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    LncRNA MAGI2-AS3表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響

    2022-10-08 07:06:26曾華東邱嫻涂力張丹丹王君麗
    臨床肺科雜志 2022年10期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系肺癌腫瘤

    曾華東 邱嫻 涂力 張丹丹 王君麗

    根據(jù)世衛(wèi)組織的最新報(bào)告,與世界上其他癌癥相比,肺癌導(dǎo)致的死亡率最高。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例總數(shù)的85%。大量的危險(xiǎn)因素歸因于肺癌的進(jìn)展。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是最常見(jiàn)的突變驅(qū)動(dòng)基因之一,通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT和MAPK途徑,密切參與肺癌的發(fā)展[1]。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)[1]最近的一項(xiàng)研究表明,在2020年最常見(jiàn)的癌癥中,肺癌約占12%~13%的新癌癥病例,估計(jì)造成的死亡人數(shù)最多,在男性和女性中分別占23%和22%。據(jù)報(bào)道,5年生存率低至19%,說(shuō)明目前缺乏有效的長(zhǎng)期治療[2]。肺癌的危險(xiǎn)因素包括吸煙、環(huán)境污染、輻射、基因改變等。眾所周知,不受控制的增殖是最重要的癌細(xì)胞標(biāo)志之一,并且在惡性腫瘤的癌變和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。肺癌發(fā)病率與死亡率居高不下,其中非小細(xì)胞肺癌占比高達(dá)80%以上,包括腺癌、鱗癌及大細(xì)胞癌[3]。然而,長(zhǎng)期預(yù)后已得到改善,中位生存期接近25~30個(gè)月,目前約有三分之一的患者存活5年[4]。這可能部分歸因于分期的改進(jìn),包括使用腦磁共振成像和氟脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描成像,在放射治療計(jì)劃和支持性護(hù)理方面的進(jìn)展[5]。大多肺癌患者確診時(shí)已是晚期,通常采用放化療等癌癥控制方法,但預(yù)后較差,且容易復(fù)發(fā)[6]。在20多年沒(méi)有臨床進(jìn)展的情況下,在鉑類化療中加入程序性細(xì)胞死亡蛋白1軸阻斷已經(jīng)證明了可以延長(zhǎng)肺癌患者的生存期,并代表了當(dāng)前一線治療的標(biāo)準(zhǔn)。但是耐藥性幾乎在所有患者中快速增加。

    大約98%的人類基因組由非編碼DNA組成,這些DNA被轉(zhuǎn)錄成大量的非編碼RNA (ncRNAs)。通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組的全面研究,人們發(fā)現(xiàn)了數(shù)以萬(wàn)計(jì)的長(zhǎng)非編碼RNA (lncRNAs),其長(zhǎng)度為200 nt。大量的lncRNA研究表明,這些新的調(diào)控元件在人類疾病中高度失調(diào),包括各種類型的癌癥。lncRNAs作為支架分子、結(jié)構(gòu)RNA和調(diào)控分子,在調(diào)控癌癥特征的所有方面的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用[7]。MAGI2-AS3是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,其在乳腺癌中發(fā)揮重要作用[8]。但其在肺癌中的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探究肺癌的分子機(jī)制,為肺癌的臨床治療奠定基礎(chǔ)。

    資料與方法

    一、細(xì)胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染

    肺癌細(xì)胞系PG49購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所(上海,中國(guó))。細(xì)胞在DMEM (Gibco)中培養(yǎng),添加10% (v/v)胎牛血清;青霉素(終濃度100u/mL)、鏈霉素(終濃度100mg/mL),置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    將肺癌細(xì)胞系接種于60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿中(每個(gè)平板接種約1.5×105個(gè)細(xì)胞),用含有1 mmol/L TCP的DMSO(0.5%)溶液處理24 h或用0.5% DMSO溶液?jiǎn)为?dú)處理24 h。24 h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)7天,然后提取總RNA用于RNA分析。

    MAGI2-AS3 shRNA和陰性對(duì)照shRNA(sh-NC)由上海Gene Pharma公司完成。慢病毒包裝采用293T細(xì)胞,293T細(xì)胞在含有10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),并每隔一天傳代一次。收集病毒,按轉(zhuǎn)染物不同分為:LV-GFP-N轉(zhuǎn)染組(oe-NC,轉(zhuǎn)染空載體)、LV-GFP-MAGI2-AS3轉(zhuǎn)染組(oe-MAGI2-AS3,慢病毒轉(zhuǎn)染MAGI2-AS3過(guò)表達(dá))。

    待肺癌細(xì)胞系處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)胰蛋白酶消化、吹打,制成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液并接種于6孔板,每孔2 mL,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。再將病毒(1×108TU/mL)加入細(xì)胞中,侵染后48 h,通過(guò)熒光顯微鏡觀測(cè)GFP表達(dá)效率。

    二、 qRT-PCR

    根據(jù)說(shuō)明書(shū),使用 TRIzol 試劑 (Invitrogen) 從新鮮冷凍的 HCC 組織或轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取總 RNA。SYBR Green PCR Master Mix 用于在 ABI7300 實(shí)時(shí) PCR 機(jī)器(Applied Biosystems)上進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)。 熱循環(huán)條件如下:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照基因。2^(-ΔCT)表示待測(cè)基因表達(dá)水平,ΔCT=CT(target)-CT(ref),所用的特異性引物序列(見(jiàn)表1)。

    表1 qRT-PCR的引物序列

    三、 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

    BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒 (Novagen) 用于量化蛋白質(zhì)濃度。來(lái)自每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)通過(guò) SDS-PAGE 分離,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜 (Millipore) 中。用牛血清白蛋白封閉后,將所有膜與不同的一抗,在 4℃ 下孵育過(guò)夜,然后與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)膜中的蛋白質(zhì)條帶。通過(guò) ImageJ 軟件量化條帶強(qiáng)度,并將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為 β-actin。在含有蛋白酶抑制劑的冰冷放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液(Beyotime)中裂解細(xì)胞。在 4℃ 下以12 000 rpm離心20 min后,通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解物,并使用ECL 檢測(cè)試劑(Beyotime)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析,并使用 Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)拍照。

    四、 EdU增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

    在96孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞48 h后,吸去細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加入500 μL含EdU(25 μmol/L)培養(yǎng)基孵育2 h。經(jīng)固定(4%多聚甲醛,30 min)和通透(0.5% TfitonX-100,10 min)處理后,加入500 μL的Apollo?染色反應(yīng)液(避光),DAPI染核,最后獲取圖像并定量分析。

    五、 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

    細(xì)胞凋亡/壞死檢測(cè)試劑盒(Abcam, ab176749)根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用。將細(xì)胞置于含有凋亡細(xì)胞Apopxin Green指示劑和健康細(xì)胞CytoCalcein指示劑的分析緩沖液中,在室溫下孵育1 h。用分析緩沖液洗滌細(xì)胞,使用Zeiss LSM 880在×10倍鏡下成像。激發(fā)/發(fā)射參數(shù):Apopxin Green-488/525 nm, CytoCalcein-405/450 nm。

    六、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

    Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中,將轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞接種到未包被的96孔插入物的上部。侵入性分析使用涂有Matrigel (BD Biosciences)的transwell室(康寧公司)進(jìn)行。Matrigel在4 ℃解凍,以1:2的比例稀釋在DMEM中。轉(zhuǎn)染后,肺癌細(xì)胞(2×104)在上室不含胎牛血清的培養(yǎng)基和下室含胎牛血清-DMEM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。孵育36 h后,用棉簽去除過(guò)濾器頂部的細(xì)胞。浸潤(rùn)過(guò)濾器下表面的細(xì)胞用PBS洗滌2次,4%多聚甲醛固定15 min,室溫下用0.5%結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞。

    七、肺癌細(xì)胞小鼠移植癌模型

    選擇48只SPF級(jí),4~6周齡,體重21~30 g雌性裸小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,分為4組(n=12),oe-NC、oe-MAGI2-AS3、sh-NC、sh-RACGAP1。各組慢病毒轉(zhuǎn)染6×106個(gè)/mL PG49細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)24 h,收集并注射到動(dòng)物體內(nèi)。注射前,將細(xì)胞與基質(zhì)膠按體積比1:1混勻后,于裸鼠右側(cè)腋下接種3×106個(gè)細(xì)胞(0.2 mL懸液)。觀察腫瘤生長(zhǎng)情況,兩天測(cè)量一次小鼠的體重和腫瘤大小。腫瘤大小計(jì)算公式:V(mm3)=1/2L×D2。飼養(yǎng)4周后CO2法處死裸鼠,剝離腫瘤,稱重。

    八、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,首先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且方差齊,則兩組間比較為非配對(duì)t檢驗(yàn),每組三次重復(fù),多組間的比較應(yīng)采用單因素方差分析,多組之間兩兩比較,采用SNK-Q檢驗(yàn)的方法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、 lncRNA MAGI2-AS3在肺癌細(xì)胞中的作用

    qRT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3后,肺癌細(xì)胞系PG49中MAGI2-AS3相對(duì)表達(dá)量明顯增加(t=1.91,P<0.01)(見(jiàn)圖1)。

    圖1 qRT-PCR檢測(cè)各組lncRNA MAGI2-AS3轉(zhuǎn)染效率注:表示與oe-NC組相比:*P<0.05。

    二、 lncRNA MAGI2-AS3對(duì)PG49細(xì)胞增殖的影響

    EdU增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3后,EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較oe-NC組顯著下降(t=1.77,P<0.01)(見(jiàn)圖2)。

    圖2 調(diào)控肺癌細(xì)胞系PG49中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3含量對(duì)細(xì)胞增殖的影響,DAPI(藍(lán)色)染色細(xì)胞核, FITC(綠色)標(biāo)記MAGI2-AS3蛋白(800×)

    三、 lncRNA MAGI2-AS3對(duì)PG49細(xì)胞凋亡的影響

    細(xì)胞凋亡/壞死檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3后,凋亡細(xì)胞數(shù)較oe-NC組顯著增多(t=1.30,P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

    圖3 肺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3含量對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;標(biāo)尺為50μm,(×200)

    四、 lncRNA MAGI2-AS3對(duì)細(xì)胞遷移的影響

    Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3后,侵襲細(xì)胞數(shù)較oe-NC組顯著下降(t=2.49,P<0.01)(圖4)。以上結(jié)果說(shuō)明lncRNA MAGI2-AS3對(duì)肺癌有抑制作用。

    圖4 調(diào)控肺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3含量對(duì)細(xì)胞遷移的影響;標(biāo)尺為50μm (×400)

    五、 lncRNA MAGI2-AS3在體內(nèi)抑制肺癌

    體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,sh-RACGAP1組瘤體積顯著小于sh-NC組;oe-MAGI2-AS3組形成的腫瘤體積明顯小于oe-NC組;說(shuō)明MAGI2-AS3在體內(nèi)可以抑制肺癌的發(fā)展(sh-RACGAP1組vs.sh-NC組P<0.05;oe-MAGI2-AS3組vs.oe-NC組P<0.05),sh-RACGAP1組瘤的重量顯著小于sh-NC組;oe-MAGI2-AS3組形成的腫瘤的重量明顯小于oe-NC組(sh-RACGAP1組vs.sh-NC組P<0.05;oe-MAGI2-AS3組vs.oe-NC組P<0.05)(見(jiàn)圖5)。綜上所述,在體內(nèi)過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3或抑制RACGAP1表達(dá),可抑制腫瘤生長(zhǎng)。

    圖5 四周后各組肺癌模型小鼠移植瘤體積大小和瘤體質(zhì)量

    討 論

    肺癌發(fā)病率和死亡率目前居惡性腫瘤的首位,探究新的肺癌相關(guān)基因?qū)ρ芯科浒l(fā)病機(jī)制及研發(fā)新的診斷和治療藥物有重要意義。雖然大多數(shù)肺癌與吸煙有關(guān),但世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界25%的肺癌發(fā)生在從不吸煙的人群中[9],與幾十年前肺癌主要是吸煙男子常患疾病形成鮮明對(duì)比的是,現(xiàn)在婦女肺癌的發(fā)病率與男子相當(dāng)或高于男子,并且在世界許多地區(qū)正以驚人的速度上升。因此,僅僅是避免吸煙,并不能很好的降低肺癌的發(fā)病率,仍然需要從源頭上解決肺癌發(fā)病問(wèn)題。研究表明RNA通常可以根據(jù)它們是否具有編碼蛋白質(zhì)的能力分為兩類蛋白質(zhì)編碼RNA和非編碼RNA,非編碼RNA (ncRNA) 約占所有基因組轉(zhuǎn)錄物的98%,可分為短 ncRNA(<200個(gè)核苷酸)和長(zhǎng) ncRNA(lncRNA,>200個(gè)核苷酸)[10]。大多數(shù)肺癌病人確診時(shí)已是晚期且出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移,手術(shù)不能徹底根治,因此分子靶向藥物因其靶向、安全、方便等優(yōu)點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn),分子機(jī)制的研究至關(guān)重要。lncRNA可通過(guò)相互調(diào)控作用,促進(jìn)或抑制腫瘤的形成、進(jìn)展,并且對(duì)肺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后及診斷等起重要作用[11]。本研究,過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3后,凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多,說(shuō)明MAGI2-AS3促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,MAGI2-AS3在乳腺癌組織中的表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3可通過(guò)靶向miR-374a/PTEN通路抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[12]。此外,還有研究發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌患者血漿和血小板中MAGI2-AS3的水平明顯低于健康對(duì)照組,MAGI2-AS3水平與腫瘤轉(zhuǎn)移(TNM)分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有相關(guān)性[13]。已知,MAGI2-AS3在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3通過(guò)miR-23a-3p/PTEN軸抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲能力,與本研究中,MAGI2-AS3抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的結(jié)果相符合[14]。已知,MAGI2-AS3通常在肺癌等腫瘤中表達(dá)。本研究結(jié)果表明過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3抑制肺癌細(xì)胞增殖。在肺癌瘤體內(nèi)模型中,過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3,可抑制腫瘤生長(zhǎng),過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3后,小鼠移植瘤組織體積與重量均明顯下降。目前研究已經(jīng)證實(shí),RACGAP1在結(jié)直腸癌、子宮癌肉瘤、胃癌、結(jié)直腸癌和食管癌等多種惡性腫瘤呈現(xiàn)高表達(dá)[15]。在本研究中,過(guò)抑制RACGAP1表達(dá),可抑制腫瘤生長(zhǎng)小鼠移植瘤組織體積與重量均明顯下降。

    研究報(bào)道,MAGI2抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移及促進(jìn)其凋亡[16]。前期研究表明,lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞系中均低表達(dá),過(guò)表達(dá)lncRNA MAGI2-AS3引起Fas、FasL的表達(dá)上調(diào),表明MAGI2-AS3可能通過(guò)抑制Fas/FasL信號(hào)通路,而潛在地抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)MAGI2-AS3可以抑制PG49細(xì)胞增殖和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,表明MAGI2-AS3在肺癌的調(diào)控過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

    本研究證實(shí)在肺癌細(xì)胞中,上調(diào)MAGI2-AS3可抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MAGI2-AS3是肺癌的潛在分子靶點(diǎn),為肺癌的分子靶向治療提供了潛在的研究方向。

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