(zhì)評分均相關(guān)(圖8)。在LUAD中，P2RX1的表達(dá)分別與免疫和基質(zhì)綜合評分(r=0.592)、免疫細(xì)胞評分(r=0.582)和基質(zhì)細(xì)胞評分(r=0.513)均呈正相關(guān)(均為P＜0.05)。

圖8 32種腫瘤中P2RX1的表達(dá)與免疫基質(zhì)綜合評分、免疫細(xì)胞評分及基質(zhì)評分之間的關(guān)系

3 討論

嘌呤能受體X1是門控膜離子通道重要的組成部分，廣泛參與機(jī)體ATP傳遞、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程[8]。研究證實(shí)，P2RX1在人體內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)控作用，與血小板聚集、免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子釋放以及ATP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等過程有關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)P2RX1在NSCLC不同亞型(LUAD和LUSC)中的表達(dá)顯著下調(diào)，但LUAD和LUSC兩組之間P2RX1的表達(dá)無明顯差異。高表達(dá)P2RX1的LUAD患者OS較長，預(yù)后較好，而P2RX1與LUSC患者總生存期無關(guān)。P2RX1與LUAD患者腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)，與患者的TNM分期等有關(guān)，提示P2RX1可能在LUAD中扮演重要的抑癌因子的角色。DNA甲基化作為真核細(xì)胞正常的修飾方式，其異常在NSCLC的進(jìn)展中至關(guān)重要[9]。本研究發(fā)現(xiàn)P2RX1多個CpG位點(diǎn)顯示了較高的甲基化水平，其中cg06475633和cg03368358這兩個CpG位點(diǎn)甲基化水平較高的患者預(yù)后較差，這一發(fā)現(xiàn)為后期P2RX1用于臨床診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。

為了探索P2RX1在LUAD中的潛在機(jī)制和生物學(xué)功能，本研究對P2RX1共表達(dá)基因進(jìn)行了富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P2RX1共表達(dá)基因在免疫細(xì)胞尤其是B細(xì)胞活化、分化等生物學(xué)進(jìn)程和功能中明顯富集，與機(jī)體NTP酶和GTP酶等能量代謝的調(diào)控密切相關(guān)，提示P2RX1可能通過調(diào)控TMR中的能量代謝進(jìn)而影響LUAD的進(jìn)展，這一發(fā)現(xiàn)與之前P2RX1在胰腺癌中調(diào)控免疫細(xì)胞能量代謝的作用相似[7]。P2RX1共表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心基因主要有BTK、IKZF1、SASH3等，它們在LUAD表達(dá)顯著下調(diào)且與LUAD預(yù)后有關(guān)，進(jìn)一步提示P2RX1可能參與腫瘤微環(huán)境重塑、淋巴細(xì)胞的分化和發(fā)育等過程。

利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫深入分析顯示P2RX1不僅與LUAD腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)，而且還與不同免疫細(xì)胞尤其是與B細(xì)胞浸潤相關(guān)，與其標(biāo)記基因CD19、CD79A、CD79B顯著正相關(guān)。這3個基因作為P2RX1共表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)路中的核心基因，其低表達(dá)的LUAD患者預(yù)后不良。上述結(jié)果提示P2RX1可能參與B細(xì)胞從原細(xì)胞期分化增殖到漿細(xì)胞期的整個過程以及B細(xì)胞活化信號傳導(dǎo)、細(xì)胞因子釋放等過程。針對LUAD患者使用程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1/PD-L1)免疫檢查點(diǎn)抑制劑可誘導(dǎo)或增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)[10]。PD-1通過與其配體PD-L1和PD-L2結(jié)合進(jìn)而調(diào)控T細(xì)胞增殖和免疫反應(yīng)[11-13]。通過聯(lián)合使用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)抗體和PD-1抗體可增強(qiáng)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的增殖能力進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)P2RX1與CTLA-4及PD-1呈正相關(guān)，提示P2RX1可直接或間接調(diào)控CTLA-4、PD-L1等的表達(dá)進(jìn)而抑制T細(xì)胞的活化，誘發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。另外，P2RX1還與BTLA、LAIR、CD27等31種常見免疫檢查點(diǎn)顯著相關(guān)，說明P2RX1可能在TME中發(fā)揮廣泛而又復(fù)雜的免疫調(diào)控作用。在TME中，免疫細(xì)胞和基質(zhì)成分是兩種主要的非腫瘤組分，對于腫瘤的診斷和預(yù)后評估具有很高的價值[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)P2RX1不僅與免疫細(xì)胞浸潤高度相關(guān)，還與腫瘤免疫/基質(zhì)細(xì)胞評分呈正相關(guān)，提示P2RX1可能在免疫細(xì)胞和基質(zhì)成分的動態(tài)調(diào)控過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用。本研究不僅探索了P2RX1的表達(dá)及甲基化與LUAD患者預(yù)后的相關(guān)關(guān)系，還初步揭示了P2RX1在LUAD腫瘤微環(huán)境中參與的免疫調(diào)控作用，但本研究針對P2RX1轉(zhuǎn)錄組水平的分析尚不能解釋該分子參與的具體調(diào)控機(jī)制，關(guān)于P2RX1是否對LUAD腫瘤細(xì)胞具有調(diào)控作用也需要進(jìn)一步研究證實(shí)，因此本研究需要更多的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證結(jié)論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)P2RX1在LUAD中低表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，P2RX1可能在LUAD中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用，與B細(xì)胞增殖、分化等多種過程有關(guān)。對P2RX1基因進(jìn)行更深層次的研究，不僅可以揭示該基因的功能，還可以進(jìn)一步探索P2RX1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，可為進(jìn)一步探索P2RX1在LUAD中的免疫調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。