超高效液相色譜法測(cè)定羅漢果中7種成分含量*

彭可壟，彭晴菲，劉林慧，尹春萍

(1.重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，重慶 401121；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030)

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitiagrosuenorii(Swingle)的干燥果實(shí)，性甘，涼，歸肺、大腸經(jīng)，功能為清熱潤(rùn)肺，利咽開(kāi)音，滑腸通便，用于肺熱燥咳，咽痛失音，腸燥便秘[1]。目前，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的羅漢果相關(guān)藥品文號(hào)數(shù)量有100多個(gè)，應(yīng)用廣泛。羅漢果中葫蘆素類化合物具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、保肝、降血糖以及抗心肌肥大等多種藥理作用，主要用于治療腫瘤、肝臟疾病、炎癥、糖尿病和心血管疾病等[2-5]。此外，羅漢果皂苷Ⅴ還可作為難溶性藥物的載體，起到增溶作用[6]。研究表明[7]，除羅漢果皂苷Ⅴ外，羅漢果苷Ⅱe、羅漢果苷Ⅲe、羅漢果苷Ⅳe、11-O-羅漢果苷Ⅱe和羅漢果苷Ⅲ等化學(xué)成分有望成為羅漢果質(zhì)量標(biāo)志物(quality marker，Q-Marker)。羅漢果現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部收載的標(biāo)準(zhǔn)，含量測(cè)定中僅對(duì)羅漢果皂苷Ⅴ進(jìn)行控制，未對(duì)其他羅漢果苷類物質(zhì)進(jìn)行控制。YAN等[8]報(bào)道一種采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定5種羅漢果苷成分的方法，但該方法采用飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行含量測(cè)定，不適合作為常規(guī)的控制手段。為了能對(duì)羅漢果的其他成分進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，進(jìn)而為提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，需要一個(gè)可以同時(shí)測(cè)定羅漢果中多種成分的分析方法。高效液相色譜法特別是超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)由于具有柱效高，分離速度快的優(yōu)勢(shì)，在中藥含量檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[9]。筆者在本文建立UPLC法，可同時(shí)檢測(cè)羅漢果中的7種成分，為羅漢果藥材及制劑的質(zhì)量研究和控制提供可靠的分析方法。報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；Agilent 6460 LC-MS/MS三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；ME204E型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)；XP26型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.001 mg)；KQ500D型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TG-16高速離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司)；Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)。

1.2藥品與試劑 羅漢果皂苷V(含量：96.1%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111754-202104)；羅漢果對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121020-201807)；羅漢果對(duì)照藥材(北京萬(wàn)佳標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，批號(hào)：LG30025)；11-O-羅漢果苷Ⅴ( 含量：98%，批號(hào)：PRF7102401)，賽門苷Ⅰ(含量：98%，批號(hào)：PRF21012041)，羅漢果苷Ⅳ(含量：98%，批號(hào)：PRF20082144)，羅漢果苷Ⅲ(含量：98%，批號(hào)：PRF9013305)，羅漢果苷Ⅲe(含量：98%，批號(hào)：PRF10050641)，羅漢果苷Ⅱe(含量：98%，批號(hào)：PRF10083041)，均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純；羅漢果藥材來(lái)源于多個(gè)不同產(chǎn)地，經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院尹春萍副教授鑒定為羅漢果原果。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜與質(zhì)譜條件 以Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)為色譜柱；進(jìn)樣量為1 μL；柱溫為35 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；以水-乙腈(80：20)為流動(dòng)相A，以水-乙腈(10：90)為流動(dòng)相B， 梯度洗脫(0～2 min 100%A，2～10 min 100%A→90%A，10～11 min 90%A，11.01～16 min 100%B，16.01～18 min 100%A)；流速為每分鐘0.3 mL。質(zhì)譜定性鑒別采用電噴霧離子化源(electrospray ionization，ESI)；離子監(jiān)測(cè)模式為選擇離子監(jiān)測(cè)(selected ion monitoring，SIM)；監(jiān)測(cè)的離子為1307.8，1309.8，1147.8，1147.8，985.7，985.7和823.7；干燥氣溫度 300 ℃；干燥氣流速為每分鐘10 L；霧化氣壓力為50 psi；鞘氣溫度為300 ℃； 鞘氣流速為每分鐘10 L；傳輸毛細(xì)管電壓3500 V； 噴嘴電壓1000 V。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe、羅漢果苷Ⅱe對(duì)照品適量，用水-甲醇(40：10)溶解并稀釋制成含羅漢果皂苷Ⅴ對(duì)照品濃度為50 μg·mL-1的溶液，其他對(duì)照品為5 μg·mL-1混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 將羅漢果原藥材粉碎后，稱取藥材粉末約0.25 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入水40 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，用甲醇定容，搖勻，取適量，13000 r·min-1(離心半徑r=3 cm)離心5 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1紫外光譜和質(zhì)譜行為表征 稱取各對(duì)照品適量，精密稱定，用水-甲醇(40：10)溶解并定量稀釋制成含各組分濃度約為0.1 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，采用二極管陣列檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行各組分的紫外吸收光譜(ultraviolet absorption spectra，UV)和質(zhì)譜母離子掃描。采集各對(duì)照品主峰的UV光譜，各成分吸收峰波長(zhǎng)在193 nm。為避免低波段較大的干擾，因此參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版(一部)羅漢果藥材標(biāo)準(zhǔn)，選擇波長(zhǎng)203 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)；母離子掃描質(zhì)譜各組分均為[M+Na]+峰，質(zhì)荷比分別為1307.8，1309.8，1147.8，1147.8，985.7，985.7和823.7，采用選擇離子監(jiān)測(cè)模式對(duì)上述離子進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.2專屬性實(shí)驗(yàn) 分別進(jìn)樣空白溶液(水-甲醇40：10)、混合對(duì)照品溶液和羅漢果藥材溶液，記錄色譜圖，結(jié)果11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe、羅漢果苷Ⅱe依次出峰，空白溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.3檢測(cè)限和定量限 精密稱取對(duì)照品適量，用水-甲醇(40：10)配制各組分濃度約為0.5 μg·mL-1和0.25 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，作為定量限(limit of quantitation，LOQ)和檢測(cè)限(limit of detection，LOD)溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算各色譜峰的信噪比，定量限溶液色譜圖中各色譜峰的信噪比均>10，檢測(cè)限溶液色譜圖中各色譜峰的信噪比均>3。

2.3.4線性關(guān)系考察 精密稱取各對(duì)照品適量，用水-甲醇(40：10)配制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定各組分的峰面積，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，并計(jì)算各成分相對(duì)羅漢果苷Ⅴ的校正因子：校正因子=羅漢果苷Ⅴ線性斜率÷其他組分線性斜率。結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算色譜圖中11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.9%，1.6%，1.7%，0.6%，1.8%，1.5%和1.9%。

2.3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取羅漢果藥材同一份供試品溶液，于0，13，23和24 h進(jìn)樣檢測(cè)各組分的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD，11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe峰面積的RSD分別為0.6%，1.3%，1.2%，1.1%，1.3%，1.2%和2.1%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別取同一批次羅漢果對(duì)照藥材，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe的峰面積，計(jì)算得7種成分含量的RSD分別為1.7%，1.3%，2.0%，2.3%，2.2%，2.2%，1.5%。

2.3.8回收率實(shí)驗(yàn) 稱取羅漢果對(duì)照藥材0.25 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液并測(cè)定含量，作為原有量，平行測(cè)定3份，計(jì)算各組分原有量的平均值；另精密稱取各對(duì)照品適量，用水稀釋制成含羅漢果皂苷Ⅴ濃度為5 mg·mL-1的溶液(儲(chǔ)備液A)，11-O-羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ濃度為0.125 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液(儲(chǔ)備液B)，羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe濃度為0.125 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液(儲(chǔ)備液C)作為回收率儲(chǔ)備液。分別稱取9份羅漢果對(duì)照藥材0.25 g，每3份為一組，作為低、中、高濃度組，分別加入儲(chǔ)備液A 0.25 ，0.5和1 mL(相當(dāng)于羅漢果皂苷Ⅴ含量為0.5%，1.0%和2.0%)，儲(chǔ)備液B 0.2，2和8 mL(相當(dāng)于11-O-羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ和羅漢果苷Ⅲ含量為0.01%，0.1%和0.4%)，儲(chǔ)備液C 0.2，1和2 mL(相當(dāng)于羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe含量為0.01%，0.05%和0.1%)，用水補(bǔ)足至40 mL，照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液并按照各組分的對(duì)照品外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算測(cè)得量，按下式計(jì)算回收率，回收率(%)=(測(cè)得量-原有量均值)/加入量×100%。分別計(jì)算平均回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。另將回收率溶液色譜圖中除羅漢果皂苷Ⅴ外其他組分的峰面積乘以按照表1中的校正因子后，用羅漢果皂苷Ⅴ對(duì)照品溶液按加校正因子的外標(biāo)法測(cè)定各組分含量，計(jì)算平均值，結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表3。

A.空白溶劑UV色譜圖；B.混合對(duì)照UV色譜圖；C.對(duì)照藥材UV色譜圖；D.羅漢果藥材UV色譜圖；E.混合對(duì)照SIM色譜圖；F.對(duì)照藥材SIM色譜圖；1.11-O-羅漢果苷Ⅴ；2.羅漢果皂苷Ⅴ；3.賽門苷I；4.羅漢果苷Ⅳ；5.羅漢果苷Ⅲ；6.羅漢果苷Ⅲe；7.羅漢果苷Ⅱe。

表1 7種成分線性關(guān)系與范圍及校正因子

2.3.9相對(duì)保留時(shí)間的考察 以羅漢果皂苷Ⅴ峰為參照，分別考察不同條件下各組分的相對(duì)保留時(shí)間，包括調(diào)整流速為0.28和0.32 mL·min-1、柱溫為33和37 ℃、A相為水-乙腈78：22(比例1)和82：18(比例2)，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3.10樣品測(cè)定結(jié)果 取26批羅漢果藥材進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各組分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

3.1檢測(cè)指標(biāo)成分的選擇 在《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部羅漢果藥材標(biāo)準(zhǔn)中，采用羅漢果皂苷Ⅴ 作為羅漢果的含量指標(biāo)，限度為不低于0.5%。該指標(biāo)單一，無(wú)法全面反映羅漢果的藥材質(zhì)量。羅漢果中尚含有11-O-羅漢果苷Ⅴ，賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe及羅漢果苷Ⅱe等，因此，本文選擇羅漢果皂苷Ⅴ等7種成分作為指標(biāo)，進(jìn)行羅漢果質(zhì)量的考察。

3.2提取溶劑及提取方式的考察 《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部收載羅漢果含量測(cè)定方法，采用回流提取的方式進(jìn)行提取。筆者分別考察水、甲醇、乙醇、異丙醇等不同溶劑，超聲和回流提取等不同提取方式，以及不同溶劑體積的提取效果，結(jié)果表明以水為提取溶劑，采用超聲提取的方式，即可有效提取出本品中的目標(biāo)組分，相比《中華人民共和國(guó)藥典》收載的提取方法簡(jiǎn)單易行。

表2 7種成分回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 兩種定量方式的測(cè)定結(jié)果比較

表4 6種成分相對(duì)保留時(shí)間的考察結(jié)果

3.3色譜條件的選擇

3.3.1流動(dòng)相的選擇 由于各組分均為低波長(zhǎng)吸收，因此采用截止波長(zhǎng)較低的乙腈作為有機(jī)相；另外，為使流動(dòng)相可兼容質(zhì)譜分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行準(zhǔn)確定性，并為后續(xù)采用高分辨質(zhì)譜對(duì)更多的其他未知組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定預(yù)留空間，因此流動(dòng)相中未添加不揮發(fā)性的緩沖鹽。同時(shí)，由于甲酸、乙酸等揮發(fā)性緩沖鹽在低波長(zhǎng)下背景噪音較高，掩蓋目標(biāo)組分的色譜峰，因此也未使用。本文選用簡(jiǎn)單的乙腈-水體系作為流動(dòng)相體系，各組分峰型良好。

在采用該流動(dòng)相體系進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，出現(xiàn)信號(hào)很強(qiáng)的[M+Na]質(zhì)譜信號(hào)峰，[M+H]信號(hào)峰極弱，且在進(jìn)行碎片離子掃描時(shí)，碎片離子不明顯，可能的原因是由于各組分無(wú)明顯的酸堿基團(tuán)，在ESI電離源下很難形成[M+H]或[M-H]信號(hào)，反而出現(xiàn)了較強(qiáng)的[M+Na]信號(hào)峰，而碎片離子也同樣由于沒(méi)有穩(wěn)定的帶電形式，質(zhì)譜信號(hào)較弱。

3.3.2色譜柱和梯度的選擇 本試驗(yàn)首先采用Agilent SB C18(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)色譜柱，以高比例的水相作為起始比例，進(jìn)行梯度洗脫，通過(guò)調(diào)整梯度變化速率以實(shí)現(xiàn)各組分的分離，但運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)，因此選擇柱效更好的超高效液相色譜柱，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化梯度，建立了本方法。

3.3.3定量方式的選擇 本文除采用對(duì)照品外標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定外，尚測(cè)定各組分相對(duì)于羅漢果皂苷V的相對(duì)保留時(shí)間及校正因子，并對(duì)比采用對(duì)照品外標(biāo)法和校正因子法測(cè)定結(jié)果的差異，結(jié)果表明兩種計(jì)算方式的差異在10%以內(nèi)，差異較小。因此，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室完成方法確認(rèn)后，可按照相對(duì)保留時(shí)間對(duì)各組分進(jìn)行定位，采用校正因子法對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，節(jié)約對(duì)照品的使用。

3.4檢測(cè)結(jié)果的分析 本文檢測(cè)26種不同廠家和批次的羅漢果藥材，其中羅漢果皂苷Ⅴ的含量最高，除批次R外，均能滿足《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部收載的羅漢果標(biāo)準(zhǔn)的要求；11-O-羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ和羅漢果苷Ⅳ均在定量限0.01%以上，最小值為0.02%；羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe有部分樣品低于0.01%，整體含量較低；11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ和羅漢果苷Ⅲ的測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)[8]的測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)基本一致，表明本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠?；?6批次藥材的檢測(cè)結(jié)果，可以考慮將11-O-羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ和羅漢果苷Ⅳ增訂入羅漢果藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。另外，各組分的總量除K和R外，均>1%，也可酌情將總量訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

表5 26批羅漢果藥材中7種成分的含量測(cè)定結(jié)果

筆者采用超高效液相色譜法，對(duì)羅漢果中7種組分進(jìn)行測(cè)定，建立羅漢果中多組分的檢測(cè)方法，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)不斷完善本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從藥材的產(chǎn)地、種屬、采收季節(jié)等方面全面研究羅漢果藥材的質(zhì)量情況，以達(dá)到有效成分含量最高，臨床療效最優(yōu)的目標(biāo)。本文建立的羅漢果中多組分的分析方法，時(shí)間短，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，為羅漢果藥材的質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)提高提供了一定的指導(dǎo)意義。