N9亞型禽流感病毒NA蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定

衡武昌，崔鵬飛，張?jiān)?，?鑫，谷文麗，顏 成，孔興天，王叢叢，彭大新，鄧國(guó)華*，陳化蘭

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是一種單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA 病毒，血清型眾多，根據(jù)其表面糖蛋白血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）的差異，可以分為16 種HA亞型（H1～H16）和9 種NA 亞型（N1～N9）[1]。NA 蛋白在結(jié)構(gòu)上形成一個(gè)同源四聚體，具有神經(jīng)氨酸酶活性，能夠切割宿主細(xì)胞表面以及新生病毒粒子表面的唾液酸，進(jìn)而促進(jìn)新生病毒粒子的釋放和擴(kuò)散[2-3]。有研究表明NA 蛋白可以有效激發(fā)宿主針對(duì)感染的AIV 的中和抗體，并有效抵抗NA 亞型AIV的感染[4-5]。

國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，近年來我國(guó)分離的N9 亞型AIV 以H7N9 亞型為主，同時(shí)還有 少 量 的H1N9、H9N9 和H11N9 亞 型。自2013 年H7N9 亞型AIV 首次在我國(guó)出現(xiàn)以來，其不僅嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)，而且對(duì)人類生命健康也構(gòu)成嚴(yán)重威脅，截至2020 年全球共有1 568 人感染H7N9 亞型AIV，其中615 人死亡[6]。H5/H7 AIV 滅活疫苗的廣泛推廣和使用，有效控制了H7N9 AIV 在家禽中的流行，顯著降低了H7N9 亞型AIV 感染人類的幾率[7]。但H7N9 亞型AIV 并未在家禽中徹底根除，2019 年初，我國(guó)內(nèi)蒙古等地監(jiān)測(cè)到少量H7N9 亞型AIV 發(fā)生了抗原漂移，與同期使用的H7N9 Re2 疫苗存在16 倍以上的抗原性差異，并且變異株對(duì)雞呈高致病性[8]。因此，對(duì)N9 亞型AIV 的系統(tǒng)持續(xù)監(jiān)測(cè)仍非常必要。目前N9 亞型AIV 的檢測(cè)方法主要有血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)。本研究利用桿狀病毒—昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具有反應(yīng)原性的AIV N9 蛋白，為其N9 抗體檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料重組質(zhì)粒pCAGGS-N9（N9 基因來自DK/HuN/S11670/2015（H11N9））、sf21 細(xì)胞、pFastBacHT A 和鼠源N9 蛋白單克隆抗體（MAb）由本實(shí)驗(yàn)室保存；DH5α 和DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin、Grace 昆蟲培養(yǎng)基和Sf-900 II SFM 無血清培養(yǎng)基均購(gòu)自Invitrogen 公司；BamH I 和KpnI 購(gòu)自NEB 公 司；PrimeSTAR Max 高 保 真DNA 聚 合 酶 購(gòu) 自TaKaRa 公司；rTaqDNA 聚合酶購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；病毒DNA 提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；桿狀病毒穿梭載體bacmid 小量抽提試劑盒、細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；DyLight 488 標(biāo)記羊抗鼠IgG 購(gòu)自Abbkine 公司；DyLight 800標(biāo)記羊抗鼠IgG 購(gòu)自KPL 公司；HRP 標(biāo)記的兔抗雞IgY（IgY-HRP）購(gòu)自Sigma 公司；TMB 顯色液購(gòu)自ABM 公司。

1.2 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與鑒定根據(jù)pFastBac HT A 質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)和重組質(zhì)粒pCAGGS-N9 已測(cè)序的N9 基因序列，利用Snapgene 軟件設(shè)計(jì)N9 基因帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物，上下游引物分別引入BamH I 和KpnI 酶切位點(diǎn)，引物序列如下：N9-F：5'-CGCGGATCCGATGAATCCAAATCAGAAGA-3'/N9-R：5'-CGGGGTACCTTAGAGGAAGTACTCTAT-3'，以重組質(zhì)粒pCAGGS-N9 為模板，采用上述引物以PrimeSTAR Max 高保真DNA 聚合酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反 應(yīng) 程 序 如 下：98 ℃10 s、55 ℃5 s、72 ℃60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增的N9 基因片段克隆至BamH I 和KpnI 雙酶切后的pFastBac HT A 載體，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBacHT A-N9，并經(jīng)PCR 和測(cè)序鑒定，以無菌水作為陰性對(duì)照。

1.3 重組桿粒的構(gòu)建與鑒定將構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacHT A-N9 轉(zhuǎn)化至DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組桿粒rBacmid-N9。并分別利用N9 基因特異性引物N9-F/N9-R 和M13 通用引物（M13-F：5'-GTT TTCCCAGTCACGAC-3'/M13-R：5'-CAGGAAACAGCT ATGAC-3'）經(jīng)PCR 和測(cè)序鑒定，以無菌水作為陰性對(duì)照。

1.4 重組桿狀病毒的拯救與鑒定利用昆蟲細(xì)胞專用轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin 將重組桿粒rBacmid-N9 轉(zhuǎn)染至密度約70%且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的sf21 昆蟲細(xì)胞中，28 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變（CPE）后，收獲細(xì)胞上清作為P1 代重組桿狀病毒。將P1 代病毒以2%比例感染sf21 細(xì)胞傳至P3 代，提取P3 代重組桿狀病毒基因組作為模板，采用N9-F/N9-R 經(jīng)PCR 鑒定，以無菌水作為陰性對(duì)照。

1.5 N9 蛋白表達(dá)的間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）將1.4 收獲的P3 代重組桿狀病毒用Grace 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液10 倍倍比稀釋（101～108）后接種于96 孔板中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的sf21 細(xì)胞，并以不接種病毒的sf21 細(xì)胞作為陰性對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)至感染組細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE后，用4%多聚甲醛固定感染組和對(duì)照組細(xì)胞，以鼠源N9 蛋白MAb（1：500）作為一抗，DyLight488 標(biāo)記羊抗鼠IgG（1：1 000）作為二抗，利用IFA 鑒定重組N9蛋白的表達(dá)，并根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算重組桿狀病毒的滴度。

1.6 重組N9 蛋白的反應(yīng)原性鑒定結(jié)果將1.4 收獲的P3 代重組桿狀病毒以MOI 1 感染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的sf21 細(xì)胞，并以不接種病毒的sf21 昆蟲細(xì)胞作為陰性對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)至感染組細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE 后，利用細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒提取感染組和對(duì)照組細(xì)胞的膜蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，以鼠源N9 蛋白MAb（1：500）作為一抗，DyLight 800 標(biāo)記羊抗鼠IgG（1：5 000）作為二抗，利用western blot 鑒定重組N9 蛋白的表達(dá)。

為進(jìn)一步檢測(cè)重組N9 蛋白的反應(yīng)原性，利用細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒提取重組桿狀病毒感染的sf21 細(xì)胞的細(xì)胞膜總蛋白作為包被抗原，建立間接ELISA 方法，檢測(cè)已知的8 份N9 蛋白抗體陽性雞血清和8份N9蛋白抗體陰性雞血清。具體步驟如下：將提取的細(xì)胞膜總蛋白稀釋至5.75 μg/mL，100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜；5%脫脂乳37 ℃封閉1 h；以待檢血清（1：400）作為一抗，37 ℃孵育1 h；兔抗雞IgY-HRP（1：3 000）作為二抗，37 ℃孵育1 h；TMB 顯色10 min 后，加入2 mol/L 濃硫酸終止反應(yīng)，讀取OD450nm值。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組轉(zhuǎn)移載體與重組桿粒的的構(gòu)建與鑒定以重組質(zhì)粒pCAGGS-N9 為模板，利用N9 特異性引物擴(kuò)增N9 基因，并通過BamH I 和KpnI 雙酶切后克隆至pFastBac HT A 載體，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac HT A-N9，PCR 鑒定結(jié)果顯示，在約1 400 bp 處出現(xiàn)目的條帶（圖1A），與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacHT A-N9 正確構(gòu)建。將該重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacHT A-N9 轉(zhuǎn)化DH10Bac，通過菌液PCR 鑒定重組桿粒。結(jié)果顯示：利用M13 引物和N9 特異性引物分別擴(kuò)增出約3 800 bp 和1 400 bp 的目的條帶（圖1B），與預(yù)期大小均相符。表明重組桿粒rBacmid-N9 正確構(gòu)建。

圖1 重組轉(zhuǎn)移載體（A）和重組桿粒（B）的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant transfer vector(A)and recombinant bacmid(B)by PCR

2.2 重組桿狀病毒的拯救與鑒定將重組桿粒rBacmid-N9 轉(zhuǎn)染sf21 細(xì)胞，培養(yǎng)72 h 后，可觀察到明顯CPE。P3 代重組桿狀病毒經(jīng)PCR 鑒定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出約1 400 bp的目的條帶（圖2），與預(yù)期大小相符。表明獲得了表達(dá)N9蛋白的重組桿狀病毒rBaculovirus-N9。

圖2 重組桿狀病毒的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant baculovirus by PCR

2.3 重組蛋白表達(dá)的IFA 鑒定結(jié)果將P3 代重組桿狀病毒10 倍倍比稀釋（101～108）后感染sf21 細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE 后經(jīng)IFA 鑒定。結(jié)果顯示：感染重組桿狀病毒的細(xì)胞出現(xiàn)特異性綠色熒光，并且大部分熒光集中在細(xì)胞膜，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)熒光（圖3），表明N9 蛋白可以在昆蟲細(xì)胞中正確表達(dá)。根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算重組桿狀病毒的滴度為108.25TCID50/mL。本研究為了提高重組桿狀病毒滴度以達(dá)到后期感染sf21 細(xì)胞的劑量要求，對(duì)P1 代重組桿狀病毒連續(xù)傳至P3代。重組桿狀病毒傳代一般不能超過3 代，因?yàn)殡S著傳代次數(shù)的增加其基因突變就會(huì)積累，其中有些突變可能會(huì)導(dǎo)致原有基因的功能喪失[9]。

圖3 重組N9蛋白表達(dá)的IFA鑒定結(jié)果（×200）Fig.3 The expression of recombinant N9 protein detected by IFA(×200)

本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的N9 蛋白為AIV 全長(zhǎng)NA 蛋白，NA 是一種同源四聚體II 型膜蛋白，由一個(gè)球狀的頭部、莖區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成，它們共同形成信號(hào)錨定序列，使NA 蛋白主要表達(dá)在感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上[10]。

2.4 重組蛋白反應(yīng)原性的鑒定結(jié)果將重組桿狀病毒按MOI 1 感染sf21 昆蟲細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE后，提取細(xì)胞的膜蛋白經(jīng)western blot 鑒定。結(jié)果顯示：感染重組桿狀病毒的細(xì)胞在55ku 處有特異性蛋白條帶（圖4），表明重組桿狀病毒可在sf21 細(xì)胞中表達(dá)N9 蛋白，并且表達(dá)的N9 蛋白能夠與鼠源N9 蛋白MAb 發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。

圖4 重組N9蛋白反應(yīng)原性的western blot鑒定結(jié)果Fig.4 The expression of recombinant N9 protein detected by western blot

同時(shí)，以含有N9 蛋白的sf21 細(xì)胞膜總蛋白作為包被抗原，初步建立檢測(cè)血清中N9 抗體的間接ELISA 方法，檢測(cè)已知的8 份N9 蛋白抗體陽性雞血清和8 份N9 蛋白抗體陰性雞血清，結(jié)果顯示：8 份N9 蛋白抗體陽性雞血清的OD450nm值（P）在0.869～1.586，8份N9蛋白抗體陰性雞血清的OD450nm值（N）在0.004～0.078，兩者差異均極顯著（P＜0.0001），表明本研究表達(dá)的重組N9蛋白具有良好的反應(yīng)活性，能夠作為間接ELISA 的包被抗原檢測(cè)免疫雞血清中的AIV N9蛋白抗體。

桿狀病毒—昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有對(duì)外源蛋白轉(zhuǎn)錄后糖基化、磷酸化等修飾的功能，可以表達(dá)出與天然蛋白功能相似的重組蛋白[10-11]。本研究利用該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)AIV N9 蛋白，IFA 結(jié)果顯示，表達(dá)的N9 蛋白主要錨定在細(xì)胞膜上。Western blot 和間接ELISA 結(jié)果表明，昆蟲細(xì)胞表達(dá)出的重組N9 蛋白具有良好的反應(yīng)原性，能夠與鼠源N9 蛋白MAb 和雞血清中的N9 蛋白抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。NA 蛋白只有以四聚體的形式存在才能保持良好的免疫原性，但由于桿狀病毒—昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)全長(zhǎng)NA 基因編碼的四聚體蛋白經(jīng)純化后穩(wěn)定性較差，因此省略純化步驟直接以感染的昆蟲細(xì)胞膜總蛋白作為包被抗原，其穩(wěn)定性較好，也有研究報(bào)道可以通過將NA蛋白的頭部區(qū)域與麻疹病毒磷蛋白的四聚體結(jié)構(gòu)域重組構(gòu)建重組蛋白以增加NA 蛋白的穩(wěn)定性[10-13]。這有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。綜上所述，本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組N9 蛋白經(jīng)IFA 結(jié)果顯示其主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，以表達(dá)重組N9 蛋白的重組桿狀病毒感染sf21 細(xì)胞后，提取含重組N9 蛋白的細(xì)胞膜總蛋白作為包被抗原，可以增強(qiáng)包被的重組N9 蛋白的穩(wěn)定性，同時(shí)還節(jié)約了蛋白純化成本，且以感染AIV 的細(xì)胞膜總蛋白作為包被抗原初步建立檢測(cè)雞血清中N9 蛋白抗體的間接ELISA 方法，避免了以全病毒作為包被抗原可能出現(xiàn)的病毒滅活不徹底等生物安全隱患，具有良好的應(yīng)用前景。