RAW264.7細(xì)胞MyD88基因缺失株構(gòu)建①

王 燕 陳 為 董明鑫 孫成彪 張劍旭 常 影 劉文森 許 娜③

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所，長春 130122）

近年隨著“魔剪”CRISPR/Cas9技術(shù)崛起，基因編輯在生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域掀起了一股研究熱潮［1］。與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)（如鋅指核酸酶、活因子樣效應(yīng)物核酸酶等）相比，CRISPR/Cas9技術(shù)采用特殊小向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）靶向目標(biāo)基因，具有操作簡便、靶向效應(yīng)強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前基因研究領(lǐng)域的有力工具，已廣泛用于目的基因篩選編輯和藥物靶點(diǎn)篩選等領(lǐng)域［2-3］。髓樣分化因子88（myeloid-differentiation primary response protein 88，MyD88）是Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要接頭分子，其介導(dǎo)的TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)稱為MyD88依賴型途徑，以形成MyD88、IRAK4和IRAK1復(fù)合體為標(biāo)志，早期活化NF-κB和MAPK為特征［4］。近年研究發(fā)現(xiàn)，MyD88不僅在固有免疫中發(fā)揮重要作用，還可調(diào)控適應(yīng)性免疫，是連接二者的橋梁，但部分機(jī)制尚不明確［5］。為深入開展MyD88功能及相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究，本研究擬采用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)敲除MyD88基因，制備MyD88缺失的穩(wěn)定RAW264.7細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 材料293T細(xì)胞株、RAW264.7細(xì)胞株、大腸桿菌菌株DH5-α均為本實(shí)驗(yàn)室保存；三質(zhì)粒系統(tǒng)（pSPAX2、pMD2G和穿梭質(zhì)粒）、pHBLV-U6-gRNAEF1-ZsGreen載體（漢恒）；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒（Axygen）；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶（TaKaRa）；LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑盒、胎牛血清、1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶、Puromycin（Life）；RNA提取試劑盒（奕杉）；MyD88抗體（Cell Signaling Technology）；羊抗兔IgG抗體（Proteintech）；Luminata forte western HRP substrate（Merck Millipore）；脂多糖LPS、肽聚糖PGN（Sigma Aldrich）；Mouse TNF-αELISA kit（達(dá)優(yōu)）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)（Thermo）；熒光顯微鏡（Olympus）；熒光定量PCR儀（ABI）；高端凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech）；高端多功能酶標(biāo)儀（TECAN）；參照NCBI中目的基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），引物由上海生工生物公司合成；TNF-α引物購自GeneCopoeia。

1.2 方法

1.2.1 HBLV-Cas9-PURO慢病毒包裝和滴度測定將pSPAX2、pMD2G和攜帶Cas9基因的穿梭質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)大量高純度無內(nèi)毒素抽提后，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，6 h后更換為完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h和72 h，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清，4℃、2 000 g離心10 min，去除細(xì)胞碎片，收集病毒上清，離心120 min，得到高滴度慢病毒超離液（HBLV-Cas9-PURO）。分裝病毒、標(biāo)記、-80℃保存。稀釋計(jì)數(shù)法測定病毒滴度（TU/ml）=細(xì)胞數(shù)×陽性克隆百分比×MOI×病毒稀釋倍數(shù)×103。

1.2.2 HBLV-Cas9-PURO感染、篩選及鑒定感染前1 d將RAW264.7細(xì)胞適當(dāng)鋪板，細(xì)胞密度生長至30%～50%時(shí)，將HBLV-Cas9-PURO以MOI=20進(jìn)行1/2小體積感染，4 h后補(bǔ)足至完全培養(yǎng)體積，24 h后更換新鮮完全培養(yǎng)液，48 h后熒光顯微鏡初步觀察GFP表達(dá)效率并更換含10μg/ml Puromycin的新鮮完全培養(yǎng)液進(jìn)行Puromycin抗性篩選，進(jìn)行穩(wěn)定株篩選及擴(kuò)增，提取細(xì)胞總RNA，PCR檢測Cas9基因表達(dá)，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。PCR反應(yīng)條件：94℃10 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)。

1.2.3 m-MyD88 gRNA重組載體構(gòu)建和慢病毒包裝根據(jù)小鼠MyD88在NCBI的基因序列，為實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9打靶載體用于小鼠MyD88基因敲除，設(shè)計(jì)3條sgRNA序列：m-MyD88 gRNA1、m-MyD88 gRNA2、m-MyD88 gRNA3（表2），由長春庫美公司合成后，退火成雙鏈Oligo序列，T4連接酶接入含ZsGreen熒光標(biāo)記的pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen線性化表達(dá)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，Amp抗性平板培養(yǎng)過夜，挑菌并擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液進(jìn)行測序。將測序驗(yàn)證正確的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取和慢病毒包裝，慢病毒（HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA2-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP和HBLV-GFP NC對(duì)照）包裝及滴度測定方法同1.2.1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 sgRNA寡核苷酸序列Tab.2 Sequences of sgRNA oligonucleotides

1.2.4 HBLV-m-MyD88 gRNA-GFP感染及基因敲除效果鑒定篩選成功的RAW264.7-Cas9細(xì)胞以5×105個(gè)/ml鋪于6孔板，待細(xì)胞密度生長至30%～50%融合時(shí)，將包裝的各組慢病毒以MOI=30進(jìn)行1/2小體積感染，感染后篩選過程及PCR鑒定方法同1.2.2。同時(shí)進(jìn)行Western blot鑒定，提取感染后的RAW264.7-Cas9細(xì)胞蛋白，BCA定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h，加入抗MyD88抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，PBST洗膜3次，5 min/次，加入二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次，滴加發(fā)光液，高端凝膠成像系統(tǒng)檢測MyD88表達(dá)。

1.2.5 MyD88基因敲除后TNF-α表達(dá)檢測為驗(yàn)證敲除MyD88基因的RAW264.7細(xì)胞功能，采用MyD88基因激活劑LPS和PGN誘導(dǎo)敲除MyD88基因的RAW264.7細(xì)胞8 h，收集上清，ELISA試劑盒檢測TNF-α分泌情況；提取細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR檢測TNF-α表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒滴度測定采用稀釋計(jì)數(shù)法對(duì)構(gòu)建的慢病毒HBLV-Cas9-PURO、HBLV-GFP NC對(duì)照、HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA2-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP進(jìn)行滴度測定，測定結(jié)果見表3。

2.2 RAW264.7-Cas9細(xì)胞株鑒定將HBLV-Cas9-PURO感染并篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，提取正常組和感染后的RAW264.7-Cas9細(xì)胞RNA，PCR檢測Cas9基因表達(dá)。與正常RAW264.7細(xì)胞比較，感染后Cas9基因擴(kuò)增產(chǎn)物表達(dá)升高（圖1），表明獲得穩(wěn)定表達(dá)Cas9基因的RAW264.7細(xì)胞（RAW264.7-Cas9）。

表3 慢病毒滴度測定結(jié)果Tab.3 Results of lentivirus titer determination

2.3 gRNA重組載體測序結(jié)果 將單鏈sMyD88-gRNAs退火成雙鏈Oligo序列，連接入單酶切線性化的載體pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen。轉(zhuǎn)化子由上海漢恒生物科技公司進(jìn)行測序（圖2），插入序列位置和方向與預(yù)期相符，證明3個(gè)載體構(gòu)建成功。

2.4 RAW264.7-Cas9細(xì)胞感染及敲除效果鑒定各組慢病毒分別感染RAW264.7-Cas9后，熒光顯微鏡下觀察gRNA重組載體導(dǎo)入情況，結(jié)果顯示目的基因?qū)氤晒Γ▓D3）。PCR檢測各組細(xì)胞MyD88基因表達(dá)，與對(duì)照組比較，HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后RAW264.7-Cas9細(xì)胞MyD88基因表達(dá)顯著下調(diào)（圖4A）。為進(jìn)一步驗(yàn)證敲除效果，采用Western blot檢測MyD88蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP和HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后細(xì)胞MyD88蛋白表達(dá)均下降，且HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP組下降最為顯著（圖4B）。說明MyD88基因敲除成功，gRNA3組敲除效果最佳。

圖1 Cas9基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR analysis of Cas9 gene

圖2 MyD88-gRNA測序圖Fig.2 Sequencing data of MyD88-gRNA

圖3 熒光顯微鏡下視野（×10）Fig.3 Field of vision under fluorescence microscope（×10）

圖4 MyD88基因敲除后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及蛋白表達(dá)Fig.4 Expressions of PCR products and protein after MyD88 gene knockout

圖5 MyD88基因敲除后TNF-αmRNA表達(dá)Fig.5 Expression of TNF-αmRNA after MyD88 knock down

圖6 MyD88基因敲除后細(xì)胞上清TNF-α分泌水平Fig.6 Secretion level of TNF-αafter MyD88 knock down

2.5 MyD88基因敲除后TNF-α水平檢測 采用MyD88基因激活劑LPS（50 ng/ml）和PGN（20μg/ml）誘導(dǎo)RAW264.7和gRNA3組細(xì)胞8 h后，熒光定量PCR和ELISA檢測TNF-α表達(dá)與分泌水平，結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)后正常RAW264.7細(xì)胞比較，敲除MyD88基因后TNF-α表達(dá)和分泌水平均下調(diào)（P＜0.05，圖5、6）。

3 討論

基因編輯技術(shù)是一種人為對(duì)目的基因片段進(jìn)行基因敲除、特異突變引入或定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因修飾的技術(shù)［6］。CRISPR/Cas9技術(shù)因高效、特異、操作簡易、周期短等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為目前基因編輯的主流，在生物學(xué)領(lǐng)域取得廣泛進(jìn)展，并于2020年被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)［7］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合于基因外顯子區(qū)，Cas9蛋白對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，通過非同源性末端連接導(dǎo)致隨機(jī)堿基插入/缺失，導(dǎo)致基因發(fā)生移碼突變，達(dá)到基因敲除目的［8］。本研究首先采用慢病毒感染方法獲得穩(wěn)定表達(dá)Cas9的RAW264.7細(xì)胞，構(gòu)建及合成MyD88基因的sgRNA，采用慢病毒感染方式將sgRNA導(dǎo)入穩(wěn)定表達(dá)Cas9的RAW264.7細(xì)胞，最終敲除RAW264.7細(xì)胞中的MyD88基因。

TLRs屬于膜型模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），是單個(gè)跨膜非催化性蛋白，主要表達(dá)于單核-巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等，由富含亮氨酸重復(fù)單位的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)Toll-白介素1受體（Toll-interleukin 1 receptor，TIR）結(jié)構(gòu)域組成，而TIR的功能是募集下游接頭分子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)［9］。MyD88蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的TLRs接頭分子，其結(jié)構(gòu)也為三部分：N端的死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）、中間區(qū)域及C端的Toll區(qū)［10］。NF-κB是MyD88下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通常以p65和p50異二聚體形式存在，細(xì)胞靜息狀態(tài)下由于抑制蛋白IKβ結(jié)合，致使NF-κB滯留于細(xì)胞質(zhì)，無法調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄［11］。當(dāng)TLRs與配體結(jié)合時(shí)，TIR與MyD88的C端Toll區(qū)形成復(fù)合體，引起DD結(jié)構(gòu)域活化，募集IRAK1、IRAK4和TRAF6，TRAF6活化并激活TAK-1，使IKK（IKβkinase）磷酸化。磷酸化的IKK可催化IKβ泛素化降解，解除其對(duì)NF-κB的抑制，NF-κB由胞質(zhì)進(jìn)入胞核作用于反應(yīng)原件，啟動(dòng)一系列特定基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6等［12］。ADACHI等［13］對(duì)MyD88基因敲除的小鼠腹腔注射高劑量LPS，小鼠可存活96 h以上。本研究構(gòu)建的穩(wěn)定敲除MyD88基因的RAW264.7細(xì)胞株經(jīng)LPS和PGN誘導(dǎo)后，TNF-α表達(dá)明顯受抑制，與既往研究結(jié)果一致。

最新研究表明，MyD88在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮作用，對(duì)自身免疫疾病、炎癥性疾病、感染性疾病和過敏性疾病等均有調(diào)控效應(yīng)，但機(jī)制尚需進(jìn)一步探究［14］。本研究采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，借助慢病毒感染方法，成功構(gòu)建RAW264.7細(xì)胞MyD88基因缺失株，可為深入探尋MyD88基因作用提供重要載體。