基于芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵技術(shù)提高廣西河池C4F煙葉品質(zhì)的研究

薛云，寧振興，蘇贊，劉啟斌，王敏，毛多斌，龍章德，魏濤

1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，廣西 南寧 530004；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

廣西河池地區(qū)C4F煙葉因雜氣重、吸味品質(zhì)較差等缺點，致使在卷煙葉組配方中的使用率較低。為了提高該地區(qū)煙葉利用率，需要對其吸味品質(zhì)進行改善。已有研究表明利用微生物對不適用煙葉進行處理是改善煙葉品質(zhì)的重要方式之一[1-3]。在一定條件下，微生物通過自身代謝可以將煙葉中的大分子化合物(如淀粉、蛋白質(zhì)、果膠和纖維素等)降解為單糖和氨基酸等小分子化合物，這些小分子化合物經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化，生成醇類、醛類、酸類、酯類和酮類等香味成分，對于提升煙葉吸食品質(zhì)具有重要價值和意義[4-5]。

鄭小嘎[6]篩選得到4株誘香增質(zhì)效果較好的真菌菌株，該菌株處理過的煙葉化學(xué)成分更趨協(xié)調(diào)，香氣質(zhì)和香氣量得分均高于對照組，余味更加舒適，雜氣和刺激性減??；胡志忠等[7]利用產(chǎn)香酵母對貴州煙葉進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在最佳發(fā)酵條件下，新增的多種重要致香物質(zhì)(包括糠醇、金合歡醇、β-環(huán)檸檬醛等)可以有效改善煙葉品質(zhì)；黃靜文等[8]利用短小芽孢桿菌Van35處理煙葉后，能降低煙葉煙堿、蛋白質(zhì)含量等，顯著增加煙香、降低刺激性、醇和煙氣，改善卷煙吸味；鞏效偉等[9]用產(chǎn)香微生物CXJ-3枯草芽孢桿菌、CXJ-7西姆芽孢桿菌和CXJ-12短小芽孢桿菌及其復(fù)合菌劑分別處理梗絲，與對照相比，梗絲的總糖、還原糖和揮發(fā)性香氣成分的含量均顯著提升，其中復(fù)合菌劑處理樣品的揮發(fā)性成分含量提升最為明顯，達141.466 μg/g；余玉莎等[10]用產(chǎn)香真菌米根霉對煙葉進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)能增加煙葉中部分致香成分的含量。

綜上所述，利用微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)處理煙葉是目前改善煙葉品質(zhì)的重要方法之一，芽孢桿菌和酵母菌是煙葉固態(tài)發(fā)酵中的常用菌株[11-13]。目前還未見利用微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)來改善廣西河池C4F煙葉品質(zhì)的相關(guān)報道。鑒于此，本研究擬選取河池C4F煙葉為研究對象，利用前期篩選獲得的芽孢桿菌對其進行固態(tài)發(fā)酵處理，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗確定最佳發(fā)酵條件，對比分析發(fā)酵后煙葉常規(guī)化學(xué)成分和致香成分的變化，結(jié)合感官評吸技術(shù)評價發(fā)酵后的煙葉吸食品質(zhì)，為改善廣西河池C4F煙葉品質(zhì)、提升其利用率的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要試劑：Brij 35溶液(聚乙氧基月桂醚)、二氯異氰尿酸鈉，北京百靈威科技有限公司產(chǎn)；硼酸鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；二氯甲烷，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；鹽酸，煙臺市雙雙有限公司產(chǎn)。

主要儀器：400 g多功能粉碎機，上海樹立儀器儀表有限公司產(chǎn)；KQ-700DE數(shù)控超聲儀,昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)；AA3連續(xù)流動分析儀，德國SEAL公司產(chǎn)；同時蒸餾萃取裝置，鄭州科技玻璃儀器廠產(chǎn)；DLSB-1020低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州國瑞儀器有限公司產(chǎn)。

實驗材料：廣西河池地區(qū)C4F煙葉，由廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供，將煙葉粉碎過40目分樣篩后制成樣品備用。芽孢桿菌ZZ-8(Bacillussp. ZZ-8)，由鄭州輕工業(yè)大學(xué)實驗室從河南初烤煙葉中篩選獲得并保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)從-80 ℃冰箱中取出ZZ-8菌株，轉(zhuǎn)接固體LB培養(yǎng)基，在30 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)12 h。挑選較大的菌落，接入30 mL的液體LB培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)12 h，獲得種子液。以2%的接種量接種于300 mL 液體LB培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)12～16 h。將菌液以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，去除上清，將沉淀溶于30 mL無菌水中，重復(fù)兩次，備用。

1.2.2 煙葉固態(tài)發(fā)酵單因素試驗烤煙煙葉石油醚提取物(包括揮發(fā)油、樹脂、油脂、脂肪酸、蠟質(zhì)、類脂物和色素)常用作衡量煙葉品質(zhì)和香氣的重要指標(biāo)，因此，本文以石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，優(yōu)化芽孢桿菌ZZ-8發(fā)酵廣西河池地區(qū)C4F煙葉的條件[14-15]。

1)接種量：取50 g煙葉，分別噴灑1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL菌懸液在煙葉上，設(shè)置相對濕度為50%，在28 ℃條件下發(fā)酵36 h，發(fā)酵結(jié)束后測定石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個測試組重復(fù)3次，取平均值，并進行顯著性分析。

2)發(fā)酵溫度：取50 g煙葉，將2 mL菌懸液均勻噴灑在煙葉上，設(shè)置相對濕度為50%，分別在20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃和34 ℃條件下發(fā)酵36 h，發(fā)酵結(jié)束后測定石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個測試組重復(fù)3次，取平均值，并進行顯著性分析。

3)發(fā)酵時間：取50 g煙葉，將2 mL菌懸液均勻噴灑在煙葉上，設(shè)置相對濕度為50%，在28 ℃條件下分別發(fā)酵12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，發(fā)酵結(jié)束后測定石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個測試組重復(fù)3次，取平均值，并進行顯著性分析。

4)相對濕度：取50 g煙葉，將2 mL菌懸液均勻噴灑在煙葉上，分別設(shè)置相對濕度為30%、40%、50%、60%和70%，在28 ℃條件下發(fā)酵36 h，發(fā)酵結(jié)束后測定石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個測試組重復(fù)3次，取平均值，并進行顯著性分析。

1.2.3 響應(yīng)面試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心設(shè)計方法設(shè)計響應(yīng)面試驗，以石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Y)為考查指標(biāo)，以接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)及相對濕度(D)為自變量，確定菌株發(fā)酵最佳條件。

采用Excel 2016 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用SPSS 17.0 進行顯著性分析，利用Design-Expert 10.0對響應(yīng)面試驗設(shè)計方案和結(jié)果進行分析[16]。

1.2.4 卷煙樣品制備取50 g煙葉，以最優(yōu)條件進行固態(tài)發(fā)酵，作為實驗組；用等量的無菌水替代菌懸液，均勻噴灑在50 g煙葉上，以同樣的條件進行發(fā)酵，作為對照組。發(fā)酵后分別測定煙葉的常規(guī)化學(xué)成分、致香成分，并將煙葉制成卷煙后進行感官評吸，以明確煙葉固態(tài)發(fā)酵效果。

1.2.5 常規(guī)化學(xué)成分檢測煙葉中常規(guī)化學(xué)成分煙堿、氮、還原性糖、淀粉、鉀和氯等的含量分別參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[17-22]進行測定。

1.2.6 致香成分提取及分析用天平稱取30 g過40目分樣篩的煙末置于1000 mL圓底燒瓶中，加入100 g無水硫酸鈉和400 mL純凈水，將其振蕩搖勻后放入同時蒸餾萃取裝置于60 ℃水浴加熱, 2.5 h后得到含有100 mL二氯甲烷的萃取液。對萃取液進行萃取分離，得到中性的萃取液，再加入一定量的無水硫酸鈉進行冷藏干燥，靜置過夜后蒸餾濃縮樣品至1 mL左右，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進行定量分析。煙葉致香成分的化學(xué)指標(biāo)均重復(fù)測定3次，計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

GC分析條件：HP-5 MS毛細管柱(60 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度為240 ℃；載氣為99.999% 高純度氦氣；流速為1.0 mL/min；分流模式為不分流進樣，進樣量為1.0 μL。升溫程序：50 ℃(保持4 min)，以3 ℃/min升溫到70 ℃(保持5 min)，再以2 ℃/min升溫到100 ℃(保持17 min)，然后以2 ℃/min升溫到120 ℃(保持10 min)，最后以6 ℃/min升溫到280 ℃。

MS分析條件：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃；四級桿溫度150 ℃；電子倍增器電壓2.28 kV；電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量70 eV；溶劑延遲10 min；全掃描檢測，掃描質(zhì)量范圍35～500 amu。

1.2.7 卷煙感官評吸方法邀請13位評吸者，每位評吸者在上午的同一時間段分別對卷煙進行評吸，每次抽吸6支卷煙，對每種卷煙必須進行3次評吸，分別從卷煙的香氣質(zhì)、香氣量、濃度、刺激性、雜氣、勁頭、余味7項指標(biāo)進行打分。感官評吸參照文獻[23]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 單因素試驗結(jié)果接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、相對濕度對石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖1所示。由圖1a)可知，石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著芽孢桿菌接種量增加而升高，當(dāng)接種量為3 mL時，石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到最大值8.3%，顯著高于其他接種量(P<0.05)；之后隨著接種量增加呈下降趨勢。微生物接種量超過一定值會達到飽和狀態(tài)，石油醚提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不再隨著菌接種量增加明顯增加，可能是因為菌種接種量過多，影響菌種生長代謝，進而降低相應(yīng)產(chǎn)物量，因此最佳接種量為3 mL。由圖1b)可知，發(fā)酵溫度28 ℃，石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達到8.0%；隨著溫度進一步提高，石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始下降，可能是溫度過高抑制了芽孢桿菌的生長和代謝，因此最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。由圖1c)可知，在前36 h內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，石油醚提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，當(dāng)發(fā)酵36 h時其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到最大，之后隨著時間的延長，石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)緩慢下降。發(fā)酵時間越長，對煙葉外觀和品質(zhì)的影響越大，應(yīng)控制適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵時間，最佳發(fā)酵時間為36 h。由圖1 d)可知，在相對濕度為60%時，石油醚提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到最大，低于60%時，隨著相對濕度的增加，石油醚提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸上升，但在超過60%之后其質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢。這是由于發(fā)酵煙葉相對濕度低時，會影響酶的活性和芽孢桿菌的生長，隨著相對濕度的增加，逐漸達到微生物生長的最佳值；但當(dāng)煙葉相對濕度過高時，煙葉易結(jié)塊，影響其散熱，有可能產(chǎn)生霉變，不利于芽孢桿菌的生長，影響其代謝，因此煙葉的相對濕度要適量，最佳的發(fā)酵相對濕度為60%。

圖1 接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、相對濕度對石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effects of inoculation amount, fermentation temperature, fermentation time and relative humidity on the mass fraction of petroleum ether extract

2.1.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果如表1所示。利用Design-Expert 10.0對各因素進行多元回歸擬合，得到回歸方程：

Y=-169.31+11.63A+9.22B+0.50C+0.72D-

0.075AB-0.023AC+0.015AD-1.042×10-3BC-

7.5×10-3BD+4.17×10-4CD-1.56A2-

0.15B2-5.856×10-3C2-4.683×10-3D2

回歸模型方差分析結(jié)果如表2所示。由表2可知，該模型的決定系數(shù)R2=0.969，說明該方程與實際情況擬合良好，能夠準(zhǔn)確反映石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)與接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、相對濕度的關(guān)系。失擬項P=2.276 6，差異不顯著，表明建立的二次多元回歸模型能運用于煙葉石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測。該回歸模型達極顯著水平，模型中的A、A2、B2、C2和D2對響應(yīng)值影響極顯著，表明各因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項與交互項均對結(jié)果影響較大。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Design and results of response surface experiment

表2 回歸模型方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of regression model

各因素交互作用對石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的響應(yīng)曲面和等高線分別如圖2、圖3所示。由圖2—3可知，接種量與發(fā)酵溫度、接種量與相對濕度、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度與相對濕度、發(fā)酵時間與相對濕度的交互作用較弱，接種量與發(fā)酵時間的交互作用顯著；根據(jù)曲面陡峭程度及等高線密集程度，可以判斷出各因素對石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響程度的排序為A>C>D>B。該結(jié)果與表2所示的回歸模型方差分析結(jié)果一致。

圖2 各因素交互作用對石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface diagram of the interaction of various factors on the mass fraction of petroleum ether extract

圖3 各因素交互作用對石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的等高線Fig.3 Contour line of the influence of the interaction of various factors on the mass fraction of petroleum ether extract

通過響應(yīng)面分析預(yù)測最佳發(fā)酵條件為接種量3 mL、發(fā)酵溫度28.02 ℃、發(fā)酵時間36.58 h和相對濕度為61.04%，在此條件下石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.94%。為便于實際操作，將發(fā)酵條件修正為：接種量3 mL、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間36 h和相對濕度為60%，在該條件下進行驗證實驗，石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.01%，與理論預(yù)測值接近。

2.2 煙葉固態(tài)發(fā)酵效果分析結(jié)果

2.2.1 常規(guī)化學(xué)成分分析發(fā)酵后煙葉常規(guī)化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表3所示。由表3可知，芽孢桿菌發(fā)酵處理后煙葉總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由23.10%降低到22.20%，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由22.19%提高到22.40%，糖堿比由10.23降低至9.45。這可能是因為在發(fā)酵過程中芽孢桿菌生長消耗總糖，同時由于自身代謝生成少量還原糖；發(fā)酵后煙葉的鉀氯比降低，可能會引起煙葉的燃燒性降低。

表3 發(fā)酵后煙葉常規(guī)化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Mass fraction Routine chemical components in fermented tobacco leaves

2.2.2 致香成分分析煙葉致香成分中羰基化合物(酮類)和類脂類對煙葉品質(zhì)具有重要作用，其中重要香味成分包括：巨豆三烯酮、大馬酮、茄酮、二氫大馬酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、糠醇、糠醛、苯乙醛、二氫氧化異氟爾酮、β-紫羅蘭酮、金合歡醇、β-環(huán)檸檬醛等。

發(fā)酵后煙葉中致香成分含量如表4所示。由表4可知，經(jīng)芽孢桿菌發(fā)酵后的煙葉致香成分總含量由170.444 μg/g提高到186.267 μg/g，提高9.0%。其中大馬酮、茄酮、巨豆三烯酮、二氫大馬酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等香味成分含量的變化較大，巨豆三烯酮和茄酮是煙葉香氣的重要組成部分，能顯著增強煙香、改善吸味、調(diào)和煙氣，并減少刺激感[24]；大馬酮、二氫大馬酮、香葉基丙酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯是煙葉香氣前體物類胡蘿卜素的裂解物，是增加煙香和清新香氣的主要成分[3]。新檢出的苯甲醛和β-環(huán)檸檬醛是2種醛類物質(zhì)，β-環(huán)檸檬醛具有甜香，可以增加煙氣濃度和減少煙氣刺激性，而苯甲醛具有獨特甜味，具有醇和煙氣的作用[24]。

表4 發(fā)酵后煙葉中致香成分含量Table 4 Content of aroma components in fermented tobacco leaves

蒿洪欣等[25]報道了芽孢桿菌具有降解類胡蘿卜素物質(zhì)的活性，提示了芽孢桿菌具有降解類胡蘿卜素物質(zhì)的代謝途徑。本文所使用的菌株ZZ-8也屬于芽孢桿菌，并且是從以類胡蘿卜素(β-胡蘿卜素和葉黃素)為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基中獲得的，初步分離得到降解β-胡蘿卜素和葉黃素相關(guān)酶類，基于以上結(jié)果初步推測菌株ZZ-8自身能夠產(chǎn)生類胡蘿卜素降解酶，進而在發(fā)酵過程中可以將類胡蘿卜素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為大馬酮、二氫大馬酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等致香成分。

2.2.3 卷煙感官評吸結(jié)果卷煙感官評吸結(jié)果如表5所示。由表5可知，與對照組相比，經(jīng)菌株發(fā)酵后的煙葉香氣質(zhì)提高，香氣飽滿度增加，刺激性和雜氣減少，煙氣細膩柔和度得到改善，卷煙余味舒適度提高，評吸分?jǐn)?shù)達到44.6分，比對照組增加1.0分，在一定程度上改善了煙葉的吸食品質(zhì)。

表5 卷煙感官評吸結(jié)果Table 5 Cigarette sensory evaluation results 分

3 結(jié)論

本研究以廣西河池地區(qū)C4F煙葉為研究對象，利用芽孢桿菌ZZ-8對其進行固態(tài)發(fā)酵處理，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗獲得最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量為3 mL、發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵時間為36 h、相對濕度為60%。在該條件下發(fā)酵，煙葉的石油醚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，煙葉總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由23.10%降低至22.20%，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由22.19%提高至22.40%，糖堿比由10.23降低至9.45，產(chǎn)生了苯甲醛和β-環(huán)檸檬醛2種新物質(zhì)，致香成分總含量由170.444 μg/g提高到186.267 μg/g。經(jīng)感官評吸發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后煙葉香氣質(zhì)有所增加，刺激性和雜氣均降低，煙氣細膩柔和，余味更舒適。本文建立的芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵新技術(shù)，可以較好地解決廣西河池C4F煙葉存在的雜氣重、吸味差等問題，提升其利用率。同時在研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后煙葉大馬酮、茄酮、巨豆三烯酮、二氫大馬酮、香葉基丙酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯等香味物質(zhì)含量有一定程度的提高，推測芽孢桿菌ZZ-8發(fā)酵煙葉時能夠產(chǎn)生類胡蘿卜素代謝酶類以降解β-胡蘿卜素和葉黃素，相關(guān)降解酶基因克隆和降解機理將是進一步的研究方向。本文的研究成果對闡明煙葉固態(tài)發(fā)酵過程中重要香味物質(zhì)動態(tài)變化規(guī)律和致香機理具有一定的參考價值。