沙地柏根際促生耐寒短桿菌SDB5的分離和功能鑒定

王建武,相微微,陳 花,王一昭,劉 暢,屈香香,王 鵬,尚愛(ài)軍

(榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,陜西 榆林 719000)

沙地柏(Sabina vulgaris),又稱臭柏,柏科圓柏屬的一種灌木,主要分布在中國(guó)西北天山、祁連山等地區(qū),其耐干旱貧瘠環(huán)境,有較強(qiáng)的適應(yīng)性,在西北地區(qū)被用來(lái)防風(fēng)固沙,凈化環(huán)境,保持水土,改良土壤等[1]。植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR),是指生活在根系土壤周圍或者在植物根際中附生的有益菌[2]。PGPR 定殖于植物根際系統(tǒng),有改善土壤,固氮,解磷,促進(jìn)植物生長(zhǎng),提高作物產(chǎn)量,提高植物耐受性,防治害蟲(chóng),分泌植物激素等作用,在植物快繁中也具有較大的應(yīng)用潛力[3-5]。不同種類的PGPR 與不同植物互作產(chǎn)生的促生效果也有很大差異。李永斌等[6]研究發(fā)現(xiàn)不同菌株在小麥株高、鮮質(zhì)量及增產(chǎn)效果上差異較大,其中枯草芽胞桿菌56在減施尿素10%的條件下使小麥產(chǎn)量提高10.4%。吳東升[7]對(duì)7種PGPR 研究發(fā)現(xiàn),不同種類的PGPR 在促進(jìn)西瓜生長(zhǎng)、改善元素吸收及品質(zhì)改良效果上有差異;謝雨歆等[8]發(fā)現(xiàn)3種PGPR 混合菌劑可改善烤煙的農(nóng)藝性狀及煙葉的化學(xué)品質(zhì),同時(shí)降低烤煙的發(fā)病率。金月波[9]和祝凌云[10]分別發(fā)現(xiàn)不同菌株在促進(jìn)水稻種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)方面都有差異。

土地鹽堿化是影響植物生長(zhǎng)與作物產(chǎn)量的重要問(wèn)題之一,目前中國(guó)鹽堿化土地面積還在逐年增加[11]。土地鹽堿化對(duì)植物有嚴(yán)重的危害作用。土壤鹽堿成分過(guò)高會(huì)導(dǎo)致土壤p H 增高,影響植物對(duì)某些元素的吸收,導(dǎo)致植物缺失營(yíng)養(yǎng)元素,同時(shí)還會(huì)造成植物生理干旱,危害植物生長(zhǎng)發(fā)育;會(huì)抑制水稻種子的萌發(fā)與生長(zhǎng),影響穎花數(shù)量與幼穗分化;會(huì)干擾氣孔閉合,影響二氧化碳進(jìn)出與植物的光合作用,導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育減緩與產(chǎn)量降低[12-15]。PGPR 在改良土壤,促進(jìn)植物增產(chǎn),以及提高作物耐受性和治理土地鹽堿化方面,已經(jīng)表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)與顯著效果[4]。姜煥煥等[16]研究表明,PGPR 通過(guò)調(diào)節(jié)植物鹽堿抗性相關(guān)基因及蛋白的表達(dá),可以增強(qiáng)植物的抗鹽堿能力。添加耐鹽堿PGPR 已逐漸發(fā)展成一種新的緩解鹽堿脅迫的處理方法。劉佳莉等[17]和龐學(xué)兵等[18]分別發(fā)現(xiàn)具有ACC脫氨酶活性的植物促生菌可促進(jìn)燕麥和棉苗的生長(zhǎng)并提高其鹽堿抗性。袁海等[19]研究發(fā)現(xiàn)在不同濃度NaCl脅迫下不同種類的芽孢桿菌使植株的株高、地上部及根系鮮質(zhì)量增加,并降低了玉米葉片的相對(duì)電導(dǎo)率。王華笑等[20]和陳小娟等[21]分別發(fā)現(xiàn)根際促生芽孢桿菌能增強(qiáng)玉米的耐鹽脅迫能力。

利用PGPR 進(jìn)行土壤改良并促生、增產(chǎn)已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。本試驗(yàn)擬從沙地柏中分離PGPR,對(duì)其形態(tài)和特性進(jìn)行鑒定,并在盆栽和大田條件下研究其對(duì)水稻種子萌發(fā),植株耐鹽堿脅迫及生長(zhǎng)、產(chǎn)量等方面的影響,以明確其功能,以期為改良鹽堿地,提高鹽堿地效益,增加作物產(chǎn)量提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沙地柏采自陜西省神木市大保當(dāng)鎮(zhèn)沙地柏天然林中,采集其根部,放入自封袋冷藏并帶回實(shí)驗(yàn)室,保存于4 ℃冰箱,備用。水稻品種選用‘吉宏6號(hào)’,由寧夏原種場(chǎng)提供。

1.2 方法

1.2.1 沙地柏內(nèi)生細(xì)菌的分離及鑒定 沙地柏根部表面消毒后進(jìn)行沙地柏內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化,再進(jìn)行沙地柏內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)特性觀察及生理生化鑒定,內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA 序列測(cè)定及分析,內(nèi)生細(xì)菌耐鹽耐堿測(cè)定均參照艾銀婷[22]關(guān)于沙地柏根際促生細(xì)菌玫瑰色考克氏菌SDB9的分離及鑒定的方法。

1.2.2 菌體激素測(cè)定 LB 培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基,胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L)培養(yǎng)細(xì)菌1 d后,離心收集菌體,送至中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所進(jìn)行激素含量測(cè)定。

1.2.3 水稻種子萌發(fā)及植株生理指標(biāo)測(cè)定 (1)

種子萌發(fā)率測(cè)定:先用1×107cfu/m L 目標(biāo)菌液和蒸餾水分別浸種48 h后,撈出陰干。選取直徑為15 cm 的培養(yǎng)皿32個(gè),鋪上濾紙,分別用150 m L 濃 度 為0.02 mol/L、0.04 mol/L 和0.06 mol/L的Na2CO3溶液模擬輕、中、重度鹽堿脅迫培養(yǎng)接菌和未接菌的種子各100 粒,重復(fù)4 次。14 d后,記錄不同處理種子的萌發(fā)率,從而確定水稻種子所能耐受的鹽堿脅迫濃度。

(2)植株生理指標(biāo)測(cè)定:梯度Na2CO3模擬鹽堿脅迫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),重度脅迫下,水稻種子有40%以上能正常出芽生長(zhǎng)。選取長(zhǎng)為30 cm,寬20 cm,高8.7 cm 的方形花盆,將蛭石與營(yíng)養(yǎng)土按1∶2 的體積比混合后裝盆,每盆裝2 kg土。播種,待水稻幼苗高約5 cm 時(shí)間苗,每盆留20株,選取24盆幼苗,用1×107cfu/m L 目標(biāo)菌液和自來(lái)水分別澆灌處理12盆(每盆澆灌1 L),即為試驗(yàn)組和對(duì)照組。30 d后,對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組分別進(jìn)行3 次鹽堿(每盆澆灌1 L 濃度為0.02 mol/L、0.04 mol/L 和0.06 mol/L 的Na2CO3溶液)脅迫,間隔時(shí)間為7 d,3次脅迫處理后,繼續(xù)培養(yǎng)5 d,然后測(cè)定對(duì)照組和試驗(yàn)組的水稻葉綠素含量及氧化應(yīng)激生理指標(biāo)。耐鹽堿相關(guān)指標(biāo)測(cè)定參照艾銀婷[22]的測(cè)定方法。

1.2.4 大田試驗(yàn) (1)試驗(yàn)地概況及試驗(yàn)設(shè)計(jì):試驗(yàn)地位于寧夏回族自治區(qū)銀川市興慶區(qū)兵溝黃河大 橋,地 處38°24′43″N,106°27′24″E,海 拔1 105 m,年平均降水量200 mm,無(wú)霜期168 d,年平均有效積溫3 300 ℃。土壤類型為潮灌淤土,土壤肥力中等。土壤養(yǎng)分含量為有機(jī)質(zhì)3.22 g/kg,全氮0.21 g/kg,水解氮17.28 mg/kg,速效磷1.19 mg/kg,速效鉀40.05 mg/kg。挑選顏色和大小基本一致且飽滿的水稻種子1 kg,平均分成兩組,分別用1×107cfu/m L 目標(biāo)菌液和等量清水浸泡過(guò)夜,陰干,備用。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),分2個(gè)處理:試驗(yàn)組和對(duì)照組,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)小區(qū),每個(gè)小區(qū)面積為20 m2,長(zhǎng)5 m,寬4 m,條播播種量為160 g,行距20 cm。四周設(shè)4行保護(hù)行。以后均按傳統(tǒng)水稻種植方式進(jìn)行管理。10月份水稻成熟后,放干稻田中的水,晾曬1周。

(2)土壤含鹽量及p H 測(cè)定:在播種前,分別從試驗(yàn)組和對(duì)照組的每個(gè)小區(qū)中部位置取深度為0～20 cm 土壤,參照鮑士旦[23]的方法進(jìn)行含鹽量及p H 測(cè)定。

(3)水稻形態(tài)指標(biāo)測(cè)定:記錄水稻的出苗率及出苗期,并在成熟期選擇20個(gè)單株測(cè)定水稻株高、穗長(zhǎng)、穗下莖長(zhǎng)、穗基直徑、莖基直徑等地上部分指標(biāo)及根長(zhǎng)、根面積、根體積等地下部分指標(biāo)。

(4)水稻產(chǎn)量指標(biāo)測(cè)定:從各試驗(yàn)樣地中選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻的1 m2水稻樣本進(jìn)行采收,測(cè)定千粒質(zhì)量,單位平方米產(chǎn)量,重復(fù)3次,取平均值后計(jì)算理論產(chǎn)量(換算成14%含水率)。

(5)水稻根部形態(tài)指標(biāo)測(cè)定:用根系掃描儀掃描,然后用Win RHIZO PRO 2009 軟件(Regent Inc.,Quebec,Canada)進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)的量化處理分析。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0與Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及鑒定

2.1.1 內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)及菌落特征 從沙地柏根中分離提純到1株植物根際內(nèi)生細(xì)菌,編號(hào)為SDB5,高分辨率掃描結(jié)果顯示該菌長(zhǎng)約為2 667 nm,寬約為906.7 nm,桿狀(圖1-A),革蘭氏染色陽(yáng)性(圖1-B),在p H 7的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后,菌落呈白色。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌SDB5的形態(tài)鑒定Fig.1 Morphological identification of endophytic bacteria SDB5

2.1.2 SDB5菌16S r DNA 序列分析 以內(nèi)生細(xì)菌SDB5的16S r DNA 序列為探針,登錄NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行BLAST 序列比對(duì),結(jié)果表明內(nèi)生細(xì)菌SDB5的16S r DNA 序列與耐寒短桿菌Brevibacterium frigoritoleransstrain QT343(登錄號(hào)MT043730.1)和Brevibacterium frigoritoleransstrain TS20(登錄號(hào)MN710443.1)16S r DNA 序列的同源性最高(100%),因此內(nèi)生細(xì)菌SDB5被鑒定為耐寒短桿菌(Brevibacterium frigoritolerans)。

2.1.3 SDB5菌耐鹽耐堿測(cè)定 利用不同鹽濃度和p H 的固體LB 培養(yǎng)基,對(duì)菌液梯度稀釋后進(jìn)行滴板試驗(yàn)(Drop test)(圖2-A,圖2-B),結(jié)果表明耐寒短桿菌SDB5 能夠在濃度為0～1 mol/L NaCl培養(yǎng)基或p H 6～11 培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。在濃度為1.5 mol/L NaCl的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng),在p H 12的培養(yǎng)基上基本不能生長(zhǎng)。鹽堿復(fù)合脅迫與上述單獨(dú)脅迫結(jié)果類似,說(shuō)明耐寒短桿菌SDB5具有耐鹽堿能力,且在酸性(p H 6)條件下也能生長(zhǎng)。

圖2 耐寒短桿菌SDB5的耐鹽堿測(cè)定Fig.2 Identification of salt and alkali tolerance of Brevibacterium frigoritolerans SDB5

2.2 菌體激素含量測(cè)定

氣相質(zhì)譜測(cè)定其激素含量結(jié)果表明(表1):SDB5菌株內(nèi)生長(zhǎng)素(IAA)含量為356.90 ng/g,細(xì)胞分裂素主要是異戊烯基腺苷(iPR)和異戊烯基腺嘌呤(iP),其含量分別為2.13 ng/g和48.57 ng/g,而反式玉米素類細(xì)胞分裂素如反式玉米素(tZ)、反式玉米素核苷(tZR)、和反式玉米素-7-糖苷(t Z7G)含量很少。

表1 SDB5菌體內(nèi)細(xì)胞分裂素(CTKs)和生長(zhǎng)素(IAA)含量(ˉx±s)Table 1 Contents of cytokinins(CTKs)and auxin(IAA)of SDB5 strain ng/g

2.3 水稻種子萌發(fā)及植株形態(tài)、生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3.1 種子萌發(fā)結(jié)果 如表2所示,SDB5菌處理的種子在非脅迫下,14 d 后的發(fā)芽率提高4.3%,鹽堿脅迫下,14 d 后的總發(fā)芽率都有降低;隨著Na2CO3濃度的升高,種子的發(fā)芽率逐漸降低,但相同脅迫濃度下,SDB5菌處理種子的萌發(fā)率高于CK,低鹽堿脅迫下,種子的發(fā)芽率比CK 高2.1%,中度鹽堿脅迫下,種子的發(fā)芽率比CK 高4.5%,重度鹽堿脅迫下,種子的發(fā)芽率比CK 高15.2%,差異顯著。結(jié)果說(shuō)明在鹽堿脅迫下,SDB5菌能增強(qiáng)水稻種子的萌發(fā)率,但重度脅迫使種子的萌發(fā)率低于60%,嚴(yán)重影響種子的發(fā)芽率。

表2 鹽堿脅迫下處理14 d后種子萌發(fā)情況統(tǒng)計(jì)(ˉx±s)Table 2 Statistics of germination rate of seeds under saline-alkali stress after 14 days

2.3.2 水稻形態(tài)及生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 (1)盆栽水稻形態(tài)比較:從圖3可以看出,用菌處理60 d的水稻植株比對(duì)照葉片相對(duì)較綠,分蘗能力更強(qiáng)。

圖3 鹽堿脅迫下SDB5處理和CK 水稻表型對(duì)比Fig.3 Phenotypic comparison of rice between SDB5 and CK under saline alkali stress

(2)水稻生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果:結(jié)果如圖4 所示:SDB5組葉綠素含量顯著高于CK,提高90%(圖4-A),超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性高于CK,但差異并不顯著(圖4-B,圖4-C),過(guò)氧化氫酶(CAT)活性顯著高于CK,提高95%(圖4-D),丙二醛(MDA)含量高于CK,但差異不顯著(圖4-E),脯氨酸含量顯著高于CK,提高73%(圖4-F)。

圖4 鹽堿脅迫下SDB5處理和CK 水稻氧化應(yīng)激生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination of physiological indexes of rice oxidative stress in SDB5 treated and CK under saline-alkali stress

2.4 大田試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 水稻出苗及形態(tài)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 如表3所示:耐寒短桿菌SDB5組與CK 相比,水稻出苗期沒(méi)有明顯變化,但出苗率提高20%,株高增加3.8%,穗長(zhǎng)增加12.4%,穗下莖增長(zhǎng)3.9%;莖基直徑增加2.9%,穗基直徑增加48%,穗基直徑、穗長(zhǎng)差異顯著,株高、穗下莖長(zhǎng)、莖基直徑差異不顯著;根部形態(tài)指標(biāo)中側(cè)根數(shù)量明顯增多,根長(zhǎng)增加43%,根表面積增加46%,根系體積增大33%。2.4.2 水稻產(chǎn)量指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 由表4可知,與CK 相比,SDB5組的穗實(shí)粒數(shù)增加33.3%,差異顯著;水稻理論產(chǎn)量為622 kg,CK 理論產(chǎn)量為527 kg,增產(chǎn)18.2%。

表3 SDB5與CK 水稻形態(tài)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(ˉx±s)Table 3 Morphological index results of SDB5 and CK rice

表4 SDB5與CK 水稻產(chǎn)量指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(ˉx±s)Table 4 Results of rice output indexes of SDB5 and CK

3 討論

植物內(nèi)生菌的分離及應(yīng)用可以針對(duì)同種植物,如王秋平[24]和韓笑[25]對(duì)水稻根際內(nèi)生菌的分離及應(yīng)用,也可以針對(duì)不同種的植物,如袁東[26]將月季來(lái)源的內(nèi)生耐鹽菌株應(yīng)用到水稻中。筆者所在團(tuán)隊(duì)則是從陜北抗逆性極強(qiáng)的沙地柏根際中分離出兩株內(nèi)生促生菌,一株鑒定為玫瑰色考克氏菌(Kocuria rosea),命名為SDB9[22,27],另一株即為本試驗(yàn)的研究對(duì)象,鑒定為耐寒短桿菌,命名為SDB5[28]。研究發(fā)現(xiàn),SDB5菌的耐鹽堿性雖然低于SDB9[22,27],但在p H 11,1 mol/L NaCl條件下能生長(zhǎng),說(shuō)明耐鹽堿性較強(qiáng)。雖然兩個(gè)菌株來(lái)源相同,但菌體內(nèi)激素含量有明顯差異,SDB5菌株內(nèi)IAA(生長(zhǎng)素)含量為356.9 ng/g,比SDB9菌體內(nèi)IAA 含量低95.4%,細(xì)胞分裂素主要成分相同,反式玉米素類細(xì)胞分裂素含量均很少,但異戊烯基腺苷(iPR)含量為2.13 ng/g,比SDB9菌少92.6%,而異戊烯基腺嘌呤(iP)為48.57 ng/g,比SDB9菌高33.4倍[20,25]。說(shuō)明即使來(lái)源相同的不同菌株在分泌激素方面,如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等,種類及含量均存在較大差異,促生機(jī)理也應(yīng)存在較大差異。

在梯度Na2CO3模擬鹽堿脅迫下,SDB5 菌能提高水稻的萌發(fā)率并能顯著提高水稻中葉綠素含量,增強(qiáng)水稻光合作用,這與前人對(duì)根際促生菌的研究結(jié)果相一致[23-25]。SDB5菌能使水稻葉片中氧化應(yīng)激酶SOD、POD、CAT 活性增加,其中CAT 活性顯著增加,SOD 和POD 活性稍微增加,但與對(duì)照差異不顯著;這些抗氧化酶活性的增強(qiáng),減少了水稻中活性氧的積累,促進(jìn)了植株的正常生長(zhǎng)。脯氨酸含量顯著增加,說(shuō)明SDB5菌能誘導(dǎo)植物提高脯氨酸含量來(lái)抵御外界環(huán)境脅迫。MDA 含量稍微增加,但與對(duì)照差異不顯著。綜上,說(shuō)明耐寒短桿菌SDB5可以提高水稻植株的耐鹽堿性,主要是通過(guò)減輕鹽堿脅迫對(duì)葉綠素合成的抑制、誘導(dǎo)滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的增加,來(lái)提高水稻耐鹽堿性,這與前人對(duì)PGPR 的研究結(jié)果相一致[26]。有些研究表明PGPR 能在正常生長(zhǎng)條件下增強(qiáng)植物抗氧化酶的活性,但脅迫下抗氧化酶活性降低[24-25],與本試驗(yàn)結(jié)果不一致,原因可能是不同內(nèi)生菌對(duì)植物氧化應(yīng)激能力的影響有差異,具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

大田試驗(yàn)條件下,在p H 8以上的堿性土壤中,接種SDB5菌水稻植株地上及地下生物量均增加:穗基直徑及穗長(zhǎng)顯著增加,根長(zhǎng)、根表面積及根體積也顯著增加。對(duì)經(jīng)濟(jì)性狀而言,千粒質(zhì)量稍有降低,穗實(shí)粒數(shù)增加,理論產(chǎn)量提高18.2%,增產(chǎn)效果顯著。上述研究進(jìn)一步證明在鹽堿化土壤中,SDB5 菌能成功定殖到水稻根部并發(fā)揮促生、增產(chǎn)作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從沙地柏根中分離到1株耐寒短桿菌SDB5。該菌株內(nèi)IAA(生長(zhǎng)素)和細(xì)胞分裂素中的異戊烯基腺嘌呤(iP)含量較高,而反式玉米素類含量很少。該菌能夠在濃度0～1 mol/L NaCl培養(yǎng)基或p H 6～11培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。鹽堿復(fù)合脅迫與上述單獨(dú)脅迫結(jié)果類似,說(shuō)明該菌有耐鹽堿能力。梯度Na2CO3模擬鹽堿脅迫下,該菌能使水稻萌發(fā)率提高,葉綠素含量、CAT 活性、脯氨酸含量均顯著提高,說(shuō)明該菌能增強(qiáng)水稻的耐鹽堿性。大田試驗(yàn)結(jié)果表明:在土壤含鹽量0.22%,p H 8.4輕度鹽堿地上,該菌能使水稻地上和地下部分生物量增加,尤其是穗基直徑顯著增粗,穗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根面積、根體積顯著增加,水稻理論產(chǎn)增加18.2%,證明SDB5菌不僅促進(jìn)水稻生長(zhǎng)還能提高水稻產(chǎn)量。綜上所述,沙地柏的內(nèi)生耐寒短桿菌SDB5可以提高水稻耐鹽堿性,并在鹽堿條件下,使水稻的生長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng),產(chǎn)量提高。

本研究成功分離了耐寒短桿菌SDB5,并證明其在鹽堿條件下,對(duì)水稻有促生、增產(chǎn)效果,這一研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)新型微生物菌劑,提高鹽堿地效益,促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了新的途徑。