補(bǔ)腎通絡(luò)方對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型Wnt信號通路及骨硬化蛋白的影響*

凌家艷，薛莎，馬威，楊文強(qiáng)，沈霖

(1.武漢市第一醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430033；2.武漢市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430033；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科， 武漢 430022)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一類以骨組織微結(jié)構(gòu)破損、骨密度降低、易骨折為特征的代謝性疾病[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP) 主要是由于雌激素水平降低造成骨轉(zhuǎn)換增加引起的骨量丟失。大量研究表明Wnt/β-catenin 信號通路是促進(jìn)骨形成的重要信號傳導(dǎo)通路，能夠調(diào)節(jié)骨量，成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的熱門靶點(diǎn)。在經(jīng)典Wnt信號通路中，β-catenin濃度調(diào)控處于中心地位[2]。Wnt與Frizzled受體結(jié)合并募集LRP5/6 受體，進(jìn)入胞內(nèi)促進(jìn) GSK-3β磷酸化，阻斷β-catenin降解，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[3]，促進(jìn)成骨。骨硬化蛋白(sclerostin) 是一種由SOST基因編碼的分泌型糖蛋白，主要由骨細(xì)胞表達(dá)，對骨組織有高度選擇性。它是 Wnt/β-catenin信號通路中重要的抑制劑[4]。sclerostin與Wnt信號通路的受體 LRP5/6具有高親和力，競爭性結(jié)合 LRP5/6抑制該信號通路，引起成骨減少[5]。

中醫(yī)學(xué)將PMOP歸屬于“骨痿”“骨痹”“骨枯”范疇。腎主骨生髓，絕經(jīng)后腎精漸衰，骨髓生化無源，骨骼失養(yǎng)，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。因此，補(bǔ)腎是治療PMOP的根本大法。目前研究表明補(bǔ)腎中藥復(fù)方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制表現(xiàn)在以下幾方面：調(diào)節(jié)雌激素水平，抑制破骨細(xì)胞活性[6]，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[7-8]，從而調(diào)節(jié)骨代謝。補(bǔ)腎通絡(luò)方是武漢市第一醫(yī)院名老中醫(yī)驗(yàn)方，由淫羊藿、杜仲、黃芪、生地、雞血藤、丹參、川牛膝組成，臨床觀察發(fā)現(xiàn)該方能緩解骨質(zhì)疏松癥狀，提高骨密度。但是，目前對于該方影響骨代謝的機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察補(bǔ)腎通絡(luò)方對去卵巢大鼠股骨Wnt/β-catenin 信號通路和sclerostin的影響，探討該方對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4個(gè)月齡無特定病原體(SPF)級雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量(300±20)g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，動(dòng)物合格證編號：No.42000600017472。動(dòng)物飼養(yǎng)于武漢市第一醫(yī)院動(dòng)物室內(nèi)，溫度22～26 ℃，相對濕度40%～50%，12 h間隔照明。自由攝食飲水，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)籠飼養(yǎng)4只。

1.2主要藥品與試劑

1.2.1實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)腎通絡(luò)方由淫羊藿15 g、杜仲10 g、黃芪10 g、生地10 g、雞血藤15 g、丹參10 g、川牛膝10 g組成。淫羊藿(批號：201609007)、杜仲(批號：201609014)、黃芪 (批號：201610014)、生地(批號：201610008)、雞血藤(批號：201609021)、丹參(批號：201610011)、川牛膝(批號：201609013)購自湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，經(jīng)武漢市第一醫(yī)院謝岱主任藥師鑒定為合格藥材，均符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。戊酸雌二醇片(Delpharm Lille SAS 公司，批號：266B)。

1.2.2試劑 Ⅰ型膠原氨基端前肽(propeptide of type I procollagen ，PINP)試劑盒(華美生物， 批號：CSB-E12774r)，Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列(type I collagen carboxyl terminal peptide beta special sequence，β-CTX)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(華美生物，批號：CSB-EQ027521RA)，Wnt3a(AFFINITY公司，批號：DF6113)、sclerostin(Abcam公司，批號：ab63097)、β-catenin(賽維爾生物，批號：GB11015)、β-actin(賽維爾生物，批號：GB12001)。

1.3儀器 臺式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force公司，型號：Neofuge 15R)、電泳儀(北京六一儀器廠，型號：DYY-6C)、酶標(biāo)儀(美國BioTek公司，型號：Epoch)、純水儀(型號：AJC-0501-P，美國)、脫水機(jī)(意大利DIAPATH公司，型號：Donatello)、病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016)、PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4動(dòng)物造模與給藥 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。參照文獻(xiàn)[9]采用經(jīng)典的雙側(cè)卵巢切除術(shù)制備，假手術(shù)組8只切除卵巢周圍少量脂肪組織。術(shù)后連續(xù)肌內(nèi)注射青霉素3 d。1周后連續(xù)5 d行陰道涂片檢查，無周期性變化，說明去勢成功。將造模成功動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組8只，即模型對照組、補(bǔ)腎通絡(luò)方大劑量組、補(bǔ)腎通絡(luò)方小劑量組、戊酸雌二醇組。中藥浸泡1 h，先用大火煎開，然后小火煎半小時(shí)，濾過，再加水同法二煎，兩次所得濾液混合后濃縮成藥物濃度0.72和1.44 g·mL-1，放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑa(bǔ)腎通絡(luò)方大劑量組按成人劑量灌胃14.4 g·kg-1，小劑量組灌胃7.2 g·kg-1，戊酸雌二醇組灌胃戊酸雌二醇溶液0.09 mg·kg-1。治療組各自按1 mL·(100 g)-1體質(zhì)量給予相應(yīng)的藥物灌胃，假手術(shù)組和模型對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥12周。

1.5股骨骨密度檢測 治療12周后，在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科進(jìn)行股骨骨密度檢測。將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，平置于雙能X線吸收測量儀平臺上，通過小動(dòng)物軟件測定骨密度。

1.6血清檢測 測完骨密度的第2天，大鼠麻醉下心臟取血，處死，進(jìn)行樣本采集。血液3000 r·min-1離心10 min(r=6 cm)分離得到血清。用ELISA方法檢測血清PINP和β-CTX。

1.7Western blotting檢測蛋白表達(dá) 取右側(cè)股骨骨干，保留骨膜和骨髓，用純化水反復(fù)沖洗，截成每份樣本1 g，置于盛有液氮的研缽里，置于離心管中。加入蛋白裂解液，冰浴30 min，10 000 r·min-1離心10 min(r=6 cm)。收集上清液，即為總蛋白溶液。行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳常規(guī)轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h。稀釋一抗4 ℃孵育抗體3 h ，用TBST洗3次，再將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min后，用TBST洗3次。將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合，將聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，放入暗匣中曝光，進(jìn)行顯影和定影。將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的吸光度(A)值。

1.8免疫組化染色 分離大鼠左側(cè)股骨，4%甲醛溶液固定 1 d，10%乙二胺四醋酸(ethylenediamine tetracetic acid，EDTA) 溶液脫鈣，常規(guī)石蠟包埋、切片。免疫組化染色，中性樹膠封片，觀察。利用IPP6.0圖像分析系統(tǒng)測定陽性細(xì)胞的積分吸光度值(integral absorbance，IA)。陽性細(xì)胞IA測定：在 400 倍視野下，每張切片選擇 5 處陽性細(xì)胞測定其平均A值，取其平均值為該切片陽性細(xì)胞的IA。

1.9實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)[real-time PCR(RT-PCR)]檢測mRNA表達(dá) 以β-actin為內(nèi)參，參照總RNA提取試劑盒說明書對右側(cè)股骨骨干骨膜及骨髓組織進(jìn)行總RNA提取。逆轉(zhuǎn)錄條件 42 ℃ 15 min；85 ℃，2 min。引物序列由上海生工生物工程上海股份有限公司合成(表1)，根據(jù) PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行操作，PCR擴(kuò)增條件為95 ℃ 5min ，95 ℃ 10 s ，57或60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，應(yīng)用CT值進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 β-catenin、Wnt3a、SOST引物序列

2 結(jié)果

2.1大鼠股骨骨密度比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組股骨骨密度明顯降低(P<0.01)，說明模型成功。與模型對照組比較，其他3組骨密度升高，雌激素組和補(bǔ)腎通絡(luò)方大劑量組升高明顯(P<0.01) ，見表2。

表2 5組大鼠治療后股骨骨密度比較

組別例數(shù)/只骨密度/[g·(cm2)-1]假手術(shù)組80.193±0.012模型對照組80.154±0.008①補(bǔ)腎通絡(luò)方 大劑量組80.179±0.014② 小劑量組80.163±0.015雌激素組80.187±0.01②F13.896P0.000

2.2各組大鼠治療后血清PINP、β-CTX比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組PINP降低(P<0.01)、β-CTX增高(P<0.01)，表明去勢后大鼠骨形成減少，骨吸收增加。與模型對照組比較，補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組PINP增高(P<0.01)，β-CTX明顯降低(P<0.01)。補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組與雌激素組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 5組大鼠治療后血清PINP和β-CTX比較

2.3各組大鼠股骨β-catenin、Wnt3a、sclerostin蛋白表達(dá) Western blotting結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型對照組β-catenin、Wnt3a蛋白表達(dá)量降低(均P<0.01)，sclerostin蛋白表達(dá)增高(P<0.05)。與模型對照組比較，補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組、雌激素組β-catenin、Wnt3a表達(dá)明顯增高(均P<0.01)，sclerostin蛋白表達(dá)下降(均P<0.01)。補(bǔ)腎通絡(luò)方大劑量組Wnt3a、β-catenin、sclerostin蛋白表達(dá)與雌激素組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.4各組大鼠股骨β-catenin、Wnt3a、sclerostin免疫組化結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型對照組Wnt3a、β-catenin的表達(dá)降低(均P<0.01)，sclerostin的表達(dá)增加(P<0.01)。與模型對照組比較，補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組、雌激素組Wnt3a、β-catenin 的表達(dá)明顯升高(均P<0.01)；補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組、雌激素組sclerostin 的表達(dá)明顯降低(均P<0.01)。補(bǔ)腎通絡(luò)方大劑量組β-catenin、Wnt3a、sclerostin表達(dá)與雌激素組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖 2-4，表4。

2.5各組大鼠股骨骨干組織中β-catenin、Wnt3a、SOSTmRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組 Wnt3a、β-catenin的mRNA表達(dá)水平降低，SOST的mRNA表達(dá)水平增高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組比較，補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組、雌激素組Wnt3a和β-catenin的 mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；SOST的mRA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，見表5。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是影響中老年婦女生活質(zhì)量的主要因素之一，其患病人數(shù)多、致傷致殘率高，己被公認(rèn)為世界性公共衛(wèi)生問題[6]。婦女絕經(jīng)后脾腎虧虛，臟腑氣血生化無源，致五臟皆衰，骨骼失養(yǎng)。氣虛無力推動(dòng)血脈致血瘀，脈絡(luò)不通，骨骼失養(yǎng)，發(fā)為骨痿。因此，腎精虧虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的根本原因，而血瘀是發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。文獻(xiàn)表明，左歸丸、右歸丸、二至丸等經(jīng)方及補(bǔ)腎為主的臨床驗(yàn)方，均能有效治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。李雪等[7]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方可發(fā)揮類似雌激素的作用，調(diào)節(jié)骨代謝，促骨形成，減少骨丟失，提高骨密度。章建華等[8]發(fā)現(xiàn)左歸丸可促成骨細(xì)胞增殖，與調(diào)節(jié)ERK1/2、Wnt/β-catenin通路有關(guān)。閔文等[9]認(rèn)為補(bǔ)腎通絡(luò)方(淫羊藿、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、蜈蚣、全蝎、茯苓、白芍、甘草等組成)能抑制RANKL/OPG 蛋白表達(dá)，抑制骨吸收。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.雌激素組；D.補(bǔ)腎通絡(luò)方大劑量組；E.補(bǔ)腎通絡(luò)方小劑量組；①與假手術(shù)組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01；③與假手術(shù)組比較，P<0.05。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.補(bǔ)腎通絡(luò)方大劑量組；D.補(bǔ)腎通絡(luò)方小劑量組；E.雌激素組。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.補(bǔ)腎通絡(luò)方大劑量組；D.補(bǔ)腎通絡(luò)方小劑量組；E.雌激素組。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.補(bǔ)腎通絡(luò)方大劑量組；D.補(bǔ)腎通絡(luò)方小劑量組；E.雌激素組。

表5 5組大鼠股骨中Wnt3a、β-catenin和SOST mRNA表達(dá)水平

補(bǔ)腎通絡(luò)方是武漢市第一醫(yī)院名老中醫(yī)驗(yàn)方，臨床療效顯著，有補(bǔ)腎填精、化瘀通絡(luò)之功。方中淫羊藿、杜仲溫陽補(bǔ)腎，共為君藥；雞血藤、丹參活血通絡(luò)，川牛膝逐瘀通經(jīng)利關(guān)節(jié)，共為臣藥；黃芪補(bǔ)氣健脾，生地養(yǎng)陰生精，又可緩解淫羊藿的辛熱，共為佐藥。諸藥合用，使腎陽得補(bǔ)，血脈暢通，筋脈、骨骼得養(yǎng)。李智奎等[10]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的淫羊藿苷通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)RUNX2、ALP和OPN的表達(dá)或者抑制PPARγ、Adipsin和FABP4的表達(dá)，從而促進(jìn)大鼠MSCs成骨分化，抑制其成脂分化作用。張賢等[11]認(rèn)為杜仲誘導(dǎo)BMSCs 成骨分化主要是通過對 Wnt/β-catenin 信號通路的調(diào)控，與 Fzd2及Fzd3受體、β-catenin蛋白、WIF1因子有關(guān)。黃芪甲苷能夠有效緩解氧化應(yīng)激介導(dǎo)的去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松，該作用可能與其調(diào)節(jié)FoxO3a/Wnt2/β-catenin通路有關(guān)[12]。

PINP和β-CTX是公認(rèn)的代表骨形成和骨吸收的標(biāo)志物，可以通過兩者判斷骨轉(zhuǎn)換率來評價(jià)療效[13]。本研究中模型對照組大鼠骨密度明顯低于假手術(shù)組，PINP降低、β-CTX增高，說明骨質(zhì)疏松癥模型成功。藥物干預(yù)后，補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組、雌激素組PINP增高，β-CTX明顯降低，各組骨密度也明顯增加。

經(jīng)典 Wnt/β-catenin 信號通路是調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育和維持骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要信號調(diào)節(jié)通路。該通路主要通過調(diào)控成骨細(xì)胞定向分化和特異性基因的表達(dá)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化， 促進(jìn)骨形成，調(diào)控骨重建。Wnt與Frizzled 受體結(jié)合并募集LRP5/6 受體，形成復(fù)合體進(jìn)入胞內(nèi)促進(jìn) GSK-3β磷酸化，阻斷β-catenin降解，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的濃度增高，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與 TCF/LEF 結(jié)合，進(jìn)而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。LRP5表達(dá)于成骨細(xì)胞的表面，它是Wnt蛋白的跨膜蛋白。sclerostin通過結(jié)合LRP5/6抑制該信號通路，阻斷其下游信號的傳遞，從而影響成骨細(xì)胞的分化并促進(jìn)其凋亡，導(dǎo)致成骨減少。本實(shí)驗(yàn)Western blotting和免疫組化結(jié)果表明，Wnt3a、β-catenin蛋白在模型對照組骨組織中表達(dá)最低，在補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組骨組織中表達(dá)高于模型對照組；sclerostin蛋白在模型對照組骨組織中表達(dá)最高，在補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組中的表達(dá)低于模型對照組。RT-PCR結(jié)果表明補(bǔ)腎通絡(luò)方大、小劑量組、雌激素組Wnt3a和β-catenin mRNA表達(dá)水平高于模型對照組，SOST的mRNA表達(dá)水平低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果提示補(bǔ)腎通絡(luò)方可能通過調(diào)控Wnt3a表達(dá)增高，抑制sclerostin蛋白的表達(dá)，上調(diào)Wnt/β-catenin 信號通路，促進(jìn)成骨。

綜上所述，補(bǔ)腎通絡(luò)方能提高骨量，激活 Wnt/β-catenin 經(jīng)典細(xì)胞信號通路，從而起到防治骨質(zhì)疏松癥的作用。在后續(xù)研究中，將通過體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)腎通絡(luò)方的作用機(jī)制，為該方的臨床推廣應(yīng)用提供依據(jù)。