高效液相色譜-二極管陣列檢測器法測定復(fù)方丹參片中12種成分及摻偽鑒別

范可青，凌 霞

（湖北省襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北 襄陽 441000）

復(fù)方丹參片是由丹參、三七、冰片制成的中藥復(fù)方制劑.《中華人民共和國藥典》（一部2020年版）在其含量測定項下，分別對丹參酮ⅡA、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1及人參皂苷Re進行了限定，以控制藥品質(zhì)量[1-2].近年來，研究表明丹參中其它的有效成分，如丹參酮Ⅰ、丹參素鈉、迷迭香酸、原兒茶醛、原兒茶酸等，也具有一定的藥理作用[3-10].但常有不法分子以三七莖葉替代三七投料，而人參皂苷Rb3作為三七莖葉中特有的人參皂苷成分，可以將其作為指標(biāo)鑒別三七莖葉和三七[11-12].高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法可進行190～800 nm的全波長掃描，得到包含運行時間、波長值和吸收值等信息的三維圖譜，結(jié)合色譜峰純度鑒定、光譜圖檢索等功能，為目標(biāo)物的定性、定量分析提供更豐富的信息，廣泛應(yīng)用于食品、藥品檢測等領(lǐng)域.本文采用HPLCDAD法對復(fù)方丹參片中12種成分進行含量測定，極大地降低分析時間，同時也大大提高對復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制.

表 1 線性關(guān)系Table 1 Linear relationship

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)，SPD-M20A二極管陣列檢測器，Inertsil ODS-3液相色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)（均產(chǎn)自島津制作所）.

丹參素鈉（110855-201614）、原兒茶酸（110867-201607）、原兒茶醛（110810-201608）、迷迭香酸（111871-201706）、丹酚酸B（111562-201716）、三七皂苷R1（110745-201820）、人參皂苷Rg1（110703-201832）、人參皂苷Re（110754-201626）、人參皂苷Rb1（110704-201726）、人 參 皂 苷Rb3（111686-201504）、丹參酮ⅡA（110766-201721），丹參對照藥材（120923-201615），三 七 對 照 藥 材（120941-201409），以上對照品、對照藥材均來源于中國食品藥品檢定研究院；丹參酮I（BWB50261-113107）來源于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司.42批次的復(fù)方丹參片來源于國內(nèi)18家不同生產(chǎn)企業(yè).乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純.

1.2 混合對照品儲備溶液的制備

取丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、丹參酮I、丹參酮IIA這12種對照品適量，精密稱定，加少量甲醇超聲溶解后，再加入50%甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品儲備溶液.

1.3 供試品溶液的制備

取本品10片，除去包衣，研細(xì)，稱取約1 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取濾液，即得.

1.4 色譜條件

柱溫為40 ℃；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0.01～95.00 min，5% A→55% A；95.01～115.00 min，5% A）；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；化合物檢測波長如表1所列.人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的分離度應(yīng)大于1.5.在上述色譜條件下，對照品和樣品的色譜圖如圖1所示.

圖1 對照品和樣品的色譜圖（1）丹參素鈉，（2）原兒茶酸，（3）原兒茶醛，（4）迷迭香酸，（5）丹酚酸B，（6）三七皂苷R1，（7）人參皂苷Rg1，（8）人參皂苷Re，（9）人參皂苷Rb1，（10）人參皂苷Rb3，（11）丹參酮I，（12）丹參酮IIAFig.1 Chromatograms of reference substance and sample

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

分別精密量取“1.2”項下混合對照品儲備溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，使用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照溶液.吸取上述混合對照溶液10 μL，按“1.3”項下色譜條件測定色譜峰面積.以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對照品進樣量（X）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸分析，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表1所列.

2.2 精密度

精密量取“1.2”項下混合對照品儲備溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，使用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照溶液.吸取混合對照溶液10 μL，按“1.3”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定色譜峰峰面積.結(jié)果顯示，混合對照溶液中丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、丹參酮I、丹參酮IIA的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）分別為0.7%、0.9%、0.8%、0.9%、0.8%、1.2%、1.1%、1.2%、1.1%、1.2%、0.8%、0.9%.結(jié)果表明儀器的精密度良好.

2.3 穩(wěn)定性

精密量取“1.2”項下混合對照品儲備溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，使用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照溶液.吸取混合對照溶液10 μL，按“1.3”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、18、24 h進樣，測定各個色譜峰峰面積.結(jié)果顯示，混合對照溶液中丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、丹參酮I、丹參酮IIA的峰面積RSD分別為0.8%、0.8%、0.7%、0.9%、0.8%、1.3%、1.3%、1.1%、1.3%、1.1%、0.8%、0.9%.結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.4 回收率

取同一批次復(fù)方丹參片樣品3份，每份加入低、中、高3個濃度的對照品溶液適量，按“1.2”項下方法制備，按“1.3”項下色譜條件進行測定，分別計算回收率.結(jié)果顯示，12種成分的回收率在96.1%～99.8%之間，結(jié)果如表2所列.

2.5 樣品的含量測定

本次試驗42批次復(fù)方丹參片，按照“1.2”項下方法制備，按“1.3”項下色譜條件進行測定，部分檢測結(jié)果如表2所列.結(jié)果出現(xiàn)了不同廠家及同一廠家不同批次樣品間的含量差異較大的情況，這可能與丹參、三七原藥材的質(zhì)量及提取加工處理等有關(guān).復(fù)方丹參片作為治療冠心病、心絞痛等心臟疾病的基本藥物之一，其有效成分含量波動較大，應(yīng)當(dāng)引起生產(chǎn)廠家及藥品監(jiān)管等相關(guān)部門的重視.

表 2 回收率Table 2 Recovery

3 結(jié)論

復(fù)方丹參片雖然處方簡單，但制劑種類及規(guī)格較多，且各生產(chǎn)廠家的原料及工藝水平不一，造成了藥品質(zhì)量參差不齊.《中華人民共和國藥典》（一部2020年版）規(guī)定了丹參酮ⅡA、丹酚酸B、三七3個項目，但檢驗是否摻有三七莖葉時還需按照國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn)件（批準(zhǔn)件編號2008010）的補充檢驗方法，整個檢驗過程不僅耗時耗力，還加大了有機試劑的用量，加重了環(huán)境污染.由于復(fù)方丹參片含有脂溶性和水溶性成分，因此樣品提取時，采用溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、25%、50%、75%、100%的甲醇，超聲時間15、30、45 min進行正交試驗，發(fā)現(xiàn)50%甲醇與30 min提取效果最佳，其他的組合導(dǎo)致脂溶性或水溶性成分提取不充分.本文采用HPLCDAD法測定復(fù)方丹參片中12種成分的含量，極大地降低了分析時間，解決了上述弊端，可以提高對復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制.