新型PI3K 抑制劑HYY 化合物的合成及抗腫瘤活性研究★

梁 青，李偉林，鄭學(xué)良，馬 耀

（山西省化工研究所（有限公司），山西 太原 030021）

引言

磷脂酰肌醇3-激酶（簡(jiǎn)稱(chēng)為PI3K）抑制劑由于參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)而成為小分子腫瘤靶向治療的明星靶點(diǎn)[1-3]，當(dāng)前已有4 個(gè)PI3K 類(lèi)小分子靶向新藥FDA 批準(zhǔn)上市，數(shù)十種進(jìn)入臨床階段的PI3K 類(lèi)小分子靶向新藥[4-6]。

由于氟原子的電負(fù)性強(qiáng)并且氟原子半徑與氫原子半徑接近，因此將其作為基團(tuán)引入到分子中只是對(duì)藥物分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了些微調(diào)整，從而改變了藥物代謝的途徑和速度，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，提高生物選擇性[7-8]。在藥物化學(xué)中，氟代是最常用，最有效的一種結(jié)構(gòu)修飾方法[9]。

本文以PI3K 類(lèi)小分子靶向抑制劑IC-87114 為先導(dǎo)化合物，通過(guò)現(xiàn)有的藥物篩選平臺(tái)，以氟取代氫，經(jīng)電化學(xué)一步反應(yīng)合成IC-87114 的氟代化合物，名為HYY 系列化合物，并對(duì)其體外的抗腫瘤活性進(jìn)行研究，旨在發(fā)現(xiàn)活性更好的目標(biāo)化合物，為今后開(kāi)展臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AM-600 型核磁共振波譜儀，NMR，TMS 為內(nèi)標(biāo)，DMSO 為溶劑，瑞士Bruker 公司；Micro API 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Waters 公司；PrimoVert iLED 熒光級(jí)倒置顯微鏡，德國(guó)Zeiss 公司；Puri-Master 2000 全自動(dòng)制備色譜儀，上?？普苌萍加邢薰?；FD-1C-80 型超低溫真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；3111 型水套式CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo 公司；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司。

IC87114，購(gòu)自上海SELLECK 公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620、人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3、人肝癌細(xì)胞Hep-G2、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 和人宮頸癌細(xì)胞Hela，均購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清（FBS），購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HYY 系列化合物的制備

本實(shí)驗(yàn)以IC-87114 為原料、乙腈（ACN）/乙二醇二甲醚（DME）/聚乙二醇（PEG）為溶劑，通過(guò)自有的藥物篩選平臺(tái)，采用電化學(xué)反應(yīng)一步加氟法合成HYY 系列化合物HYY001 和HYY002（主產(chǎn)物），合成路線如圖1 所示。將5 mg IC87114 加入到10 mL 含電解質(zhì)的ACN/DME/PEG 溶液，超聲溶解，將該溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯電解槽，采用Ni/Pt 作電極，通電反應(yīng)一段時(shí)間，LC-MS 監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。

圖1 HYY 系列化合物的合成路線

1.2.2 體外腫瘤活細(xì)胞生長(zhǎng)抑制研究

CCK-8 法常用于測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞增殖及抑制的影響[10-11]。本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8 法測(cè)定HYY 系列化合物對(duì)多種細(xì)胞株（HT-29、SW620、MDA-MB-468、SK-OV-3 Hep-G2、A549 和Hela）的抗腫瘤活性情況，設(shè)置IC87114 為對(duì)照組，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性較好的目標(biāo)化合物提供參考依據(jù)。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株均接種于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，且在37 ℃、5%CO2的水套式二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

將待測(cè)化合物以DMSO 助溶后，使用培養(yǎng)基配成初始濃度為100 μmol/L 并以此3 倍遞減至終濃度為0.003 μmol/L 的工作液，存放于4 ℃冰箱保存，供測(cè)試受試化合物進(jìn)行所選細(xì)胞株增殖抑制實(shí)驗(yàn)使用。

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞懸液濃度，隨后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104cell/mL，接種于96 孔板，每孔加入100μL；置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入配好的待測(cè)化合物梯度溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；棄液，加入10%CCK-8的培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h～4 h。選擇450 nm 波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值。以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，通過(guò)軟件計(jì)算IC50 值，以IC50 值表示藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 合成工藝優(yōu)化

本文以溶劑、電極、電解質(zhì)和電流為四因素，選取不同水平，以主產(chǎn)物HYY002 產(chǎn)率（原料產(chǎn)物比）為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)方法，優(yōu)化HYY 系列化合物的合成工藝，因素-水平和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2 正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果可知，各反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)率影響因素大小分別為：電解質(zhì)＞溶劑＞電極≈電流。正交實(shí)驗(yàn)指標(biāo)為主產(chǎn)物HYY002 的產(chǎn)率s/p（原料產(chǎn)物比，LC-MS 計(jì)算），指標(biāo)s/p 值越低產(chǎn)率越高，即指標(biāo)值越低越好，因此選擇每個(gè)因素的最小值K1、K2、K3對(duì)應(yīng)水平。由于A 因素列K2＜K1＜K3，B 因素列K2＜K3＜K1，C 因素列K1＜K3＜K2，D 因素列K3＜K2＜K1，所以本實(shí)驗(yàn)的最佳工藝條件為A2B2C1D3，即，DME 作溶劑，Et4NF.4HF 作電解質(zhì)，Ni 作電極，0.03A電流為本實(shí)驗(yàn)的最佳工藝條件。按最佳工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得出的產(chǎn)率s/p 為5.1，且重復(fù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率基本一致，說(shuō)明最佳工藝具有可重現(xiàn)性。

反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液經(jīng)液相制備儀純化后通過(guò)超低溫真空冷凍干燥機(jī)凍干后得到白色粉末，產(chǎn)率約為10%。

2.2 目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)表征

HYY001：1H NMR δ 8.05（s,1H），7.78（s,2H），7.62（s，1H），7.48（d，J=22.8 Hz，4H），7.28（dd，J=44.8，6.0 Hz，2H），5.05（d，J=17.3 Hz，1H），4.69（d，J=17.0 Hz，1H），2.73（s，3H），2.16（s，3H);LC-MS，m/z:[M+H]+416。

HYY002：1H NMR δ 8.06（d，J=10.9 Hz，2H），7.62（t，J=7.7 Hz，1H），7.55（s，1H），7.39（d，J=8.9 Hz，1H），7.34-7.27（m，2H），7.24（m，3H），5.10（d，J=17.3 Hz，1H），4.81（d，J=17.3 Hz，1H），2.73（s，3H），2.16（s，3H）;LC-MS，m/z:[M+H]+416。

2.3 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

表3 為HYY 系列化合物對(duì)多種癌細(xì)胞的抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果。如表3 所示，HYY001 和HYY002 都有一定的抗腫瘤活性。HYY001 和HYY002 對(duì)HepG2、SW620、MDA-MB-468、HT-29 細(xì)胞的抑制效果都明顯優(yōu)于IC87114 對(duì)照組；其中抑制效果更為突出的是HYY002，其對(duì)HT-29、SW620 和MDA-MB-468細(xì)胞的抑制活性優(yōu)于HYY001，IC50 值分別為52.1μM，43.7 μM和78.3 μM；HYY002 對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制效果與HYY001 相近，均優(yōu)于IC87114 對(duì)照組。初步證實(shí)，HYY 系列化合物HYY001 和HYY002 均能明顯抑制多種癌細(xì)胞增殖且整體抑制效果較IC87114明顯，其中HYY002 抑制效果更為明顯，可作為目標(biāo)化合物開(kāi)展深入研究。

表3 HYY 系列化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

為了給PI3K 類(lèi)抗腫瘤藥物提供新的目標(biāo)化合物，本研究采用電化學(xué)手段一步加氟反應(yīng)，將IC87114 結(jié)構(gòu)中氫替換成氟，得到2 種取代位置不同的HYY 系列含氟化合物。通過(guò)四因素三水平L934 正交實(shí)驗(yàn)研究了HYY 系列化合物的最佳工藝為DME溶劑，Et4NF.4HF 電解質(zhì)，Ni 電極，0.03A 電流。通過(guò)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性評(píng)價(jià)，合成的HYY 系列化合物均具有明顯的抗腫瘤活性，且HYY002 抑制效果整體較IC87114 和HYY001 更為明顯。但本文設(shè)計(jì)的合成工藝在最佳條件下產(chǎn)率仍較低，可通過(guò)更換電解質(zhì)的方法更好地提高化合物HYY002 產(chǎn)率。今后將在提高HYY002 產(chǎn)率的基礎(chǔ)上，將其作為目標(biāo)化合物，繼續(xù)研究評(píng)估動(dòng)物體內(nèi)藥效和毒性等相關(guān)特性。