小劑量氯胺酮聯(lián)用丁基苯酞的抗抑郁作用及其機(jī)制*

汪燕，楊玉，胡玲榕，陳春林

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，宜春 336000)

近年來，精神類疾病發(fā)病率日益增長，抑郁癥患者人數(shù)逐年上升，患者的發(fā)病和自殺也出現(xiàn)低齡化趨勢[1]。采取安全、有效的方法緩解癥狀、改善患者生命質(zhì)量一直是研究熱點(diǎn)。氯胺酮(ketamine，Ket)是一種N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體拮抗劑，能刺激腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)釋放，激活海馬組織中雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達(dá)，發(fā)揮快速抗抑郁作用[2-3]。但Ket抗抑郁作用劑量與產(chǎn)生類似精神分裂癥狀劑量相當(dāng)，且維持抗抑郁功效常需反復(fù)給藥，易導(dǎo)致藥物濫用，造成記憶缺陷[4]。丁基苯酞(n-butylphthalide，NBP)是從芹菜籽中提取的一種有效成分，能夠改善腦細(xì)胞能量代謝，保護(hù)腦神經(jīng)，常用于治療急性缺血性腦卒中[5]。研究表明，NBP可調(diào)節(jié)AKT/CREB信號通路，改善能量代謝[6]，且聯(lián)合用藥治療腦卒中后抑郁具有較好療效[7]。為了減少Ket用藥劑量，降低其不良反應(yīng)，筆者在本實(shí)驗(yàn)嘗試通過建立體內(nèi)、外急性抑郁模型，探究小劑量Ket聯(lián)合NBP抗抑郁效果，并采用蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞外信息調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、BDNF等相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化，考察聯(lián)合用藥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(pheo-chromocytoma cell，PC12)購于上海泰然生物科技有限公司。置于10%牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素和鏈霉素配置成的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng)。

1.1.2動(dòng)物 選用清潔級雄性的ICR小鼠，鼠齡6～8周，體質(zhì)量(22±2) g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0004。隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，每籠10只。室溫( 23±2) ℃，相對濕度 50%～65%。光照遵循自然規(guī)律，自由飲水、進(jìn)食。

1.1.3試劑 NBP(中國食品藥品檢定研究院，批號：201602，含量：99%)，Ket(福建古田藥業(yè)有限公司，批號：1709291)，皮質(zhì)酮(CORT)(阿拉丁生物科技有限公司，批號：11530027，含量：98%)，CCK-8(橋生物有限公司，批號：BRI141105)，Anti-BDNF Rabbit p Ab、Synapsin(成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號分別為：20200611，2020108)，P44/42 MAPK(Erk1/2)、p-P44/42 MAPK(Erk1/2)、β-actin(美國 Cell Signaling Technology公司，貨號分別為：21，30，1)。山羊抗鼠二抗(美國Jackson ImmunoResearch公司)。

1.1.4儀器 Imark 酶標(biāo)儀、Trans-Blot1703930 蛋白電泳儀，均購于美國Bio-Rad公司；Nikon ECLIPSE Ti2-U熒光倒置顯微鏡。

1.2分組給藥及抑郁模型的建立

1.2.1細(xì)胞分組給藥及建立CORT模型 參照文獻(xiàn)[8]。取對數(shù)生長的PC12細(xì)胞分成6組：空白對照組(細(xì)胞培養(yǎng)液)、模型對照組(CORT 400 μmol·L-1)、對照A組(CORT 400 μmol·L-1+NBP 1 μmol·L-1)、對照B組(CORT 400 μmol·L-1+Ket 0.01 μmol·L-1)、陽性對照組(CORT 400 μmol·L-1+Ket 0.1 μmol·L-1)、聯(lián)合組(CORT 400 μmol·L-1+Ket 0.01 μmol·L-1+NBP 1 μmol·L-1)。接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁，給予不同濃度(100，200，300，400，500 μmol·L-1)CORT溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2小鼠分組給藥及急性造模 參照文獻(xiàn)[9]。將40只小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為4組：模型對照組、NBP 組(30 mg·kg-1NBP[10])、Ket組(1 mg·kg-1Ket[11])、聯(lián)合組(30 mg·kg-1NBP+1 mg·kg-1Ket )，隨機(jī)分組具體方法：將小鼠稱質(zhì)量并標(biāo)記，按質(zhì)量大小分區(qū)，再將各區(qū)組小鼠隨機(jī)平均分配到各組[11]。NBP采用油溶，灌胃給藥，Ket用0.9%氯化鈉溶液溶解，腹腔注射給藥。模型對照組給予等量食用油和0.9%氯化鈉溶液。

1.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

1.3.1CCK-8法檢測細(xì)胞活力 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μmol·L-1CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定其吸光度(A值)，細(xì)胞存活率(%)=(A值實(shí)驗(yàn)組-A值調(diào)零組)/(A值對照組-A值調(diào)零組)×100%。

1.3.2細(xì)胞突觸形態(tài)觀察 將細(xì)胞接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，于倒置顯微鏡(×20)下觀察細(xì)胞突觸生長形態(tài)并拍照。隨機(jī)取5個(gè)視野，選擇軸突大于胞體的細(xì)胞，測量軸突長度，取其平均值。

1.3.3細(xì)胞蛋白的收集 以每皿2×107個(gè)細(xì)胞接種到100 mm培養(yǎng)皿中，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行給藥，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的 0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后收集蛋白，離心10 min(12 000×g，4 ℃)，取上清液于-80 ℃保存。

1.3.4Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測synapsin蛋白表達(dá) 采用 Bradford法進(jìn)行蛋白定量，BSA檢測蛋白濃度，稀釋成統(tǒng)一濃度后置于100 ℃沸水中煮5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，將蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)緩沖液轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，在5%脫脂奶粉的 TBST 溶液中封閉1～1.5 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3次，二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，取出滴加適量顯影液，用Alpha Fluor Chem 凝膠成像儀檢測。

1.4小鼠行為學(xué)檢測

1.4.1強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)測定不動(dòng)時(shí)間 強(qiáng)迫游泳(forced swim experiment，F(xiàn)ST)實(shí)驗(yàn)建立急性抑郁模型。FST裝置由內(nèi)徑為14 cm，高20 cm，水深15 cm燒杯組成，水溫(23±2 )℃[13]。實(shí)驗(yàn)前24 h預(yù)游泳15 min。給藥30 min后，將小鼠置于燒杯中6 min，觀察后4 min累計(jì)不動(dòng)時(shí)間(s)。

1.4.2曠場實(shí)驗(yàn)測定水平爬格數(shù)和直立次數(shù) 曠場由四周均為黑色，且長、寬、高均為 50 cm敞箱構(gòu)成[14]，實(shí)驗(yàn)前將小鼠置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1～2 h。給藥30 min后置于敞箱中間。記錄小鼠在5 min內(nèi)的水平爬格數(shù)與直立次數(shù)。每只小鼠記錄完成后需用乙醇擦拭，防止留下氣味對實(shí)驗(yàn)造成干擾。

2 結(jié)果

2.1CORT對PC12細(xì)胞存活率的影響 細(xì)胞存活率隨CORT濃度增大逐漸降低，見表1，當(dāng)CORT濃度為400 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活性損傷相對穩(wěn)定，且均能導(dǎo)致約半數(shù)細(xì)胞死亡，可用于建立細(xì)胞損傷體外抑郁模型。

表1 不同濃度皮質(zhì)酮對PC12細(xì)胞存活率的影響

濃度/(μmol·L-1)細(xì)胞存活率/%0100.00±0.0010084.82±8.63①20070.27±1.45①30060.74±1.92①40053.63±2.25①50052.66±1.77①

2.2PC12細(xì)胞存活率 與模型對照組比較，對照A組、對照B組對細(xì)胞存活率無明顯作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，兩者聯(lián)用能夠顯著改善細(xì)胞存活率，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 不同給藥方式對CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷作用的影響

2.3PC12細(xì)胞神經(jīng)元損傷情況 各組細(xì)胞形態(tài)見圖1。與模型對照組比較，對照A組、對照B組對細(xì)胞神經(jīng)元均無明顯作用，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩者聯(lián)用逆轉(zhuǎn)細(xì)胞神經(jīng)元損傷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

2.4PC12損傷細(xì)胞蛋白表達(dá)

2.4.1PC12損傷細(xì)胞p-ERK/ERK表達(dá) 與對照組比較，模型對照組損傷細(xì)胞p-ERK/ERK的表達(dá)明顯下調(diào)。與模型對照組比較，對照A組、對照B組單藥組對p-ERK/ERK表達(dá)均無明顯作用(P>0.05)，兩者聯(lián)用能夠提高p-ERK/ERK蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.4.2PC12損傷細(xì)胞BDNF蛋白的表達(dá) 與對照組比較，模型對照組損傷細(xì)胞BDNF的表達(dá)明顯下調(diào)。與模型對照組比較，對照A組、對照B組單藥組對BDNF表達(dá)均無明顯作用，兩者聯(lián)用能夠抑制BDNF蛋白表達(dá)的減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4.3PC12損傷細(xì)胞synapsin蛋白的表達(dá) 與對照組比較，模型對照組損傷細(xì)胞synapsin的表達(dá)明顯下調(diào)。與模型對照組比較，對照A組、對照B組單藥組對synapsin表達(dá)均無明顯作用，兩者聯(lián)用能夠緩解synapsin蛋白的下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.對照A組；D.對照B組；E.陽性對照組；F.聯(lián)合組

表3 不同給藥方法對CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷神經(jīng)元突觸長度的影響

2.5小鼠行為學(xué)變化 ①對小鼠FST累計(jì)不動(dòng)時(shí)間的影響：與模型對照組比較，NBP 組、Ket組單劑量給藥緩解小鼠在FST中的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩者聯(lián)用降低小鼠在FST中累計(jì)不動(dòng)時(shí)間療效顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。②對小鼠水平爬格次數(shù)和直立次數(shù)的影響：各組之間小鼠水平爬格數(shù)與直立次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表4，說明急性給藥后對于小鼠自主活動(dòng)能力無顯著影響。

3 討論

PC12細(xì)胞來源大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究[15]。CORT 作為一種腎上腺皮質(zhì)激素，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測，慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠體內(nèi)CORT水平升高，BDNF合成障礙[16]。本實(shí)驗(yàn)以CORT誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷建立體外抑郁模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CORT濃度為400 μmol· L-1時(shí)，細(xì)胞損傷均約為50%，可產(chǎn)生神經(jīng)毒性，用于后續(xù)造模。FST是經(jīng)典的評價(jià)抗抑郁藥效的急性應(yīng)激造模方法，小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間常作為評價(jià)抑郁癥行為的指標(biāo)[17]。本項(xiàng)研究嘗試通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討NBP對小劑量Ket抗抑郁作用及機(jī)制的影響，結(jié)果證明NBP(1 μmol· L-1)聯(lián)合小劑量Ket(0.01 μmol·L-1)能夠顯著改善CORT誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的存活率，促進(jìn)神經(jīng)元增長，顯著降低小鼠在FST累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，提高小劑量Ket的抗抑郁活性。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.對照A組；D.對照B組；E.陽性對照組；F.聯(lián)合組；①與空白對照組比較，t=10.011，P<0.05；②與模型對照組比較，t=-2.368，-2.298，P<0.05。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.對照A組；D.對照B組；E.陽性對照組；F.聯(lián)合組；①與空白對照組比較，t=6.576，P<0.05；②與模型對照組比較，t=-3.709，-1.713，P<0.05。

BDNF是中樞神經(jīng)重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體情緒和認(rèn)知功能[18]。研究表明，BDNF及其他神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏導(dǎo)致的神經(jīng)損傷是抑郁癥發(fā)病的病理基礎(chǔ)[19]。因此，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)BDNF水平常作為抗抑郁活性指標(biāo)[20]。ERK是BDNF上游的信號通路，可通過調(diào)節(jié)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CAMP-response element binding protein，CREB)的磷酸化，影響B(tài)DNF水平[21]。因Ket能夠刺激BDNF的釋放，激活mTOR的表達(dá)，且NBP能夠調(diào)節(jié)AKT/CREB信號通路。由此可推測NBP與Ket的抗抑郁作用均可通過ERK-BDNF通路產(chǎn)生協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)為探究聯(lián)合作用機(jī)制，經(jīng)Western blotting法檢測NBP對小劑量Ket在PC12損傷細(xì)胞中p-ERK/ERK、BDNF和synapsin蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果證實(shí)，NBP聯(lián)合小劑量Ket能夠促進(jìn)CORT誘導(dǎo)損傷細(xì)胞中p-ERK/ERK、BDNF、synapsin蛋白的表達(dá)。

綜上所述，NBP能夠提高小劑量Ket的抗抑郁活性，探究作用機(jī)制可能與ERK-BDNF信號通路相關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)雖從體內(nèi)外考察NBP對小劑量Ket抗抑郁作用及機(jī)制的影響，但實(shí)驗(yàn)仍存在不足，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)采取相關(guān)蛋白質(zhì)抑制劑驗(yàn)證其作用機(jī)制。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.對照A組；D.對照B組；E.陽性對照組；F.聯(lián)合組；①與空白對照組比較，t=7.543，P<0.05。

表4 4組小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間

分組劑量/(mg·kg-1·d-1)FST/s水平爬格次數(shù)直立次數(shù)模型對照組-177.6±17.33192.00±44.0356.88±12.17NBP組30145.40±17.50183.40±33.6369.00±15.59Ket組1147.90±31.70185.10±56.2866.50±13.97聯(lián)合組30+1119.90±41.45①161.50±39.1772.50±21.97