脾多肽對化療所致血小板減少癥雌鼠的療效及促血小板生成的機制研究*

王如玥，謝飛，王欣，李紅玉

（蘭州大學1.生命科學學院，2.藥學院，甘肅蘭州 730000）

化學治療藥物（簡稱化療）干預(yù)是臨床上治療癌癥常用方案之一，但不可避免地給患者帶來一系列嚴重的不良反應(yīng)?；熞鸬难“鍦p少癥是眾多不良反應(yīng)之一，其與劑量限制性毒性骨髓抑制緊密相關(guān)[1]。當血小板減少嚴重時需中斷化療，可能危及患者生命[2]。目前，國內(nèi)治療血小板減少癥的主要方法為輸注血小板，其主要藥物為重組細胞因子白細胞介素11（rhIL-11）、重組人血小板生成素（rhTPO）[3]。然而輸注血小板不僅療效改善持續(xù)時間短，還會增加輸血過敏性反應(yīng)的風險[4]。重組細胞因子因作用機制不同，應(yīng)用也受到多方面限制，如：rhIL-11 具有心血管毒性[5]；rhTPO 使患者產(chǎn)生中和性抗體，可能導致藥效下降[6]。因此，現(xiàn)有方案并不能完全滿足化療需降低血小板減少風險的需求，尋找安全有效的新藥物、新方案具有極高的應(yīng)用價值。脾多肽注射液是一種提取自小牛脾臟的天然多肽類藥物，其成分為分子量＜6 kD 的多肽、游離氨基酸、核酸和總糖。臨床中脾多肽注射液用于改善腫瘤患者的免疫功能，減少不良反應(yīng)[7]。有研究顯示脾多肽注射液能夠緩解化療后的骨髓抑制并恢復(fù)患者的骨髓造血功能[8]。因此，評估脾多肽注射液對化療所致血小板減少癥的療效并進一步研究其相關(guān)機制至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

85 只SPF 級昆明雌性小鼠[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（甘）2015-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2018-0002]，6～8 周齡，體重（20±2）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，由蘭州大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

重組人血小板生成素rhTPO（沈陽三生制藥有限公司，批號：201804016），卡鉑（山東齊魯制藥有限公司，批號：WB2J1611029），脾多肽注射液（吉林豐生制藥有限公司，批號：20170926），血小板稀釋劑、1%草酸銨水溶液、瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液、牛血清白蛋白BSA（北京索萊寶科技有限公司），紅細胞裂解液、PE-大鼠抗小鼠CD41 抗體（美國BD Biosciences 公司），小鼠干細胞因子ELISA 試劑盒、小鼠血小板生成素ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。

1.3 主要儀器

PH100-2A41L-A 型普通生物學光學顯微鏡（上海鳳凰光學儀器六廠），血球計數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司），CT15E 型高速離心機、CF16RX Ⅱ型低溫高速離心機（日本HITACHI 株式會社），BX53 型正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），LSRFortessa 流式細胞分析儀（美國BD Biosciences 公司），680 型酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 方法

將雌鼠隨機分為對照組、模型組、rhTPO 陽性對照組[3000 u/（kg·d）]、脾多肽注射液低劑量組[6 mg/（kg·d）]及脾多肽注射液高劑量組[60 mg/（kg·d）]，分別為20 只、20 只、20 只、5 只和20 只。其中，脾多肽給藥劑量以雌鼠與人等效劑量換算獲得[9]。

1.4.1 血小板計數(shù)各組分別選取5 只雌鼠?；煹? 天，正常組腹腔注射0.3 mL 生理鹽水，其他4 組單次腹腔注射0.3 mL 卡鉑（70 mg/kg），復(fù)制血小板減少癥模型[10]；次日起，rhTPO 陽性對照組、脾多肽注射液低劑量組、脾多肽注射液高劑量組腹腔注射0.3 mL 相應(yīng)藥物，正常組和模型組腹腔注射等量0.3 mL 生理鹽水，均1 次/d，連續(xù)15 d。各組從化療前1 天（第0 天）開始隔日尾靜脈采血，光學顯微鏡下計血小板數(shù)。

1.4.2 實驗動物分組及干預(yù)分別選取對照組、模型組、rhTPO 陽性對照組和脾多肽注射液高劑量組15 只雌鼠?；煹? 天，正常組腹腔注射0.3 mL 生理鹽水，其他3 組單次腹腔注射0.3 mL 卡鉑（70 mg/kg），復(fù)制血小板減少癥模型[10]。第2 天起，rhTPO 陽性對照組及脾多肽注射液高劑量組腹腔注射0.3 mL 相應(yīng)藥物，正常組和模型組腹腔注射0.3 mL 生理鹽水，1 次/d，連續(xù)6 d。

1.4.3 骨髓巨核細胞計數(shù)化療第8 天，每組抓取5 只雌鼠，取單側(cè)股骨，預(yù)冷2 mL PBS 并分次沖洗髓腔至顏色發(fā)白，將獲得骨髓細胞收集至EP 管中。以2 900 r/min 離心5 min，收集骨髓細胞，加入等量50%卵清稀釋液，輕柔混勻，吸取骨髓稀釋液，置于載玻片上，涂片，自然干燥后，瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液染色，顯微鏡下100 倍計數(shù)全片骨髓巨核細胞。

1.4.4 骨髓巨核細胞百分率的檢測化療第8 天各組收集雌鼠骨髓細胞，以2 900 r/min 離心5 min，棄上清液，加入裂解液除去紅細胞[11]。洗滌后通過白蛋白梯度分離法[12]富集骨髓巨核細胞，鏡檢可見濃縮2～3 倍的巨核細胞。然后用預(yù)冷2 mL PBS洗滌富集后的骨髓巨核細胞2 次，PE-大鼠抗小鼠CD41 抗體對巨核細胞進行染色，室溫避光孵育20 min 后洗滌，重懸細胞轉(zhuǎn)至流式管中上機檢測[13]。

1.4.5 血清細胞因子水平的檢測化療第8 天各組摘取雌鼠眼球采血，4℃靜置過夜，以3 200 r/min 離心5 min，收集血清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測雌鼠血清細胞因子SCF 和TPO 的水平。根據(jù)標準品質(zhì)量濃度在酶標儀450 nm 處讀取光密度值，繪制標準曲線并計算血清細胞因子含量。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較用Tukey HSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點雌鼠血小板計數(shù)比較

各組雌鼠化療前及化療后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d 和16 d 血小板計數(shù)比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點血小板計數(shù)有差異（F=22.413，P=0.000）；②各組血小板計數(shù)有差異（F=6.822，P=0.006）；③各組血小板計數(shù)變化趨勢有差異（F=6.326，P=0.008）。由于脾多肽注射液低劑量組較模型組在化療后的給藥周期內(nèi)未顯著提高血小板計數(shù)，故本研究用脾多肽注射液高劑量組開展后續(xù)研究。見表1。

表1 各組不同時間點雌鼠血小板計數(shù)比較 （n=5，×109/L，±s）

表1 各組不同時間點雌鼠血小板計數(shù)比較 （n=5，×109/L，±s）

注：①與0 d比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別正常組模型組rhTPO陽性對照組脾多肽注射液低劑量組脾多肽注射液高劑量組16 d 1.16±0.07②0.87±0.07①1.21±0.06②0.92±0.07①1.10±0.13②0 d 1.13±0.04 1.18±0.04 1.25±0.03 1.19±0.04 1.15±0.06 2 d 1.09±0.05 1.13±0.05 1.15±0.04 1.17±0.05 1.22±0.09 4 d 1.05±0.07 1.19±0.07 1.09±0.6 1.17±0.07 1.23±0.13 6 d 1.06±0.09 0.95±0.09①1.24±0.07②1.04±0.09 0.93±0.16 8 d 1.18±0.11②0.72±0.11①1.13±0.09②0.68±0.11①0.90±0.20 10 d 1.09±0.07②0.5±0.07①0.95±0.06①②0.57±0.07①0.72±0.13①②12 d 0.98±0.10②0.47±0.10①0.89±0.08①②0.59±0.10①0.82±0.18②14 d 0.99±0.07②0.67±0.07①0.82±0.05①0.72±0.07①0.92±0.11②

2.2 各組雌鼠化療后骨髓巨核細胞數(shù)量比較

鏡下觀察巨核細胞形態(tài)特征，其細胞核及胞體較其他細胞大，且隨著巨核細胞的成熟，核多為不規(guī)則形態(tài)，胞質(zhì)愈豐富。細胞染色后，深紫色部分為核，淺紫色部分為胞質(zhì)（見圖1）。正常組、模型組、rhTPO 陽性對照組和脾多肽注射液高劑量組的骨髓巨核細胞數(shù)量分別為（402.67±79.51）個、（122.67±42.08）個、（437.33±101.51）個和（304.00±34.92）個，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=16.246，P=0.000）。進一步兩兩比較，模型組低于正常組（P＜0.05），rhTPO 陽性對照組、脾多肽注射液高劑量組高于模型組（P＜0.05）。

圖1 4組雌鼠骨髓巨核細胞涂片 （瑞氏-吉姆薩染色×100）

2.3 各組雌鼠化療后骨髓巨核細胞占比比較

正常組、模型組、rhTPO 陽性對照組和脾多肽注射液高劑量組雌鼠骨髓巨核細胞百分率分別為（15.3±1.87）% 、（9.02±1.88）% 、（15.4±2.50）% 及（12.9±1.07）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=12.420，P=0.000）。進一步兩兩比較，模型組低于正常組（P＜0.05），rhTPO 陽性對照組高于模型組（P＜0.05），脾多肽注射液高劑量組高于模型組（P＜0.05）。該結(jié)果與骨髓巨核細胞計數(shù)觀察結(jié)果變化趨勢相似。見圖2。

圖2 4組雌鼠骨髓巨核細胞百分率的流式細胞圖

2.4 各組雌鼠化療后血清細胞因子水平比較

各組雌鼠血清細胞因子SCF、rhTPO 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組高于正常組（P＜0.05），脾多肽注射液高劑量組SCF 水平低于模型（P＜0.05），rhTPO 陽性對照組rhTPO 水平低于模型組（P＜0.05）。見表3。

表3 4組雌鼠化療后血清細胞因子水平比較（n=5，pg/mL，±s）

表3 4組雌鼠化療后血清細胞因子水平比較（n=5，pg/mL，±s）

組別正常組模型組rhTPO陽性對照組脾多肽注射液高劑量組F 值P 值SCF 16.86±3.92 32.94±10.4 26.57±5.11 18.17±1.58 5.994 0.006 rhTPO 4.10±2.23 9.88±0.4 5.65±1.67 7.79±0.17 3.854 0.036

3 討論

血小板在止血和血管修復(fù)中發(fā)揮重要作用，血小板數(shù)量過低可能導致患者致命性出血[14]。在臨床上化療會導致癌癥患者血小板減少，甚至增加出血風險[15]。例如，卡鉑、吉西他濱或紫杉醇等化療藥物在治療中可能會導致血小板減少，這一劑量限制性毒性對化療效果造成很大影響[16-17]。為了確保化療順利進行，臨床中化療時不得不根據(jù)患者出血和血小板計數(shù)情況，給予細胞因子藥物或輸注血小板[18]。脾多肽注射液廣泛應(yīng)用于腫瘤化療的輔助治療，不僅能夠調(diào)節(jié)機體免疫力，增加化療患者的耐受性，還對化療患者的骨髓起保護作用[19]。研究表明，脾多肽注射液能有效改善化療后肺癌患者的血細胞計數(shù)情況[20]，提示脾多肽可能具有改善血小板減少的作用。本研究評估脾多肽對卡鉑化療后雌鼠血小板計數(shù)的作用情況。結(jié)果表明，70 mg/kg卡鉑第8～16 天成功復(fù)制了穩(wěn)定的血小板減少癥模型。同時，60 mg/（kg·d）脾多肽注射液干預(yù)后，于第10～16 天顯著上調(diào)了雌鼠的血小板數(shù)量，說明該劑量下的脾多肽注射液能夠改善血小板減少。

巨核細胞是骨髓中能夠產(chǎn)生血小板的常見大型多倍體細胞，由骨髓中的造血干細胞發(fā)育而來[21]。骨髓巨核細胞經(jīng)過成熟以及血小板前體的形成和釋放，最終讓血小板釋放至外周血中[22]。當化療藥物引起骨髓抑制時，與血小板生成途徑相關(guān)的干細胞、祖細胞及巨核細胞會受到不同程度的破壞，從而導致血小板的生成途徑減少[23-24]。有研究發(fā)現(xiàn)脾多肽能夠增加化療后雌鼠骨髓有核細胞的數(shù)量，改善化療導致的骨髓抑制[25]。因此，筆者通過骨髓巨核細胞的檢測，進一步研究脾多肽對化療后雌鼠血小板減少癥的作用機制?；煹?天，顯微鏡觀察骨髓巨核細胞發(fā)現(xiàn)，模型組雌鼠骨髓巨核細胞數(shù)量顯著減少，這與用卡鉑復(fù)制大鼠血小板減少癥模型后，巨核細胞于第9 天顯著減少的結(jié)果相似[26]。巨核細胞數(shù)量的減少可能與卡鉑導致的造血干細胞增殖顯著減少有關(guān)[27]。高劑量脾多肽干預(yù)后，模型鼠骨髓巨核細胞數(shù)量增加。采用流式細胞術(shù)檢測巨核細胞在骨髓有核細胞中的百分率，試驗結(jié)果與鏡下觀察結(jié)果相似。這進一步提示了脾多肽可能與化療后骨髓巨核細胞數(shù)量的增加有關(guān)，從而改善了血小板生成障礙。

細胞因子與血小板生成途徑密切相關(guān)，其在促進造血細胞增殖和分化上具有重要作用[28]。骨髓微環(huán)境中，TPO 能夠刺激巨核細胞增殖分化[29]。SCF 參與維持造血干細胞、祖細胞的存活，促進造血干細胞、祖細胞增殖，以及巨核細胞的增殖[30-31]。因此筆者進一步研究了脾多肽對血清細胞因子的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卡鉑化療誘導的雌鼠SCF水平升高。有研究表明，當外周血細胞數(shù)量減少時，細胞因子的水平上升[32]，上述報道與本研究結(jié)果相似。脾多肽注射液干預(yù)后，SCF 水平降低并趨向于正常組水平。這提示脾多肽注射液可能通過參與調(diào)節(jié)化療后雌鼠血清中的SCF 含量，保護血小板的生成途徑不被破壞。細胞因子SCF 已被證明能夠通過激活A(yù)kt，中和線粒體凋亡機制，抑制Caspase 活性，保護體外未成熟的巨核細胞免受化療藥物誘導的凋亡[33]。有研究報道，血小板生成素進入血液循環(huán)系統(tǒng)后，通過與血小板膜表面或者與骨髓巨核細胞膜表面的血小板生成素受體結(jié)合，以較低濃度維持巨核細胞以及血小板的正常水平[34]。因此，各組化療后給藥至第8 天，模型組由于血小板和巨核細胞生成減少，TPO 清除率降低，導致化療模型組TPO 水平高于正常組，而陽性對照組由于血小板數(shù)量和巨核細胞數(shù)量較模型組顯著升高，TPO 水平較模型組降低。同時，脾多肽注射液高劑量組較模型組巨核細胞數(shù)量顯著增加，但血小板數(shù)量無顯著增加，這可能是造成脾多肽注射液高劑量組TPO 水平與模型組無差異的原因之一。

綜上所述，相較于其他致血小板減少的化療藥物，卡鉑由于可以破壞骨髓中的造血干細胞，從而導致血小板減少的周期可能更長，且更難治療。而脾多肽可以通過參與調(diào)節(jié)血清SCF 水平，保護巨核系免受骨髓抑制損傷，緩解卡鉑所致血小板減少。這顯示了脾多肽在輔助化療時拮抗血小板減少的優(yōu)勢。筆者發(fā)現(xiàn)脾多肽注射液通過調(diào)節(jié)化療后雌鼠血清SCF 水平，增加化療后骨髓巨核細胞數(shù)量，緩解卡鉑誘導的血小板減少，為脾多肽在臨床中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。