生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

武豐龍，崔艷英，張志鋒，王丹丹

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 軟件學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 計(jì)算機(jī)與通信工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

生物標(biāo)志物是衡量生物體是否發(fā)生或存在某種疾病的依據(jù)，是反映生物系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能改變的生化指標(biāo)。它可以是核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類、活性分子，也可以是特定的細(xì)胞、基因(產(chǎn)物)等其他廣泛的生化實(shí)體[1-3]。生物標(biāo)志物檢測(cè)是指通過特定的方法使標(biāo)志物與生物個(gè)體發(fā)生反應(yīng)，直接標(biāo)定生物體內(nèi)的靶細(xì)胞，靈敏便捷[4]。目前，生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法主要分為基于遺傳物質(zhì)的檢測(cè)方法和基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法，前者通過檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的主要組成成分(DNA、RNA)證明其是否存在，后者則利用機(jī)體內(nèi)抗原或抗體進(jìn)行的免疫反應(yīng)確定病毒或疾病是否存在。然而，這些傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物檢測(cè)方法受限于各自的目標(biāo)靶點(diǎn)，導(dǎo)致其發(fā)展方向比較分散，聚力不明顯。尤其當(dāng)病毒大流行的時(shí)候，基于遺傳物質(zhì)的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高，但實(shí)時(shí)性較低；基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法在檢測(cè)實(shí)時(shí)性方面效果突出，但容易產(chǎn)生假陽性或假陰性。結(jié)合微芯片技術(shù)的檢測(cè)方法使檢測(cè)手段趨于多元化，可彌補(bǔ)使用單一檢測(cè)方法的不足。鑒于此，本文擬對(duì)基于遺傳物質(zhì)、免疫學(xué)及結(jié)合微芯片的生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行梳理，并嘗試結(jié)合現(xiàn)代光學(xué)、電學(xué)和磁學(xué)技術(shù)，從高靈敏度、高安全性、設(shè)備微型化、方法多元化、信息可視化等方面展望生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)，為各種生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的發(fā)展提供聚力效應(yīng)，為突破病毒快速檢測(cè)方法的技術(shù)障礙或瓶頸，同時(shí)也為生物標(biāo)志物檢測(cè)方法在病毒篩查、疾病診斷、食品安全控制等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)和支撐。

1 基于遺傳物質(zhì)的檢測(cè)方法

作為病毒遺傳物質(zhì)的核酸分為兩類：一類是常見的生物和病毒遺傳物質(zhì)DNA，比如乙肝病毒；另一類是特殊的具有強(qiáng)致病性的病毒遺傳物質(zhì)RNA，比如新冠病毒[5-6]。核酸分離純化是把樣品中的核酸與其他物質(zhì)裂解、分離的過程[7]，提取物的純化程度與檢測(cè)的準(zhǔn)確性呈正相關(guān)。傳統(tǒng)的液相抽取法耗時(shí)費(fèi)力，提取結(jié)果為大量核酸粗品，且在一定程度上會(huì)對(duì)人體健康造成危害。固相提取法中的磁珠吸附法因步驟簡(jiǎn)單、易制備而備受業(yè)界青睞，其主要利用磁珠表面的硅羥基與核酸進(jìn)行反應(yīng)形成復(fù)合物，經(jīng)過施加外磁場(chǎng)，將被吸附的核酸與其他物質(zhì)分離，實(shí)現(xiàn)純化[8]。該方法采集樣品中的病毒遺傳物質(zhì)含量通常較低，需進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增使之達(dá)到一定的含量,便于后續(xù)檢測(cè)。

1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)

PCR是一種在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的基因擴(kuò)增技術(shù)，多數(shù)情況下僅用一個(gè)試管便可實(shí)現(xiàn)基因的大量復(fù)制。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：高溫變性、低溫配對(duì)、適溫延伸。隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增加，DNA含量也會(huì)成倍增加[9-10]。

近30年來,PCR技術(shù)持續(xù)不斷地改進(jìn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)、數(shù)字PCR(dPCR)等衍生技術(shù)在病毒基因檢測(cè)、食品安全控制等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用[11-17]。qPCR在PCR的基礎(chǔ)上加入熒光染料或探針，通過熒光信號(hào)反映PCR的實(shí)時(shí)過程，能實(shí)現(xiàn)定量、快速檢測(cè)。何久香等[11]根據(jù)非洲豬瘟病毒的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，通過熒光染料TB Green qPCR方法篩選出最佳引物對(duì)，提高了檢測(cè)靈敏性。RT-qPCR通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量分析，診斷耗時(shí)短，檢測(cè)樣本多且成本低[13]。四川大學(xué)華西醫(yī)院研發(fā)的具有特異性引物的多重?zé)晒釸T-PCR新型冠狀病毒檢測(cè)試劑盒，對(duì)病毒核酸的檢測(cè)靈敏度達(dá)到200 copy/mL[14]。dPCR技術(shù)靈敏度高，由于其監(jiān)測(cè)下限可低至單拷貝，對(duì)痕量樣品檢測(cè)尤為重要[15]。J.Q.Chen等[16]運(yùn)用新發(fā)現(xiàn)的基因靶標(biāo)，通過qPCR、dPCR技術(shù)對(duì)食品和環(huán)境中的李斯特菌進(jìn)行活性檢測(cè)，能有效監(jiān)控食品安全和環(huán)境污染。苗小草等[17]建立了多重PCR體系，能同時(shí)快速檢測(cè)乳制品中的沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、克羅諾桿菌4種食源性致病菌，為食品中這4種目標(biāo)菌的檢測(cè)提供了有效途徑。然而PCR技術(shù)操作復(fù)雜，對(duì)儀器和人員的要求較高，不適合基層或現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。

1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)

PCR技術(shù)要經(jīng)歷高溫、去火等步驟[18]，而LAMP技術(shù)僅在等溫條件下即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，對(duì)儀器要求較低，且在1 h內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)109倍的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效果是PCR技術(shù)的數(shù)倍，在即時(shí)檢測(cè)方面意義重大。

在食品病原菌檢測(cè)中，S.J.Oh等[19]設(shè)計(jì)了一種離心微流控裝置，該裝置針對(duì)大腸桿菌O157:H7的基因組DNA設(shè)置特定的引物，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種食源性病原菌的檢測(cè)，且此裝置高敏感、高通量，便于肉眼直觀檢測(cè)。S.A.Besuschio等[20]在檢測(cè)人體血液克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)DNA時(shí)，利用鈣黃綠素與LAMP反應(yīng)體系中的Mg2+結(jié)合會(huì)使顏色由黃變綠的特點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)單便捷。雅培公司的ID NOW檢測(cè)SARS-CoV-2工具采用LAMP技術(shù)，可在單一恒溫條件下快速即時(shí)地?cái)U(kuò)增病毒RNA目標(biāo)序列，然而近期有研究發(fā)現(xiàn)，由于樣本運(yùn)輸條件和樣本處理不當(dāng)，該方法會(huì)產(chǎn)生12%～48%的假陰性率[21]。LAMP技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中易受假性污染的影響，只有防止假性污染才能得到準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)結(jié)果。

1.3 核酸恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)(SAT)技術(shù)

SAT是我國自主研發(fā)的綜合qPCR和LAMP的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)運(yùn)用特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)對(duì)靶標(biāo)核酸進(jìn)行提取后，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA 聚合酶聯(lián)合作用下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增[22]。特異性靶標(biāo)捕獲核酸保證了檢測(cè)結(jié)果的高準(zhǔn)確性，有效避免了假陽性、假陰性結(jié)果。

在1180例兒童支原體肺炎(MPP)中，J.Li等[23]利用SAT技術(shù)診斷MPP，其敏感性、特異性分別為97%、95.1%。M.Tang等[24]用SAT技術(shù)、膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)MPP發(fā)病期的陽性率，結(jié)果顯示SAT的陽性率(29.9%)高于膠體金法(16.63%)和ELISA(20.07%)，膠體金聯(lián)合SAT是早期MPP的可靠檢測(cè)方法。此外，SAT技術(shù)檢測(cè)的靶標(biāo)核酸是RNA，基于RNA易降解的特性，檢測(cè)結(jié)果可作為區(qū)分死菌、活菌的依據(jù)，更有利于MPP康復(fù)治療的監(jiān)測(cè)。由于SAT僅需恒溫反應(yīng)條件，可在一定程度上降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求，利于更廣泛的推廣應(yīng)用。

1.4 基因檢測(cè)技術(shù)

全基因組測(cè)序是作用于病毒核酸整個(gè)序列的檢測(cè)技術(shù)，全面但昂貴耗時(shí)。納米孔測(cè)序(NTS)技術(shù)整合了全基因組測(cè)序和RT-PCR的優(yōu)點(diǎn)，先擴(kuò)增靶標(biāo)基因序列，再進(jìn)行測(cè)序。此技術(shù)依賴一種特殊的納米孔，當(dāng)待測(cè)核酸單鏈通過此納米孔時(shí)，化學(xué)堿基會(huì)被轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，根據(jù)不同堿基產(chǎn)生的不同電流，對(duì)電信號(hào)進(jìn)行收集、整理、轉(zhuǎn)化后通過檢測(cè)器，即可獲得詳細(xì)的核酸序列信息[25]。

2020年6月，M.Wang等[26]基于NTS同時(shí)檢測(cè)SARS-CoV-2和其他5種呼吸道病毒，其中對(duì)SARS-CoV-2的特異性達(dá)到100%。K.Tafess等[27]利用NTS技術(shù)對(duì)臨床結(jié)核病人的雙歧桿菌耐藥基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，平均臨床敏感性和臨床特異性分別高達(dá)94.8%和98.0%，整個(gè)測(cè)序僅需15 h。R.Liu等[28]對(duì)比分析了基于NTS和成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白(CRISPR/Cas系統(tǒng))的方法快速檢測(cè)SARS-CoV-2病毒的可行性，發(fā)現(xiàn)靈敏度高、綜合性強(qiáng)、成本低的NTS更具優(yōu)勢(shì)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)利用自身的特殊機(jī)制對(duì)靶標(biāo)基因作出響應(yīng)，即當(dāng)感受到病毒的攻擊時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)會(huì)適應(yīng)并記錄此病毒到間隔區(qū)，待此病毒再次入侵時(shí)，Cas蛋白在向?qū)NA的引導(dǎo)下會(huì)特異性地識(shí)別并裂解靶標(biāo)RNA，使其無法完整地復(fù)制和表達(dá)。張鋒團(tuán)隊(duì)[29]利用這一特性開發(fā)的高靈敏核酸檢測(cè)系統(tǒng)，可以有效預(yù)防入侵者的攻擊，積極遏制流行病毒的爆發(fā)。M.Fareh等[30]發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas13b系統(tǒng)能夠識(shí)別并切割SARS-CoV-2病毒，阻止其在人體細(xì)胞中的增殖。S.K.Bose等[31]利用CRISPR技術(shù)將小鼠模型DNA中突變的腺嘌呤轉(zhuǎn)換成鳥嘌呤糾正賀勒氏癥(一種先天性代謝紊亂疾病)的堿基突變，該結(jié)果表明利用CRISPR技術(shù)有望治療產(chǎn)前和產(chǎn)后的賀勒氏癥。

NTS和CRISPR/Cas系統(tǒng)是相對(duì)較新的基因檢測(cè)技術(shù)。NTS技術(shù)可實(shí)現(xiàn)單分子測(cè)序，具有高通量和高靈敏度，可實(shí)時(shí)完成數(shù)據(jù)的讀取，但目前該技術(shù)還不成熟，準(zhǔn)確度有待提高。CRISPR/Cas系統(tǒng)因合成使用方便、特異性高、安全性好等特點(diǎn)而具有較大潛力，但其受倫理因素制約，且其編輯精確度、脫靶效應(yīng)等問題仍亟待解決。

2 基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法

基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求偏低，有利于大規(guī)模的篩查，常用方法主要有ELISA、電化學(xué)發(fā)光免疫法(ECLI)、免疫層析(ICA)技術(shù)、磁免疫技術(shù)等。

2.1 ELISA

ELISA是一種利用特定抗體(或抗原)在樣本中捕獲目標(biāo)抗原(或抗體)，通過酶與底物發(fā)生反應(yīng)進(jìn)行靶標(biāo)分子檢測(cè)的方法，在疾病治療、病毒檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛。布魯氏菌病是一種世界性較為嚴(yán)重的人畜共患疾病，因ELISA具有簡(jiǎn)單、快速響應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，使用該方法診斷布魯氏菌病已獲得全球普遍認(rèn)可[32]。作為核酸檢測(cè)的輔助手段，ELISA對(duì)病毒疫苗研發(fā)具有重要的參考價(jià)值。使用ELISA與橫向流動(dòng)免疫層析技術(shù)結(jié)合的方法對(duì)SARS-CoV-2抗體進(jìn)行檢測(cè)，可有效監(jiān)測(cè)病毒感染，預(yù)測(cè)病毒趨勢(shì)[33]。

隨著ELISA的發(fā)展，雙抗體夾心法(DAS)逐漸為人們所熟知，該方法將能識(shí)別靶標(biāo)基因表位的抗體固定于微孔板載體上并與靶標(biāo)基因結(jié)合，再加入另一個(gè)由酶標(biāo)記的特異性抗體，形成雙抗體夾心復(fù)合物，通過酶催化底物形成的有色產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測(cè)。T.Xiang等[34]構(gòu)建了一種新的雙抗體夾心-橫向流動(dòng)免疫分析法(DAS-LFIA)，用于檢測(cè)人血清或血漿中的抗-HCV(丙型肝炎病毒)抗體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法的敏感性和特異性均為100%。DAS使酶的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性得到雙重保障，但只有擁有兩個(gè)以上抗體結(jié)合部位的抗原才能用此方法檢測(cè)。ELISA特異性好、靈敏度高，但通常需依賴昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適于對(duì)偏遠(yuǎn)地區(qū)的即時(shí)檢測(cè)。

2.2 ECLI

ECLI是基于化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)并加以改進(jìn)的方法，通過在電場(chǎng)中施加一定電壓使電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。釕聯(lián)吡啶([Ru(bpy)3]3+)是常見的電化學(xué)發(fā)光劑，[Ru(bpy)3]3+與激發(fā)態(tài)三丙胺(TPA)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，[Ru(bpy)3]3+在反應(yīng)過程中會(huì)釋放能量從而發(fā)光，整個(gè)反應(yīng)過程可以不斷循環(huán)，測(cè)定信號(hào)不斷放大，從而使檢測(cè)靈敏度大幅度提高[35-36]。

L.Chang等[37]對(duì)比分析了1029例HIV(艾滋病毒)樣本，ECLI相比大多數(shù)的ELISA試劑盒有更高的特異性(99.0%)和準(zhǔn)確性(93.8%)，拓寬了血液篩查的途徑。由于TPA存在生物毒性高、背景信號(hào)強(qiáng)等問題，D.Pan等[38]開發(fā)了一種氧化鎢(WO3-x)納米點(diǎn)新型共反應(yīng)劑，其動(dòng)物毒性是TPA的1/300，且與[Ru(bpy)3]2+聯(lián)用時(shí)的效率不亞于TPA。Y. Nie等[39]利用非酶催化發(fā)夾組裝和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)成功設(shè)計(jì)了一種多功能、超靈敏的電化學(xué)發(fā)光傳感平臺(tái)用于監(jiān)測(cè)乳腺癌生物標(biāo)志物，有效避免了單個(gè)發(fā)光體的干擾，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。ECLI不僅繼承了CLIA的優(yōu)點(diǎn)，能控制待檢物質(zhì)的氧化還原能力，而且可以調(diào)節(jié)發(fā)光的時(shí)間和空間，有利于可逆物質(zhì)的循環(huán)利用。

2.3 ICA技術(shù)

ICA技術(shù)結(jié)合了免疫學(xué)原理和層析原理。在毛細(xì)管作用下，待測(cè)樣品在硝酸纖維膜上移動(dòng)至固定抗體的特定區(qū)域時(shí)，抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，在短時(shí)間內(nèi)顯示出特殊顏色，據(jù)此對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分析[40]。ICA技術(shù)擁有周期短、成本低、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、無人員要求等特點(diǎn)，在即時(shí)檢測(cè)方面發(fā)揮著重要作用，其中膠體金ICA(GICA)就是一種經(jīng)典的標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)。

GICA技術(shù)省去了ELAS繁瑣的步驟，避免了放射性同位素、有毒底物等的使用[41]，操作簡(jiǎn)便，適于野外或臨床的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。張穩(wěn)健等[42]對(duì)新冠疑似群體使用GICA技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)患者IgM/IgG抗體呈陽性的符合率為96.1%，健康人和其他發(fā)熱病人的IgM和IgG檢測(cè)特異性分別為99%和98%。謝艷君等[43]利用GICA技術(shù)制備了用于檢測(cè)中藥材中黃曲霉毒素B1的膠體金試紙條，證明粒徑為17.4 nm的膠體金靈敏度最高，檢測(cè)限為0.5 μg/mL，檢測(cè)時(shí)間為17 min，有利于大批量中藥材的快速篩查。但GICA技術(shù)是憑借顏色信號(hào)通過視覺觀察來判斷檢測(cè)結(jié)果的，只有表層約10 μm的信號(hào)可以被檢測(cè)到，這就使得整個(gè)檢測(cè)膜內(nèi)部產(chǎn)生的信號(hào)容易丟失，導(dǎo)致靈敏度降低。

以Fe3O4磁性納米顆粒(MNPs)作為標(biāo)記物并以磁信號(hào)作為檢測(cè)指標(biāo)的磁納米免疫層析技術(shù)可以避免視覺觀察降低靈敏度的問題，能夠?qū)φ麄€(gè)NC膜上(約150 μm厚)MNPs的磁場(chǎng)進(jìn)行定量[44]，其檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)的標(biāo)記物效果提高了10～100倍。MNPs產(chǎn)生的磁信號(hào)不隨時(shí)間的延長(zhǎng)而衰減[45]，使測(cè)量結(jié)果可以很好地保存，且磁性檢測(cè)背景信號(hào)干擾小、磁信號(hào)穩(wěn)定、靈敏度高，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。

S.Xia等[46]以金磁性雙功能納米粒(GMBN)作為新型標(biāo)記物制備霍亂沙門氏菌免疫層析試紙條用于食源性病原菌的快速檢測(cè)，其中對(duì)霍亂豬鏈球菌的捕獲率為82.4%，檢測(cè)靈敏度為5×105CFU/mL，在食品樣品(全脂牛奶)中完成全部步驟的檢測(cè)時(shí)間為20 h，提高了食源性病原微生物檢測(cè)的敏感度。張博[47]制備了以多包裹磁納米球?yàn)闃?biāo)記物的雙模態(tài)聯(lián)檢免疫層析試紙條，對(duì)乳腺癌、急性心肌梗塞相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè)靈敏度分別為0.06 ng/mL、0.049 ng/mL，提高了檢出率。新型材料MNPs的使用提高了ICA技術(shù)的檢測(cè)靈敏度，無需專業(yè)人員的操作、昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的樣本前處理，可快速判讀結(jié)果，在即時(shí)檢測(cè)方面發(fā)展?jié)摿^大。然而由于功能納米顆粒制備、表面修飾等技術(shù)較為復(fù)雜，且功能性表面修飾對(duì)保存環(huán)境要求較高，目前使用該技術(shù)的成本仍較高。

2.4 磁免疫技術(shù)

磁免疫技術(shù)采用MNPs作為示蹤檢測(cè)物，通過檢測(cè)標(biāo)記物響應(yīng)的磁信號(hào)獲取標(biāo)記物信息[48]，主要類型包括磁電阻(MR)傳感器、磁粒子光譜(MPS)、核磁共振(NMR)等。

MR傳感器將MNPs的磁響應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)化為可讀的電信號(hào)進(jìn)行病毒檢測(cè)。在目前的研究中，MR分為巨磁電阻(GMR)和磁隧道結(jié)(MTJs)兩種類型。GMR效應(yīng)主要存在于鐵磁性和非磁性金屬交替重疊的多層結(jié)構(gòu)中[49]。當(dāng)兩個(gè)相鄰鐵磁層的磁矩平行時(shí)，多層膜呈現(xiàn)低電阻狀態(tài)；當(dāng)磁矩反平行時(shí)，多層膜呈現(xiàn)高電阻狀態(tài)。根據(jù)GMR傳感器電阻或電壓的變化，可定量檢測(cè)待檢生物分子的含量。MTJs類似于GMR自旋閥的堆疊結(jié)構(gòu)，相鄰的鐵磁層被絕緣層隔開，其中絕緣層通常是一種氧化物(AlOx或MgO)[50]。X.Sun等[51]使用GMR生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌抗原，檢測(cè)限為100 CFU/mL。P.P.Sharma等[52]利用微流控集成MTJs技術(shù)檢測(cè)戊型肝炎病毒、單核增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的致病性DNA，檢測(cè)靈敏度高于電化學(xué)傳感器。L.Li等[53]使用MTJs傳感器檢測(cè)HIV-1p24抗原的檢測(cè)時(shí)間在10 min內(nèi)，檢測(cè)限為0.01 μg/mL。J.Choi等[54]研制了一種基于GMR生物傳感器技術(shù)的便攜式定量免疫分析平臺(tái)，該平臺(tái)可在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)多個(gè)生物定量檢測(cè)結(jié)果的顯示。

MPS是磁顆粒成像(MPI)的衍生技術(shù)，利用MNPs的非線性磁響應(yīng)可以構(gòu)建三維層析圖像[55]。在外部正弦磁場(chǎng)(激勵(lì)磁場(chǎng))作用下，激勵(lì)磁場(chǎng)周期性地磁化MNPs，根據(jù)電磁感應(yīng)原理，通過記錄探測(cè)線圈隨時(shí)間變化的電壓，即可對(duì)MNPs的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行分析。布朗弛豫和尼爾弛豫的弛豫時(shí)間長(zhǎng)短是生物免疫檢測(cè)或病毒檢測(cè)的基礎(chǔ)。如果MNPs表面結(jié)合有生物分子(如抗體、DNA、RNA和蛋白質(zhì))，其水力學(xué)半徑會(huì)變大，進(jìn)而影響MNPs在分散體系中的轉(zhuǎn)動(dòng)[56]，因此布朗弛豫被抑制，磁響應(yīng)減弱，在MPS中可以觀測(cè)到較低的諧波振幅。提取具有特征頻率的幅值信息能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物樣品中參與反應(yīng)的物質(zhì)的檢測(cè)。K.Wu等[57]利用MNPs偶聯(lián)H1N1核蛋白抗體，將7組不同濃度的偶聯(lián)復(fù)合體實(shí)驗(yàn)組與2組陰性結(jié)果對(duì)比，發(fā)現(xiàn)不同濃度諧波振幅具有明顯差異，據(jù)此完成了H1N1核蛋白抗體的免洗檢測(cè)。趙興一[58]設(shè)計(jì)了一種磁免疫測(cè)量系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)具有不同水力學(xué)半徑MNPs磁化強(qiáng)度的測(cè)量，達(dá)到了生物免疫檢測(cè)的目的。

NMR通過測(cè)量樣品溶液中氫質(zhì)子的進(jìn)動(dòng)信號(hào)檢測(cè)MNPs靶標(biāo)樣品。MNPs比表面積大，由MNPs的局部磁場(chǎng)不均勻性可引起周圍數(shù)百萬個(gè)水質(zhì)子的進(jìn)動(dòng)頻率發(fā)生變化。由于單分散的MNPs在與目標(biāo)生物分子結(jié)合反應(yīng)后聚集，團(tuán)簇可使周圍水分子轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)的相位差發(fā)生變化，從而減少T2弛豫時(shí)間，通過T2弛豫時(shí)間的變化可表征諸如蛋白質(zhì)、抗體、多肽、核酸等生物分子是否存在[59]。此外，NMR可將檢測(cè)信號(hào)放大，使靈敏度提高。M.Liong等[60]報(bào)道了基于磁條形碼對(duì)分枝桿菌進(jìn)行的核酸檢測(cè)，使用NMR技術(shù)能夠檢測(cè)被MNPs標(biāo)記的分枝桿菌。NMR技術(shù)被用于評(píng)估人工設(shè)計(jì)的寡肽與埃博拉病毒VP24的結(jié)合能力，對(duì)抑制埃博拉病毒VP24與人核蛋白的交互，從而降低埃博拉病毒的毒性有積極作用[61-62]。

磁免疫技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于生物檢測(cè)環(huán)境的無磁性，即“磁透明”(相對(duì)磁導(dǎo)率近似等于1)，受檢測(cè)環(huán)境和檢測(cè)樣本影響較小，背景噪聲較低，可用于非透明和未經(jīng)處理的樣本。此外，超順磁性的MNPs具有高磁化率、生物兼容性好等特性。然而，儀器缺乏便攜性、設(shè)備成本高等因素限制了磁免疫技術(shù)的快速發(fā)展。

3 結(jié)合微芯片技術(shù)的檢測(cè)方法

為進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的精確性，生物標(biāo)志物檢測(cè)方法要盡可能多元化。將各種檢測(cè)技術(shù)與微芯片(微流控芯片、生物芯片)相結(jié)合，是目前生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)。微芯片技術(shù)將樣品的制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊芯片上，加入少量的樣本，在短時(shí)間內(nèi)即可自動(dòng)分析出結(jié)果[63-64]。

與PCR技術(shù)、SAT、ELISA結(jié)合的微流控芯片技術(shù)常運(yùn)用于臨床診斷、食品安全控制等領(lǐng)域。朱燦燦[65]提出了多重巢式固相PCR擴(kuò)增新方法，與微流控芯片技術(shù)結(jié)合，建立了一體化微流控核酸分析芯片，并與國際先進(jìn)儀器設(shè)備進(jìn)行HPV對(duì)比檢測(cè)，準(zhǔn)確性達(dá)100%，可在1 h內(nèi)完成5種基因分型的鑒定，大大降低了試劑成本和檢測(cè)時(shí)間。A.A.Sayad等[66]使用微流控恒溫?cái)U(kuò)增芯片對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，在食品中的檢測(cè)限為5×10-3ng/μL，一次加入樣品，經(jīng)過全自動(dòng)流程在70 min內(nèi)即可完成檢測(cè)。王藝蓓[67]運(yùn)用微流控芯片與ELISA構(gòu)建微液滴技術(shù)的球刷—酶信號(hào)放大系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有極強(qiáng)的熒光信號(hào)放大能力，檢測(cè)靈敏度較高。ECLI在微芯片應(yīng)用中也有較多研究。與紙基微流控結(jié)合的電化學(xué)生物傳感器、數(shù)字微流控電化學(xué)生物傳感器已廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)、疾病治療等研究中，在即時(shí)檢測(cè)方面有很大的發(fā)展?jié)摿68-69]。基于自身獨(dú)特的化學(xué)和物理性能，MNPs結(jié)合生物芯片有一定的應(yīng)用前景。K.Petkovix等[70]開發(fā)了一種使用MNPs進(jìn)行免疫檢測(cè)的集成芯片裝置，對(duì)于檢測(cè)亨德拉(Hendra)病毒效果好，15 min內(nèi)檢測(cè)限約為0.48 ng/mL。微芯片技術(shù)易與其他現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，具有試劑消耗低、分析時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，有利于高通量、低消耗的即時(shí)檢測(cè)。

4 結(jié)語與展望

本文綜述了基于遺傳物質(zhì)、免疫學(xué)及結(jié)合微芯片技術(shù)的生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀，目前生物標(biāo)志物檢測(cè)方法向納米尺度轉(zhuǎn)變，在便攜性、實(shí)時(shí)檢測(cè)、檢測(cè)靈敏度方面有了一定的提高，然而這些方法仍存在一定的局限性。基于遺傳物質(zhì)的生物標(biāo)志物檢測(cè)方法不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。PCR、LAMP實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)仍需在核酸提取、擴(kuò)增等方面進(jìn)行優(yōu)化；SAT能夠最大限度地去除雜質(zhì)，同時(shí)在核酸擴(kuò)增階段也擺脫了傳統(tǒng)PCR技術(shù)對(duì)大型儀器的依賴，極大提升了檢測(cè)的靈敏度和特異性，但如何降低SAT酶的成本、提升酶的運(yùn)輸保存穩(wěn)定性、優(yōu)化引物設(shè)計(jì)等仍需進(jìn)一步深入研究；NTS靈敏度高但準(zhǔn)確率稍低?；诿庖邔W(xué)的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉，適用于生物標(biāo)志物現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。ELISA特異性好、靈敏度高但檢測(cè)過程較繁瑣且難以同時(shí)檢測(cè)多種成分；ECLI通過電信號(hào)表征檢測(cè)信息，避免了干擾因素，提高了準(zhǔn)確性；ICA操作方便且能實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)；磁免疫技術(shù)靈敏度高但便攜性差。隨著抗原種類和數(shù)量的不斷增多，針對(duì)不同的抗原制備高質(zhì)量的靶標(biāo)抗體也是一大難點(diǎn)，基于免疫反應(yīng)的檢測(cè)方法不能做到嚴(yán)格的定量檢測(cè)。但LAMP與ICA結(jié)合使用的方法不僅能滿足一定程度的定量檢測(cè)，而且操作簡(jiǎn)單，已在基因檢測(cè)領(lǐng)域嶄露頭角。結(jié)合微芯片的檢測(cè)方法在檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)實(shí)時(shí)性上比傳統(tǒng)的PCR、LAMP更勝一籌；微芯片技術(shù)集成到電化學(xué)傳感器、磁免疫傳感器的微型檢測(cè)設(shè)備也已廣泛應(yīng)用到病毒、疾病等的檢測(cè)；微芯片與納米材料結(jié)合，提高了檢測(cè)效率，為研發(fā)高性能便攜式設(shè)備奠定了基礎(chǔ)。結(jié)合微芯片的檢測(cè)方法有望滿足高便攜性、高通量、低消耗、低污染等的需求。

綜上所述，生物標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)仍需不斷融合現(xiàn)代新技術(shù)以實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展：1)優(yōu)化免疫催化反應(yīng)物實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，加大核酸提取物純化程度實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)，開發(fā)諸如核酸適配體、MIP(分子印跡聚合物)等新型合成受體代替單一抗體，以最大限度提高檢測(cè)靈敏度，使檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性更高；核酸技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)聯(lián)合使用的新型核酸試紙條，將快速高效地實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，提高檢測(cè)設(shè)備自動(dòng)化程度，降低檢測(cè)人員的安全風(fēng)險(xiǎn)隱患。2)與納米微型相機(jī)、納米太陽能芯片等各種納米產(chǎn)品結(jié)合使用的檢測(cè)設(shè)備將會(huì)更趨于微型化，為戶外、經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)提供更大的檢測(cè)便利性。3)加強(qiáng)多組分免疫傳感分析研究，開發(fā)檢測(cè)方法聯(lián)合使用的多重檢測(cè)系統(tǒng)，層層篩查靶標(biāo)物質(zhì)，減少假陽性、假陰性的發(fā)生概率，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。4)開發(fā)與智能檢測(cè)設(shè)備(智能手機(jī)、微電子設(shè)備)集成使用的智能化生物標(biāo)志物檢測(cè)方法，結(jié)合特殊的算法(如深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))將檢測(cè)信號(hào)(光、電、磁信號(hào))轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，對(duì)檢測(cè)過程及結(jié)果進(jìn)行嚴(yán)格的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并實(shí)現(xiàn)智能檢測(cè)設(shè)備的直觀顯示，有利于預(yù)測(cè)及控制疾病發(fā)展動(dòng)態(tài)。未來高靈敏度、高安全性、檢測(cè)設(shè)備微型化、檢測(cè)方法多元化、檢測(cè)結(jié)果信息可視化的檢測(cè)技術(shù)將成為生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)，為疾病診斷、病毒預(yù)防、食品安全等提供強(qiáng)有力的檢測(cè)手段。