趨化因子CXCL12及其配體CXCR4、CXCR7對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響①

蔣雅玲 胡學(xué)麗 陳 輝 段 智 劉 景 范先成（長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院乳甲外科，長(zhǎng)沙 410005）

乳腺癌不僅是威脅女性健康最常見的惡性腫瘤，同樣也是女性癌癥死亡的最主要原因［1-2］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在過(guò)去的30年間，乳腺癌在我國(guó)的發(fā)病率以每年3%～5%的速度快速增長(zhǎng)，且日趨年輕化，據(jù)預(yù)測(cè)，截至2021年，我國(guó)30～49歲的女性乳腺癌患者將達(dá)到220萬(wàn)，相當(dāng)于每10萬(wàn)名女性中將新增100多例患者［3］。而在乳腺癌中，人類表皮生長(zhǎng)因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽(yáng)性乳腺癌亞型雖然僅占乳腺癌的15%～20%，但臨床數(shù)據(jù)表明，與HER2陰性乳腺癌相比，HER2陽(yáng)性乳腺癌患者具有更差的預(yù)后及更高的病死率，但造成這一現(xiàn)象的具體分子機(jī)制尚未完全闡明［4-5］。近年來(lái)大量研究顯示，趨化因子及其受體網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其中趨化因子CXCL12及其受體CXCR4與CXCR7受到研究者的廣泛關(guān)注［6］。國(guó)內(nèi)外大量研究報(bào)道，CXCL12、CXCR4和CXCR7在乳腺癌患者腫瘤組織中表達(dá)顯著增加，進(jìn)一步研究提示，較其他類型的乳腺癌亞型相比，CXCL12、CXCR4和CXCR7蛋白在HER2陽(yáng)性乳腺癌中的表達(dá)異常增加，這可能與該類型乳腺癌較差的預(yù)后相關(guān)［7-8］。然而，關(guān)于趨化因子CXCL12及其受體CXCR4和CXCR7對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等生物學(xué)行為尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道，因此，為進(jìn)一步闡明CXCL12、CXCR4和CXCR7在HER2陽(yáng)性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞BT474，并采用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)單個(gè)及聯(lián)合沉默CXCR4與CXCR7，探究CXCL12-CXCR4/CXCR7網(wǎng)絡(luò)對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控，以期為治療HER2陽(yáng)性乳腺癌提供有效的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料人HRE2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系BT474購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640、含EDTA的0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、Opti-MEM（美國(guó)Gibco公司）；胰島素、CXCL12（美國(guó)Sigma公司）；CCK-8試劑（日本東仁科技公司）；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司）；SYBR Green Real-time PCR（上海索萊寶生物公司）；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine3000（美國(guó)Invitrogen公司）；沉默CXCR4、CXCR7的siRNA（即si-CXCR4、si-CXCR7，廣州銳博生物科技公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；PI/RNase試劑、基質(zhì)膠（美國(guó)BD Biosciences公司）；Transwell小室（8μm，美國(guó)Corning公司）；RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF（南京凱基生物）；兔抗CXCR4、CXCR7（美國(guó)Santa Cruz公司）；兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-actin（美國(guó)Cell Signaling Technologies公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（上海碧云天生物公司）；PRPCR引物由上海生工構(gòu)建；Bio Tek ELx800酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）；BD FACS流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)BT474細(xì)胞培養(yǎng)于含15%0.1 U/ml胰島素的RPMI1640培養(yǎng)液中，并置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.1.2 siRNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前常規(guī)消化細(xì)胞，調(diào)整密度至5×104個(gè)/ml，培養(yǎng)過(guò)夜后，更換培養(yǎng)液為Opti-MEM，并按Lipofectamine3000說(shuō)明書轉(zhuǎn)染，將si-CXCR4、si-CXCR7分別及聯(lián)合轉(zhuǎn)染至BT474細(xì)胞，并 記 為si-CXCR4、si-CXCR7和si-CXCR4+7細(xì) 胞。轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為原培養(yǎng)液，置于上述條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取轉(zhuǎn)染12 h后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.3 細(xì)胞分組按實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒓?xì)胞分為5組，A組：正常培養(yǎng) 的BT474細(xì) 胞；B組：100 ng/ml CXCL12處理的BT474細(xì)胞；C組：100 ng/ml CXCL12處理的轉(zhuǎn)染si-CXCR4細(xì)胞；D組：100 ng/ml CXCL12處理的轉(zhuǎn)染si-CXCR7細(xì)胞；E組：100 ng/ml CXCL12處理的聯(lián)合轉(zhuǎn)染si-CXCR4與si-CXCR7細(xì)胞。上述各組細(xì)胞共同置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如無(wú)特殊說(shuō)明，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞的增殖活力取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BT474細(xì)胞，消化細(xì)胞后接種至96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后，按1.2.1方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染及處理，置于上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別于12 h、24 h、36 h、48 h時(shí)向每孔細(xì)胞中加入10μl的CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)每孔吸光度值（A450）。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞的周期分布常規(guī)消化上述5組乳腺癌細(xì)胞，并于4℃、70%乙醇中固定過(guò)夜，收集細(xì)胞，調(diào)整密度至3×105個(gè)/ml，并加入0.5 ml的PI/RNase充分混勻，4℃避光孵育30 min。最后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞的遷移能力將5組乳腺癌細(xì)胞按5×104個(gè)/孔接種至底部劃有間隔為5 mm平行線的24孔板中，置于上述條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，垂直于底部的兩條平行線去除線條內(nèi)部細(xì)胞，PBS充分沖洗，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后顯微鏡下拍照觀察，并計(jì)算分析。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力在Transwell小室底部包被BD基質(zhì)膠，室溫靜置30 min后，將無(wú)血清培養(yǎng)基的5組乳腺癌細(xì)胞按3×105個(gè)/ml接種于小室中。配制Transwell下室溶液，A組下室為含15%FBS的正常培養(yǎng)基，B～E組為含100 ng/ml CXCL12與15%FBS的正常培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，取出小室，濕棉簽擦拭小室上層未穿出細(xì)胞，無(wú)水乙醇固定后，0.1%的結(jié)晶紫染色，PBS沖洗后，倒置顯微鏡觀察穿出細(xì)胞數(shù)，每組隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞中CXCR4和CXCR7的mRNA表達(dá) 水平TRIzol法 提取轉(zhuǎn)染si-CXCR4、si-CXCR7和si-CXCR4+7乳腺癌細(xì)胞中的總RNA，測(cè)定RNA純度與濃度后，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行合成cDNA。RT-PCR根據(jù)SYBR Green Real-time PCR試劑說(shuō)明書確定的反應(yīng)時(shí)間與溫度進(jìn)行。CXCR4-F：5′-CTGACTATTCCCGACTTCATCTTTG-3′，CXCR4-R：5′-CAATGTAGTAAGGCAGCCAACAG-3′；CXCR7-F：5′-CATGCAACAGCAGCGACTGCATCG-3′；CXCR7-R：5′-CAGCGATAATGGAGAAGGGAACG-3′。β-actin-F：5′-ATCACCATTGGAATGAGCGCAG-3′；β-actin-R：5′-TTGAAGGTAGTTCGTGGATCAG-3′；以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞中CXCR4、CXCR7和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平取待測(cè)細(xì)胞，應(yīng)用RIPA裂解液及PMSF于冰上提取細(xì)胞總蛋白，BSA定量后，取適量蛋白樣品加入1/4體積的SDSPAGE上樣緩沖液中加熱變性。取約40μg變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離，隨后電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉后，加入抗CXCR4（1∶500）、CXCR7（1∶800）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）抗體，并置于4℃條件下孵育過(guò)夜。隨后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀曝光拍照。Image J軟件測(cè)定條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）的LSD-t進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中CXCR4和CXCR7的mRNA與蛋白表達(dá)RT-PCR與Western blot結(jié)果顯示，與BT474細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染si-CXCR4的細(xì)胞中CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01），轉(zhuǎn)染si-CXCR7的細(xì)胞中CXCR7 mRNA與蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01），而聯(lián)合轉(zhuǎn)染si-CXCR4+7的細(xì)胞中CXCR4和CXCR7的mRNA和蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01），見圖1。

2.2 沉默CXCR4和（或）CXCR7對(duì)CXCL12誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與A組乳腺癌細(xì)胞相比，B組、C組和D組細(xì)胞的增殖活力均顯著增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），其中以B組的增強(qiáng)趨勢(shì)最為明顯（P＜0.01），而E組細(xì)胞增殖活力明顯減弱（P＜0.05）；與B組細(xì)胞相比，C組、D組及E組細(xì)胞的增殖活力均明顯減弱（P＜0.05或P＜0.01），其中以E組細(xì)胞的減弱趨勢(shì)最為顯著（P＜0.01）；與C組或D組相比，E組細(xì)胞增殖活力明顯減弱（P＜0.05），前兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA后各組細(xì)胞中CXCR4和CXCR7的mRNA與蛋白表達(dá)Fig.1 mRNA and protein expressions of CXCR4 and CXCR7 in cells transfected with siRNA in each group

2.3 沉默CXCR4和（或）CXCR7對(duì)CXCL12誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)展的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組乳腺癌細(xì)胞相比，B組、C組和D組細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞比例均明顯降低（P＜0.05），S+G2期的細(xì)胞比例均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），其中以B組細(xì)胞S+G2期的細(xì)胞比例升高趨勢(shì)最為明顯（P＜0.01），而E組處于G1期的細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05），S+G2期細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05）；與B組相比，C組與D組S+G2期的細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05），處于G1期的細(xì)胞比例無(wú)明顯變化（P＞0.05），而E組處于G1期的細(xì)胞比例均明顯升高（P＜0.05），S+G2期的細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.01）；與C組或D組相比，E組G1期的細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05），S+G2期的細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.01），前兩組的細(xì)胞周期分布無(wú)明顯變化（P＞0.05），見圖3。

2.4 沉默CXCR4和（或）CXCR7對(duì)CXCL12誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與A組乳腺癌細(xì)胞相比，B組、C組和D組細(xì)胞的遷移能力均明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），其中以B組細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)最為明顯（P＜0.01），而E組細(xì)胞遷移能力明顯降低（P＜0.05）；與B組細(xì)胞相比，C組、D組、E組細(xì)胞的遷移能力均明顯減弱（P＜0.05或P＜0.01），且以E組細(xì)胞的減弱趨勢(shì)最為明顯（P＜0.01）；與C組或D組相比，E組細(xì)胞的遷移能明顯減弱（P＜0.05），而前兩組間細(xì)胞遷移能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

2.5 沉默CXCR4和（或）CXCR7對(duì)CXCL12誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與A組乳腺癌細(xì)胞相比，B組、C組和D組細(xì)胞的侵襲能力均顯著增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），其中以B組細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)最為顯著（P＜0.01），而E組細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱（P＜0.05）；與B組細(xì)胞相比，C組、D組、E組細(xì)胞的遷移能力均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），且以E組細(xì)胞降低最為顯著（P＜0.01）；與C組或D組相比，E組細(xì)胞的侵襲能明顯減弱（P＜0.05），而前兩組間細(xì)胞侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖2 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用Fig.2 Silencing CXCR4 and/or CXCR7 inhibited proliferation promoting effect of CXCL12 on breast cancer cells

圖3 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)展的促進(jìn)作用Fig.3 Silencing of CXCR4 and/or CXCR7 inhibited promotion of CXCL12 on breast cancer cell cycle progression

圖4 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用Fig.4 Silencing of CXCR4 and/or CXCR7 inhibited migration promoting effect of CXCL12 on breast cancer cells

2.6 沉默CXCR4和（或）CXCR7對(duì)CXCL12誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT能力的影響Western blot結(jié)果顯示，與A組乳腺癌細(xì)胞相比，B組、C組和D組細(xì)胞中E-cadherin表 達(dá) 水 平 均 顯 著 降 低（P＜0.01或P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），而E組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水均無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與B組細(xì)胞相比，C組和E組中E-cadherin表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），且以E組上述蛋白的變化趨勢(shì)最為明顯（P＜0.01），但D組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平均無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與C組相比，E-cadherin表達(dá)水平在D組中明顯減少（P＜0.05），而在E組中明顯增加（P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平在D組中明顯增加（P＜0.05），而在E組中明顯減少（P＜0.05），見圖6。

圖5 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用Fig.5 Silencing CXCR4 and/or CXCR7 inhibited invasion ability promotion effect of CXCL12 on of breast cancer cells

圖6 沉默CXCR4和（或）CXCR7對(duì)CXCL12誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT能力的影響Fig.6 Effect of silencing CXCR4 and/or CXCR7 on EMT ability of CXCL12-induced breast cancer cells

3 討論

目前，臨床針對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌的主要治療手段為手術(shù)、放療、化療等，其中針對(duì)分子表型進(jìn)行的靶向化療已成為臨床治療的一種重要方式。迄今為止，以抗HER2單克隆抗體曲妥珠單抗為首的靶向化療藥物方案是HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的重要治療策略，然而，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)曲妥珠單抗治療治療一段時(shí)間后，約50%的患者會(huì)產(chǎn)生藥物不敏感，即耐藥現(xiàn)象［9-10］。因此，亟待尋求新的潛在靶點(diǎn)以提供更為有效的治療方法。

趨化因子屬于小分子蛋白類的細(xì)胞因子超家族，能夠與G蛋白偶聯(lián)受體相互作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞骨架的重排、黏附及定向遷移等行為。研究顯示，趨化因子CXCL12高表達(dá)于淋巴結(jié)、肝臟、肺等多種組織與器官中，且能夠趨化表達(dá)其受體的乳腺癌細(xì)胞優(yōu)先轉(zhuǎn)移至上述器官［11-12］。此外，CXCL12在乳腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后均有關(guān)［13］。CXCR4是最早發(fā)現(xiàn)的CXCL12受體，其為G蛋白偶聯(lián)受體，能夠通過(guò)不同的G蛋白亞基激活多條下游信號(hào)通路，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、EMT等生物學(xué)功能［14］。研究表明，CXCR4在乳腺癌組織中持續(xù)表達(dá)，且CXCL12對(duì)表達(dá)CXCR4陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的趨化作用，能夠誘導(dǎo)腫瘤的特異性遷移，故CXCR4與原發(fā)性乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12，15］。CXCR7是CXCL12新發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)受體，研究顯示，CXCR7主要表達(dá)于原發(fā)腫瘤組織的血管系統(tǒng)，推測(cè)其可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)纖維蛋白和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移［16］。同時(shí)，數(shù)據(jù)表明高表達(dá)CXCR7能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的黏附、侵襲和血管生成能力，在體內(nèi)可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［17］。

本研究結(jié)果顯示，通過(guò)siRNA感染技術(shù)單獨(dú)沉默HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞BT474中的CXCR4與CXCR7均可顯著抑制CXCL12對(duì)乳腺癌增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移及侵襲能力的促進(jìn)作用，說(shuō)明CXCR4與CXCR7在腫瘤的增殖、遷移及侵襲能力上發(fā)揮對(duì)等的促進(jìn)作用，而聯(lián)合沉默CXCR4、CXCR7表達(dá)能最大程度地抑制CXCL12對(duì)腫瘤細(xì)胞上述惡性行為的促進(jìn)。這與CXCR12-CXCR4/CXCR7網(wǎng)絡(luò)對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等行為的調(diào)控具有一致性［18］。但在EMT的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)或聯(lián)合沉默CXCR4后，CXCL12對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)能力被極大削弱，而單獨(dú)沉默CXCR7對(duì)CXCL12 EMT誘導(dǎo)能力的減弱作用沒有沉默CXCR4明顯，提示在BT474細(xì)胞中，CXCL12可能主要通過(guò)與受體CXCR4相互作用促進(jìn)乳腺癌的EMT行為。結(jié)合研究CXCL12-CXCR4/CXCR7網(wǎng)絡(luò)對(duì)其他腫瘤細(xì)胞EMT調(diào)控的相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，CXCR4與CXCR7對(duì)CXCL12的這一作用的相應(yīng)功能并非完全一致，其中CXCR7介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT的過(guò)程可能具有嚴(yán)格的環(huán)境特異性與細(xì)胞類型特異性。如在卵巢癌中，CXCL12誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象能夠被CXCR4抑制劑所拮抗，而不能被CXCR7抗體抑制［19］。同樣在胰腺癌中，CXCL12主要與CXCR4結(jié)合，通過(guò)非經(jīng)典Hedgehog途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT［20］；但在肺癌中主要為CXCR7參與TGF-β誘導(dǎo)的EMT行為［21］。上述結(jié)果表明，CXCL12-CXCR4/7對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移和EMT行為的調(diào)控具有一定的差異性。

綜上，研究發(fā)現(xiàn)沉默CXCR4或CXCR7表達(dá)均可抑制CXCL12對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞周期進(jìn)展的促進(jìn)功能，但CXCL12主要通過(guò)與CXCR4相互作用來(lái)促進(jìn)乳腺癌的EMT行為，而同時(shí)抑制CXCR4或CXCR7能更有效地抑制CXCL12的上述功能。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了CXCL12及其受體CXCR4與CXCR7在HER2乳腺癌中的具體作用，為HER2乳腺癌的治療提供了潛在作用靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。