基于Nrf2/HO-1信號通路探討lncRNA H19對支原體感染肺炎小鼠肺組織的影響

張 曉 李偉華（山東第一醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院急診科，濟南 250031）

肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）是由肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）引起的呼吸道感染性肺炎，通常表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，其發(fā)病機制復(fù)雜，與感染引起的上皮細胞凋亡和機體的過度免疫應(yīng)答有關(guān)，主要包括免疫細胞激活和細胞炎癥因子分泌［1-2］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類核苷酸長度大于200 nt、無編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，可參與細胞增殖、分化和凋亡等過程，還能夠調(diào)節(jié)信號通路參與炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展［3］。研究表明lncRNA H19與人類多種肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如ZHONG等［4］發(fā)現(xiàn)敲除lncRNA H19后，肺癌細胞增殖減少，細胞周期停滯在G1期，細胞凋亡水平提高，遷移和侵襲減少。LIU等［5］表明過表達lncRNA H19可誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞A549發(fā)生上皮-間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并促進細胞增殖及侵襲。WAN等［6］發(fā)現(xiàn)H19 mRNA在特發(fā)性肺纖維化患者及博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織中上調(diào)，lncRNA H19缺乏可改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺部炎癥和纖維化。感染性肺炎患者體內(nèi)免疫功能損傷，炎癥反應(yīng)激烈。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）能夠調(diào)節(jié)多種抗炎和抗氧化基因的表達，在機體損傷應(yīng)答中居核心地位，而血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是Nrf2發(fā)揮作用的重要媒介。Nrf2/HO-1信號通路參與多種組織器官的炎癥相關(guān)病理過程。如SHEN等［7］發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞外泌體可以通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1的表達將巨噬細胞極化為抗炎表型，并改善膿毒癥中的炎癥反應(yīng)和損傷。KHADRAWY等［8］發(fā)現(xiàn)在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，骨髓間充質(zhì)干細胞通過激活Nrf2/HO-1信號抑制氧化應(yīng)激、炎癥和肝纖維化。ARKALI等［9］發(fā)現(xiàn)香芹酚對雄性大鼠糖尿病誘導(dǎo)的生殖損傷具有保護作用，通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路抑制NF-κB介導(dǎo)的睪丸細胞凋亡和炎癥。而Nrf2/HO-1信號通路在支原體感染的肺炎中鮮有報道。

因此，本研究通過構(gòu)建支原體感染肺炎小鼠模型及肺泡上皮細胞A549模型，探究lncRNA H19通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路對小鼠肺組織的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級4周齡BALB/c小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購自豪威生物科技有限公司［SYXK（津）2019-0006］。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23～25℃、標準濕度55%～60%、12 h/12 h晝夜交替、飲水飲食正常、分籠飼養(yǎng)，并于1周后實驗。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準（20190523）。

1.1.2 主要試劑和儀器肺炎支原體國際標準菌株ATCC FH15531購自美國菌種保藏中心；肺泡上皮細胞A549購自上海生工生物公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京博爾西科技有限公司；CyclinD1、Nrf2、HO-1抗體購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Thermo酶標儀購自上海熱電儀器有限公司；冷凍離心機購自美國Beckman公司；組織包埋機購自德國Leica公司；蛋白電泳、儀轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂公司；電子顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作與分組利用10倍稀釋法將待測菌液用培養(yǎng)基稀釋成1×10-12～1×10-1CCU/ml一系列濃度，于37℃恒溫培養(yǎng)，以培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色時的最高稀釋度為待測菌液的CCU，菌液濃度以1×107CCU/ml。

將60只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為4組：對照組（control組）、模型組（MP組）、轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照組（si-NC組）和轉(zhuǎn)染lncRNA H19 siRNA組（si-H19組）。各組小鼠均腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉，si-NC組鼻腔滴入陰性對照siRNA，si-H19組滴入lncRNA H19 siRNA，對照組和模型組滴入等量生理鹽水。24 h后，除對照組外，其余組用1 ml注射器緩慢向鼻腔中滴入0.1 ml 1×107CCU/ml的MP菌液，對照組滴入等量培養(yǎng)基，1次/d，連續(xù)滴鼻3 d造模。造模結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，打開胸腔，剝離肺組織樣本，觀察病變程度；部分置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色和免疫組化；部分置于-80℃凍存，用于ELISA、qRTPCR和Western blot檢測。

1.2.2 細胞模型制作與分組A549細胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將A549細胞分為對照組（control組）、模型組（MP組）、轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照組（si-NC組）、轉(zhuǎn)染lncRNA H19 siRNA組（si-H19組）、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒組（pcDNA-NC組）和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-lncRNA H19質(zhì)粒組（pcDNA-H19組）。各組分別轉(zhuǎn)染對應(yīng)的RNA及質(zhì)粒。24 h后，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。除對照組外，其余組使用1×107CCU/ml的MP菌液感染A549細胞，4 h后，洗去未黏附的MP，并用RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 HE染色觀察小鼠肺組織病理學改變?nèi)〕?%多聚甲醛固定的肺組織，將樣品包埋石蠟制成3μm厚的切片，后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木精-伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性膠封固等，最后于顯微鏡（×200）下觀察肺組織結(jié)構(gòu)。

1.2.4 qRT-PCR檢測肺組織和細胞中l(wèi)ncRNA H19 mRNA的表達采用Trizol試劑從肺組織和細胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用SYBR Green法進行擴增，GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃45 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt公式計算lncRNA H19的相對表達水平。lncRNA H19正向引物序列：5"-TGAAGGAACAGACGGTGACAACATC-3"，反向引物序列：5"-TAGAGGCTTGGCTCCAGGATGATG-3"。GAPDH正向引物序列：5"-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3"，反向引物序列：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。

1.2.5 ELISA檢測肺組織和細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量取出小鼠凍存的肺組織和A549細胞，低溫超聲勻漿裂解，收集組織和細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明，稀釋標準品，繪制標準曲線，檢測小鼠組織和細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.2.6 免疫組化染色觀察小鼠肺組織Bcl-2、Bax、MMP-9的表達將切片于60℃烤箱熔蠟，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，進行高壓抗原修復(fù)，3%H2O2室溫浸泡，PBS洗滌3次，分別滴加兔抗大鼠一抗Bcl-2、Bax、MMP-9（1∶100）4℃孵育過夜，PBS洗滌，次日滴加山羊抗兔二抗孵育20 min，快速滴加DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水、透明、封片，顯微鏡（×200）下觀察，使用ImageProPlus 6.0軟件分析陽性染色區(qū)域的平均光密度值（equally optical density，EOD）。

1.2.7 細胞單克隆形成及MTT法檢測細胞增殖能力單克隆形成實驗：調(diào)整細胞密度為1×103個/孔接種于6孔板培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)10 d后，用4%多聚甲醛溶液固定，用結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡（×40）觀察菌落形成情況并拍照。MTT實驗：調(diào)整細胞密度為1×103個/孔并接種于96孔板培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，加入MTT溶液，37℃孵育4 h，離心去上清，加入DMSO，使用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度值。

1.2.8 Annexin V-FITC/PI染色檢測各組細胞凋亡能力調(diào)整細胞密度為1×103個/孔并接種于6孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，細胞培養(yǎng)48 h后進行胰酶消化，離心后收集細胞，加入500μl Binding Buffer懸浮細胞，再各加入5μl Annexin V-FITC及PI混勻，室溫避光孵育15 min后用流式細胞儀檢測。

1.2.9 Western blot檢測肺組織和細胞中Nrf2、HO-1、CyclinD1蛋白表達取凍存的肺組織和A549細胞，低溫超聲勻漿裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等質(zhì)量蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Nrf2、HO-1、CyclinD1一抗（1∶2 000）4℃過夜，TBST漂 洗3次，加入 二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，用ECL發(fā)光劑顯影，Quantity One軟件進行各組蛋白灰度分析，GAPDH為內(nèi)參校正。

1.3 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)分析應(yīng)用軟件SPSS16.0，作圖軟件采用GraphPad Prism 5.0，計量資料以±s表示，采用獨立t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA H19對支原體感染肺炎小鼠肺組織的影響HE染色觀察小鼠肺組織形態(tài)，結(jié)果顯示：對照組雙肺呈粉紅色，肺泡壁光滑有彈性，無充血，鏡下肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔大小一致，肺泡壁薄，無間隔水腫及炎癥細胞浸潤；MP組、si-NC組雙肺塌陷，表面粗糙，呈灰白色，均勻分布點狀淤血斑點，鏡下肺泡大量塌陷，肺泡間隔增厚，出現(xiàn)不同程度增生，甚至融合為大肺泡，肺泡內(nèi)有充血及炎癥細胞浸潤；si-H19組情況較MP組肺部形態(tài)有所改善，雙肺較紅潤，存在肺泡結(jié)構(gòu)，但局部可見少量肺塌陷及肺泡間隔增厚，少量肺泡融合，見圖1A。說明敲減lncRNA H19會改善肺部病理形態(tài)。qRT-PCR檢測lncRNA H19 mRNA在肺組織中的表達，結(jié)果顯示，與對照組相比，MP組、si-NC組lncRNA H19 mRNA水平升高（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-H19組lncRNA H19 mRNA水平降低（P＜0.05），見圖1B。說明lncRNA H19在肺炎組織中表達升高。ELISA檢測肺組織炎癥因子的表達，結(jié)果顯示：與對照組相比，MP組、si-NC組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-H19組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05），見圖1C。說明敲降lncRNA H19能夠降低小鼠肺組織炎癥因子水平。免疫組化和Western blot檢測了增殖、凋亡及Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示：與對照組相比，MP組、si-NC組CyclinD1、Bcl-2蛋白水 平 降低，Bax、MMP-9、Nrf2、HO-1蛋 白水 平升 高（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-H19組CyclinD1、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白水平升高，Bax、MMP-9蛋白水平降低（P＜0.05），見圖1D、E。說明敲降lncRNA H19可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路促進細胞增殖并抑制其凋亡。綜上，敲降lncRNA H19水平對支原體感染肺炎小鼠肺組織具有保護作用。

圖1 lncRNA H19對支原體感染肺炎小鼠肺組織的影響Fig.1 Effect of lncRNA H19 on lung tissue of mice with mycoplasma infection with pneumonia

2.2 lncRNA H19對支原體感染A549細胞的影響qRT-PCR檢測lncRNA H19 mRNA在A549細胞中的表達，結(jié)果顯示：與對照組相比，MP組lncRNA H19 mRNA水平升高（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-H19組lncRNA H19 mRNA水平降低（P＜0.05）；與pcDNA-NC組 相 比，pcDNA-H19組lncRNA H19 mRNA水平升高（P＜0.05），見圖2A。說明支原體感染后lncRNA H19表達升高。ELISA檢測A549細胞炎癥因子的表達，結(jié)果顯示：與對照組相比，MP組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-H19組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05）；與pcDNA-NC組相比，pcDNA-H19組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05），見圖2B。說明敲降lncRNA H19水平能夠降低A549細胞炎癥因子水平，而過表達lncRNA H19提高炎癥因子水平。單克隆形成、MTT法、Annexin V-FITC/PI染色及Western blot對細胞的增殖、凋亡情況和Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白的表達進行了檢測，結(jié)果顯示：與對照組相比，MP組單克隆數(shù)減少，24 h、48 h、72 h、96 h OD值降低，細胞凋亡率升高，CyclinD1水平降低，Nrf2、HO-1水平升高（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-H19組單克隆數(shù)增多，24 h、48 h、72 h、96 h OD值升高，細胞凋亡率降低，Nrf2、HO-1、CyclinD1水平升高（P＜0.05）；與pcDNA-NC組相比，pcDNA-H19組單克隆數(shù)減少，24 h、48 h、72 h、96 h OD值降低，細胞凋亡率升高，CyclinD1、Nrf2、HO-1水平降低（P＜0.05），見圖2C～F。說明敲降lncRNA H19可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路促進細胞增殖并抑制其凋亡。綜上，敲降lncRNA H19水平對A549細胞具有保護作用，而過表達lncRNA H19損傷A549細胞。與支原體感染肺組織結(jié)果一致。

圖2 lncRNA H19對支原體感染A549細胞的影響Fig.2 Effect of lncRNA H19 on mycoplasma infection of A549 cells

圖3 lncRNA H19基于Nrf2/HO-1信號通路調(diào)控支原體感染肺炎的作用機制Fig.3 Mechanism of lncRNA H19 in regulating mycoplasma infection pneumonia based on Nrf2/HO-1 signaling pathway

2.3 lncRNA H19調(diào)控支原體感染肺炎的作用機制構(gòu)建支原體感染肺炎小鼠模型及A549細胞模型，發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在支原體感染的肺組織和細胞中表達上調(diào)。敲減lncRNA H19后，促進了細胞增殖，并抑制了細胞凋亡及炎癥水平，同時Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達增加；而過表達lncRNA H19能挽救上述影響。由此推斷敲減lncRNA H19能夠減輕小鼠肺部炎癥反應(yīng)，促進細胞增殖并抑制其凋亡，其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)（圖3）。

3 討論

肺炎支原體感染引起的MPP占社區(qū)獲得性肺炎的40%，容易在兒童中暴發(fā)流行，能夠造成患者肺部嚴重損傷，甚至威脅生命［10］。lncRNA H19位于人11號染色體和小鼠7號染色體上，是肺損傷和炎癥的重要調(diào)節(jié)因子。如劉江華等［11］發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織中高表達。趙炎等［12］發(fā)現(xiàn)敲減lncRNA H19能夠提高肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細胞活性，抑制炎癥因子的表達，抑制細胞凋亡。ZHANG等［13］發(fā)現(xiàn)支氣管肺發(fā)育不良小鼠模型H19上調(diào)，肺部出現(xiàn)充血及炎癥細胞浸潤，下調(diào)lncRNA H19通過下調(diào)STAT3引起的炎癥反應(yīng)，從而減輕肺損傷。本研究肺炎支原體感染的肺炎小鼠模型和A549細胞模型中，lncRNA H19也呈現(xiàn)高表達，且肺部病理學顯示，肺炎模型組雙肺塌陷呈灰白色，肺泡間隔增厚，內(nèi)有充血及炎癥細胞浸潤；而敲減lncRNA H19后，肺部形態(tài)及結(jié)構(gòu)明顯改善，局部僅見少量肺塌陷及肺泡間隔增厚。說明lncRNA H19可能參與了支原體感染肺炎的發(fā)生、發(fā)展。

MP感染導(dǎo)致機體免疫紊亂，產(chǎn)生炎癥浸潤，釋放TNF-α、IL-6和IL-1等細胞炎癥因子。TNF-α是早期細胞炎癥因子，介導(dǎo)中性粒細胞的釋放，誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)。IL-6是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，參與整個炎癥反應(yīng)，在機體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。MMP-9是金屬蛋白酶類家族成員，由巨噬細胞、中性粒細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞等分泌，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。動物實驗表明，Nrf2/HO-1級聯(lián)反應(yīng)對肺組織中的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡均具有顯著的抑制作用［14］。如張潔等［15］發(fā)現(xiàn)，MP感染后血清TNF-α和IL-6水平與感染程度呈正相關(guān)，其水平可準確反映患者病情。李娜等［16］研究結(jié)果表明，祛濕通絡(luò)方通過下調(diào)MP感染的RAW264.7細胞的TNF-α、IL-6的高表達，減輕炎癥反應(yīng)。曹波等［17］發(fā)現(xiàn)VD3通過下調(diào)NF-κB及MMP-9表達，降低肺炎支原體感染小鼠肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)。AMATA等［18］研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒肺損傷反應(yīng)中被激活，從而誘導(dǎo)一系列抗炎信號的表達。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，MP組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，肺組織和A549細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、MMP-9、Nrf2和HO-1水平升高；敲減lncRNA H19后各炎癥因子水平降低，Nrf2和HO-1水平升高；過表達lncRNA H19后各炎癥因子水平升高，Nrf2和HO-1水平降低。說明MP感染激活機體免疫應(yīng)答，促發(fā)炎癥反應(yīng)，而敲減lncRNA H19通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制炎癥產(chǎn)生。

MP感染細胞后，可直接誘導(dǎo)細胞凋亡。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2家族成員，二者協(xié)同調(diào)控機體細胞凋亡。CyclinD1是促增殖基因，參與細胞周期的調(diào)控，能夠促進細胞周期發(fā)展，增強細胞活力。李向峰等［19］研究結(jié)果表明，魚腥草總黃酮通過升高肺炎支原體感染小鼠肺組織Bcl-2蛋白和mRNA水平，降低Bax蛋白和mRNA水平，抑制細胞凋亡。楊志敏等［20］發(fā)現(xiàn)芩百清肺濃縮丸能促進肺炎支原體感染的A549細胞增殖并抑制細胞凋亡。吳振起等［21］發(fā)現(xiàn)清燥救肺湯以Bax、Bcl-2為效應(yīng)靶點，抑制Caspase-3的表達，使細胞可以免于凋亡。孫小單等［22］表明阿帕替尼通過下調(diào)NRF2/HO-1通路，抑制卵巢癌CAOV-3細胞內(nèi)Bcl-2水平，提高Bax水平，發(fā)揮抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究中與對照組相比，MP組小鼠肺組織Bcl-2、CyclinD1表達降低，Bax表達升高；敲減lncRNA H19后Bcl-2、CyclinD1表達升高，Bax表達降低；過表達lncRNA H19后Bcl-2、CyclinD1表達降低，Bax表達升高。同時支原體感染A549細胞體外實驗也表明敲減lncRNA H19能促進MP感染細胞的增殖，抑制細胞凋亡。

綜上所述，lncRNA H19在支原體感染肺炎小鼠肺組織中表達上調(diào)，敲降lncRNA H19能夠減輕小鼠肺部炎癥反應(yīng)，促進細胞增殖并抑制其凋亡，其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。