基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對接技術(shù)研究貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關(guān)性疲乏的作用機制

程艷野，習(xí)彎彎，毛雪楊，魏天怡，胡海瑞，李志剛*

(1．河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2．河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南鄭州450008)

大腸癌(colorectal cancer，CRC)包括直腸癌和結(jié)腸癌，其2020年新發(fā)病例數(shù)位居世界第3位，死亡病例數(shù)居第2位[1]。治療方式主要有手術(shù)、放化療等，在其發(fā)病及治療過程中癌因性疲乏(cancer-related fatigue，CRF)是較為常見的癥狀之一[2]。癌因性疲乏是指某種痛苦的、持久的、主觀的、有身體、情感及意識方面的疲乏感，與近期活動量不符，與腫瘤患者相關(guān)，而且妨害日常生活[3]。根據(jù)其特點，可將其歸屬于中醫(yī)“虛勞”范疇，臨床研究表明中醫(yī)藥可以作為癌因性疲乏的補充甚至替代治療[4]。2020年中成藥治療癌因性疲乏臨床應(yīng)用指南指出貞芪扶正顆?？梢杂行Ц纳拼竽c癌根治術(shù)后患者疲乏狀態(tài)，并得到專家共識[4]。貞芪扶正顆粒由黃芪、女貞子組成，具有提高人體免疫功能，適應(yīng)于各種疾病引起的虛損，可配合手術(shù)、放射線、化療使用，但其治療大腸癌相關(guān)性疲乏中的作用機制尚不明確。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對接方法探討貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關(guān)性疲乏的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 貞芪扶正顆粒靶點篩選

以“女貞子”“黃芪”為關(guān)鍵詞，依次檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)收集藥物活性成分，篩選出藥物口服生物利用度≥30%、藥物相似性≥0.18的有效活性成分及其作用的蛋白質(zhì)靶點[5]，然后通過Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)規(guī)范蛋白質(zhì)靶點信息。

1.2 大腸癌相關(guān)性疲乏的靶點篩選

以“Colorectal cancer-related fatigue”為關(guān)鍵詞，挖掘GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(http://www.omim.org)等數(shù)據(jù)庫中大腸癌相關(guān)性疲乏的潛在靶點，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，如果靶點過多則設(shè)定Score≥5的目標(biāo)靶點為潛在靶點，結(jié)合其他數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，合并后刪除重復(fù)值。

1.3 貞芪扶正顆粒-大腸癌相關(guān)性疲乏的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及重要靶點篩選

為明晰芪貞扶正顆粒藥物相關(guān)靶點與大腸癌相關(guān)性疲乏靶點間的相互作用，使用Hiplot(https://hiplot.com.cn)平臺將藥物潛在作用的靶點基因同疾病基因進行匹配并繪制韋恩圖，得到交集靶點，并上傳至String 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小相互作用設(shè)定為≥0.4，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。然后通過CytoScape 3.7.2中的MCODE插件對其進一步分析，獲得該網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵模塊，刪選出結(jié)果中同時大于節(jié)點度值分布(node degree distribution)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)、接近中心性(closeness centrality)三者中位數(shù)的靶點，為該PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點。

1.4 GO生物分析與KEGG通路富集分析

將交集靶點上傳至Metascape平臺(http://metascape.org/gp/index.html)里的基因列表中，選定物種“homo sapiens”，設(shè)置P＜0.01，進行GO功能分析和KEGG通路富集分析，依據(jù)靶點富集程度進行降序，篩選排名靠前的生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular components，CC)、分 子 功 能(molecular function，MF)和通路，并通過微生信平臺對其可視化。

1.5 貞芪扶正顆粒成分-大腸癌相關(guān)性疲乏靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運用CytoScape 3.7.2構(gòu)建貞芪扶正顆粒成分-大腸癌相關(guān)性疲乏靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，將活性成分根據(jù)其度值排序，篩選出排名靠前的有效成分為關(guān)鍵成分，可供分子對接用。

1.6 分子對接驗證

從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載1.5篩選出的關(guān)鍵化合物的2D結(jié)構(gòu)的sdf格式文件，通過OpenBabel轉(zhuǎn)換為mol2格式，導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6軟件中，檢查其空間結(jié)構(gòu)無誤后，將其添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均改為默認(rèn)可旋轉(zhuǎn)并保存為pdbqt格式，作為對接配體。選取前4位1.3篩選出的核心靶點，于Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)尋找活性成分的3D構(gòu)想，將查詢的PDBID輸入PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中并下載其相應(yīng)蛋白的3D結(jié)構(gòu)的pdb格式。將此3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6軟件中，進行去除水分子、加氫、加電荷及各項優(yōu)化，然后設(shè)置網(wǎng)格箱(gird box)為默認(rèn)值并將其保存，最后將優(yōu)化后的蛋白保存為pdbqt格式，作為對接受體。根據(jù)靶蛋白中配體的坐標(biāo)以及靶蛋白活性口袋(gird box中數(shù)據(jù))進行設(shè)置，采用AutoDock Vina1.1.2進行分子對接并得到結(jié)果，將結(jié)果導(dǎo)入PyMOL軟件中進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 芪貞扶正顆?；钚猿煞职悬c的獲取

初步提取女貞子化學(xué)成分119種、黃芪化學(xué)成分87種，經(jīng)藥物口服生物利用度、藥物相似性值篩選后共獲得黃芪20個，女貞子13個活性成分，見表1。女貞子成分作用靶點321個、黃芪成分作用靶點349個，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點209個。

表1 貞芪扶正顆粒主要成分

2.2 大腸癌相關(guān)性疲乏靶點的獲取

從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得大腸癌相關(guān)性疲乏靶點2 330個。根據(jù)經(jīng)驗設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點為大腸癌相關(guān)性疲乏的潛在靶點，如通過GeneCards所得大腸癌相關(guān)疲乏靶點Score最大值為116.57，最小值為0.35，取Score≥5.0的靶點為大腸癌相關(guān)性疲乏的潛在靶點。結(jié)合OMIM、TTD、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，合并后刪除重復(fù)值，最終得到975個大腸癌相關(guān)性疲乏相關(guān)靶點。

2.3 貞芪扶正顆粒-大腸癌相關(guān)性疲乏PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點

將篩選的貞芪扶正顆粒活性成分靶點與大腸癌相關(guān)性疲乏疾病靶點取交集，繪制韋恩圖見圖1，得到貞芪扶正顆粒-大腸癌相關(guān)性疲乏共同靶點111個。進而將靶點提交至String 11.0平臺，得到一個111個節(jié)點，2 412條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，下載tsv格式，導(dǎo)入Cytoscope 3.7.2軟件中進行可視化，見圖2。經(jīng)MCODE分析后得出4個模塊，排除Score小于10的模塊，得到1個模塊。通過NetworkAnalyzer工具對該網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出節(jié)點度值、介數(shù)中心性、接近中心性均大于中值的靶點，得到29個核心靶點見表2。

圖1 貞芪扶正顆粒-大腸癌相關(guān)性疲乏韋恩圖

圖2 貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關(guān)性疲乏相關(guān)靶點蛋白互作圖

表2 核心靶點信息

2.4 GO生物分析與KEGG通路富集分析

將交集靶點導(dǎo)入Metascape平臺進行GO分析和KEGG通路分析，KEGG通路分析見圖3，主要有癌癥的通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、細(xì)胞衰老等通路，具體靶點通路富集結(jié)果見表3，說明貞芪扶正顆粒的活性成分靶點分布于多條通路，各通路協(xié)調(diào)治療大腸癌相關(guān)性疲乏。

表3 貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關(guān)性疲乏靶點通路富集結(jié)果

圖3 貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關(guān)性疲乏的KEGG富集分析

GO分析結(jié)果見圖4，生物過程主要涉及到對無機物質(zhì)的反應(yīng)、對外源刺激的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控等方面；細(xì)胞組分主要涉及到膜筏、膜微域、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等位置；分子功能主要涉及到蛋白激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性等過程。

圖4 貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關(guān)性疲乏的GO富集分析

2.5 貞芪扶正顆粒成分-大腸癌相關(guān)性疲乏靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

應(yīng)用CytoScape 3.7.2構(gòu)建貞芪扶正顆粒成分-大腸癌相關(guān)性疲乏靶點-通路網(wǎng)絡(luò)見圖5。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度值較高的前5個藥物成分槲皮素(節(jié)點度值100)、木犀草素(節(jié)點度值46)、山柰酚(節(jié)點度值32)、β-谷甾醇(節(jié)點度值14)、毛蕊異黃酮(節(jié)點度值14)，可能為發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵成分，對其進行分子對接。

圖5 貞芪扶正顆粒有效成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接結(jié)果

選取核心靶點AKT1、JUN、MMP9、VEGFA與貞芪扶正顆粒中槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、毛蕊異黃酮活性成分進行分子對接。結(jié)合能＜0表示化合物與蛋白有結(jié)合能力，結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol表示化合物與蛋白結(jié)合良好，結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol表示化合物與蛋白結(jié)合能力極好[6]。分子對接結(jié)果見表4，顯示JUN與山柰酚、JUN與毛蕊異黃酮、JUN與木犀草素、MMP9與木犀草素之間有較強的結(jié)合力。利用PyMOL將配體中結(jié)合能最強的成分與靶點繪制成分與靶點對接模式圖見圖6，山柰酚與靶點JUN的ARG-155、DC-5009形成氫鍵，毛蕊異黃酮與靶點JUN的PRO-418形成氫鍵，木犀草素與靶點JUN的GLU-568、GLN-671形成氫鍵，與靶點MMP9的TYR-420形成氫鍵。

圖6 成分-靶點對接相互作用模式

表4 貞芪扶正顆粒關(guān)鍵活性成分與核心靶點的分子對接結(jié)果

3 討論

2020年癌因性疲乏歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會(European Society of Oncology Medicine，ESMO)指南指出，有65%的腫瘤患者伴隨CRF，在放療或化療期間疲乏發(fā)生率為80%～90%，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[7]。其病因及發(fā)病機制尚不明確，病因可能與腫瘤本身、腫瘤相關(guān)治療、并發(fā)癥、社會心理因素等相關(guān)，機制可能與細(xì)胞因子失調(diào)、下丘腦調(diào)節(jié)回路損壞、5-羥色胺(5-HT)失調(diào)、線粒體和肌肉失調(diào)、基因多態(tài)性等有關(guān)[8]。研究表明大腸癌患者在進行手術(shù)、化療治療后，普遍存在CRF[9-10]。貞芪扶正顆粒組方中黃芪為補藥之長，補氣固表；女貞子扶正固本、滋補肝腎，兩藥合用加強益氣健脾、滋陰補腎效果?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究黃芪主要有多糖類、皂苷類、黃酮類等化學(xué)成分，具有提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤等藥理作用[11]；女貞子含三萜類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類及黃酮類等化學(xué)成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛等活性[12]。張殿寶等[13]通過觀察120例大腸癌術(shù)后CRF患者，發(fā)現(xiàn)貞芪扶正顆?？擅黠@降低疲乏量表評分，提高機體免疫功能，改善疲乏癥狀。本次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)貞芪扶正顆粒作用機制可能有以下幾方面。

3.1 促進腫瘤細(xì)胞的凋亡

CRF可直接由惡性腫瘤產(chǎn)生并成為其直接癥狀[14]，本次研究中核心成分槲皮素可以使結(jié)腸癌大鼠caspase-3在內(nèi)的凋亡基因表達增加，Bcl-2等抗凋亡基因表達減少，促進結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[15]。木犀草素阻斷人體大腸癌HCT116細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，還可刺激奧沙利鉑處理的大腸癌細(xì)胞的增殖[16]。山奈酚促進了大腸癌HCT116和HCT15細(xì)胞中PARP的裂解和半胱氨酸蛋白酶caspase-8、-9、-3、磷酸化p38MAPK、p53、p21的激活[17]。毛蕊異黃酮可通過ERβ介導(dǎo)的EGFR-P13K-Akt/EGFR-MAPKs通路抑制結(jié)腸癌HCT116和HT29細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[18]。核心靶點AKT1激酶在腫瘤從生長演變?yōu)閻盒赞D(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用[19]。JUN與CRC細(xì)胞中的USP28啟動子結(jié)合，USP28可以穩(wěn)定ZNF304蛋白，該蛋白在KRAS突變的CRC患者中標(biāo)記一些抑制腫瘤生長的基因，使其關(guān)閉[20]。KEGG分析顯示貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關(guān)性疲乏的通路以癌癥的通路為主，有60個靶點作用于該通路。在一項觀察貞芪扶正顆粒對結(jié)直腸癌腫瘤生長的研究中，發(fā)現(xiàn)貞芪扶正顆?？梢詼p小結(jié)直腸癌模型小鼠腸內(nèi)腫瘤的尺寸及數(shù)量[21]。

3.2 改善線粒體和肌肉功能

患有慢性應(yīng)激的癌癥患者在體內(nèi)會不斷產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而在組織細(xì)胞中產(chǎn)生大量活性氧[22]，使線粒體呼吸和能量供應(yīng)減少，損害人體正常的有氧代謝和肌肉耐力，導(dǎo)致CRF的產(chǎn)生。核心成分槲皮素可以直接清除活性氧，也可以間接誘導(dǎo)超氧化物歧化酶產(chǎn)生谷胱甘肽，作為氫供體與結(jié)合，轉(zhuǎn)化為H2O2；同時調(diào)節(jié)非酶依賴性抗氧化防御系統(tǒng)途徑，導(dǎo)致活性氧水平降低[23]。木犀草素可以激活Nrf2/ARE信號通路降低活性氧[24]。研究表明貞芪扶正顆粒能夠提高超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽過氧化物GSH-Px水平，降低活性氧含量[25]。

3.3 調(diào)節(jié)細(xì)胞因子

腫瘤細(xì)胞釋放的炎癥細(xì)胞因子，在影響正常細(xì)胞代謝的同時，也刺激癌細(xì)胞生長，造成了機體機能下降，產(chǎn)生疲乏[14]。結(jié)直腸癌引發(fā)的遺傳損傷，使屏障惡化導(dǎo)致微生物產(chǎn)物侵入腺瘤，產(chǎn)生腫瘤引發(fā)的炎癥[26]。炎癥因子可激活誘導(dǎo)下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸，釋放皮質(zhì)類固醇激素增多促進機體的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致疲乏的產(chǎn)生[27]。某些炎性因子如IL-6、TNF-α與5-HT構(gòu)成反饋環(huán)路，5-HT可抑制炎性因子合成，當(dāng)炎性因子合成增加時，會使5-HT的釋放增加，癌癥病人長期處于病理狀態(tài)，機體反饋環(huán)路已經(jīng)紊亂，炎性因子的合成不受抑制，刺激5-HT的釋放，產(chǎn)生疲乏，同時5-HT水平會破壞HPA軸[28-29]。貞芪扶正核心成分槲皮素具有抗炎能力，可抑制CRC患者促腫瘤壞死因子TNF-α的釋放[30]。β-谷甾醇使細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8生成減少，機制是抑制表皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中炎癥小體NLRP3的激活，從而抑制CAS1產(chǎn)生及MAPK信號通路活化[31]。說明貞芪扶正顆粒可以通過直接抗炎、間接調(diào)控HPA軸，降低5-HT水平，改善疲乏狀態(tài)。核心靶點MMP9由于其蛋白水解活性，通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和存活、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、血管生成和腫瘤微環(huán)境的形成，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[32]。VEGFA的減少可能與慢性疲勞綜合征有關(guān)[33]。本次研究中細(xì)胞炎性因子、表皮生長因子受體EGFR均可刺激PI3K，進而催化細(xì)胞膜上3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)的產(chǎn)生，激活PI3K-AKT信號通路[34]。這與人參皂苷可以緩解老年大鼠疲勞綜合征，其機制與激活PI3K-AKT信號通路有關(guān)的研究相符合[35]。

本研究證實貞芪扶正顆粒中槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、毛蕊異黃酮核心成分作用于AKT1、JUN、MMP9、VEGFA靶點激活癌癥的通路、PI3K-AKT信號通路來治療大腸癌相關(guān)性疲乏。證明了貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關(guān)性疲乏的多成分、多靶點、多通路的特點，為貞芪扶正顆粒治療大腸癌相關(guān)性疲乏的機制研究及臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。