野生藍(lán)莓根際真菌群落特征研究

楊秀麗

(呼和浩特職業(yè)學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生系，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051)

野生藍(lán)莓為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)多年生落葉或常綠灌木型果樹(shù)，因果實(shí)多呈現(xiàn)藍(lán)色，所以通常稱(chēng)為藍(lán)莓(Blueberry)。越橘屬植物分布廣泛，從熱帶一直到北極圈都有，全屬計(jì)約300種以上，但集中分布于東南亞熱帶高山、東亞溫帶和亞熱帶、中南美洲以及北美東部4個(gè)地區(qū)[1]。越桔屬植物在我國(guó)約產(chǎn)65種，集中分布于西南幾省，特別是云南分布的種類(lèi)約占全國(guó)1/2左右，但大多數(shù)種類(lèi)尚未發(fā)現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。有利用價(jià)值的除烏飯樹(shù)(Vaccinium.sprengelii Sleumer)分布較廣，在11個(gè)省有零星分布以外，篤斯越橘(Vaccinium uliginosum L)、紅豆越橘(Vaccinium vitis-idaea L.)和蔓越橘(Vaccinium macrocarpon L.)都局限于東北地區(qū)，蘊(yùn)藏量相當(dāng)大，有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[2]。其中，篤斯越橘經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值最高，在當(dāng)?shù)乇涣謪^(qū)被林區(qū)人們開(kāi)發(fā)成多種特色產(chǎn)品，具有可觀的經(jīng)濟(jì)收益。而且篤斯越橘耐寒性極強(qiáng)，可抵御-50℃的低溫，是森林中天然生長(zhǎng)的野生水果資源[3]。大興安嶺素以高寒著稱(chēng)，被認(rèn)為是水果栽培的禁地，而野生篤斯越橘(野生藍(lán)莓)卻生長(zhǎng)繁茂，如果能對(duì)其有效的開(kāi)發(fā)利用，對(duì)本地經(jīng)濟(jì)有積極的補(bǔ)充作用。

對(duì)藍(lán)莓的研發(fā)近年來(lái)也逐漸受到關(guān)注，本研究對(duì)大興安嶺地區(qū)野生藍(lán)莓根際土壤真菌的多樣性情況進(jìn)行調(diào)查研究，擬對(duì)本地區(qū)野生藍(lán)莓的資源保護(hù)、開(kāi)發(fā)、利用提供本底數(shù)據(jù)。

筆者曾對(duì)本地區(qū)野生藍(lán)莓的菌根及其真菌進(jìn)行了研究，因野生藍(lán)莓與菌根菌形成了廣泛的互惠共生體——菌根。野生藍(lán)莓根系呈纖維狀，沒(méi)有根毛，但在自然狀態(tài)下，野生藍(lán)莓根系與菌根真菌共生形成杜鵑類(lèi)菌根(Ericoid mycorrhiza ERM)，又稱(chēng)毆石楠類(lèi)菌根。ERM在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高養(yǎng)分吸收率、生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)及保護(hù)植物抵御不良環(huán)境脅迫中起關(guān)鍵作用[4-6]。許多與野生藍(lán)莓形成的菌根都被證明能促進(jìn)越橘對(duì)礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收和利用，改善植株?duì)I養(yǎng)狀況，調(diào)節(jié)宿主的代謝活性，增強(qiáng)植株的抗逆性，提高越橘的產(chǎn)量，加快移栽苗成活速度，節(jié)約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和效益。因此對(duì)其菌根菌的研究很有必要?？晒P者在研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)培養(yǎng)法無(wú)法準(zhǔn)確反映野生藍(lán)莓根際菌根菌和土壤中其他真菌的真實(shí)情況，因?yàn)楹芏嗾婢鷤鹘y(tǒng)方法培養(yǎng)不出來(lái)。

隨著核酸測(cè)序的快速發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，拓展了人們對(duì)環(huán)境微生物的認(rèn)識(shí)，使其成為對(duì)難以培養(yǎng)微生物或不可培養(yǎng)微生物群落研究的技術(shù)策略，能夠讓人們直接從環(huán)境中獲取總DNA，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析[7]，從整體水平上盡可能揭示根際真菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性。本研究也采用了高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)野生藍(lán)莓根際真菌群落特征進(jìn)行分析研究，得到了較全面的野生藍(lán)莓越桔根際真菌的群落數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)區(qū)位于內(nèi)蒙古大興安嶺森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站(以下簡(jiǎn)稱(chēng)大興安嶺森林生態(tài)站)。該站是國(guó)家林業(yè)局中國(guó)森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究網(wǎng)絡(luò)(CFERN)和科技部國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究網(wǎng)絡(luò)(CNERN)的站點(diǎn)成員，是我國(guó)緯度最高的、也是寒溫帶地區(qū)唯一的國(guó)家級(jí)森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站。該站地理坐標(biāo)為N50°49′～50°51′，E121°30′～121°31′。

在大興安嶺森林生態(tài)系統(tǒng)定位站附近原始林區(qū)選取有代表性的野生藍(lán)莓群落，采樣方法為5點(diǎn)法。采集野生藍(lán)莓根和根際土壤6份地表以下10～30cm的土層，混合為1個(gè)樣本，每個(gè)樣本30g。經(jīng)4.5mm孔徑篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾掉植物殘留物和顆粒，放入-20°C的冰箱保存[8]。

1.2 DNA提取

樣本取30g，利用Power Soil DNA TM extraction kit(MoBio Laboratories Inc.,Carlsbad,CA,USA)試劑盒提取。操作依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)入網(wǎng)站查詢(http://link.springer.com/article/10.1007/s10482-011-9624-8)。

采用引物ITS5-1737F：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；ITS2-2043R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC進(jìn)行擴(kuò)增。

采用 Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)得到的下機(jī)數(shù)據(jù)，稱(chēng)之為Raw PE，然后進(jìn)行拼接和質(zhì)控，得到Clean Tags，再進(jìn)行嵌合體過(guò)濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，即Effective Tags。

1.3 測(cè)序

北京諾禾致源生物信息科技有限公司代為測(cè)序。根據(jù)所擴(kuò)增的各區(qū)域特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)適用于該區(qū)域的數(shù)據(jù)質(zhì)控的軟件Microbial-weijie。完成建庫(kù)后利用MiSeq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，運(yùn)用軟件Microbial-weijie對(duì)產(chǎn)生的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控。

建庫(kù)測(cè)序：基于Illumina Miseq技術(shù)測(cè)序平臺(tái)，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序(Paired-End)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將得到的優(yōu)化序列通過(guò)聚類(lèi)分析獲得OTUs,按相似度97%進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Units)的聚類(lèi)，選取每個(gè)類(lèi)最長(zhǎng)的序列為代表序列然后調(diào)用RDP—classifier的方法，以RDP數(shù)據(jù)庫(kù)的序列為訓(xùn)練集對(duì)OTU代表序列進(jìn)行注釋?zhuān)罱K得到每個(gè)OTU分類(lèi)學(xué)信息。

利用Qiime軟件對(duì)所有序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽取到的序列數(shù)與其所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，同時(shí)計(jì)算樣品中的真菌群落豐富度指數(shù)Chao1和多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表1，測(cè)序共獲得clean reads 24090個(gè),從樣本中獲得的優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度分布在188～388bp，其中堿基數(shù)大于198bp的獲得優(yōu)質(zhì)序列24082條。

表1 獲得的序列情況

2.2 OTUs(operational taxonomic units)分析：OTU分析和物種注釋

為了研究樣品的物種組成多樣性，對(duì)所有樣品的過(guò)濾嵌合體后，最終用于后續(xù)分析的Effective Tags進(jìn)行聚類(lèi)，以97%的一致性(Identity)將序列聚類(lèi)成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，然后對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋?；?7%的相似度水平，共獲得282個(gè)OTUs利用reads。

OTUs稀釋曲線來(lái)評(píng)估樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足夠從稀釋曲線可以看出，見(jiàn)圖1,樣本的稀釋曲線均趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序趨于飽和，測(cè)得的數(shù)據(jù)可以反映土壤根際真菌群落的真實(shí)情況。

圖1 樣本的稀釋曲線

2.2.1 樣品中界門(mén)綱目科屬種情況

從樣品中共獲得有效序列17575條，在門(mén)水平上共得到14374條序列，占總序列81.787%，在屬種水平上共獲得序列14030條，占總序列的79.829%。

表2 界門(mén)綱目科屬種(k,p,c,o,f,g,s)水平上的Tags數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

2.2.2 樣品的Tags及OTUs(operational taxonomic units)數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

從樣品中獲得的有效序列總數(shù)為17575條，可以分類(lèi)的序列數(shù)為15661條。獲得的操作分類(lèi)單元(OTUs)282個(gè)。

表3 樣品的Tags及OTUs數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

2.2.3 樣品中的真菌在門(mén)水平上的分類(lèi)情況

282個(gè)OUTs分屬于真菌領(lǐng)域的3個(gè)門(mén)和4個(gè)潛在的菌門(mén)和其它未分類(lèi)菌門(mén)。其中屬于子囊菌亞門(mén)的最多，占比0.707。

表4 樣品中的真菌分門(mén)統(tǒng)計(jì)表

2.2.4 樣品中占比前10的屬情況

樣品中14030個(gè)序列被確定分屬于165個(gè)屬，其中排名前10的屬見(jiàn)表5。Sordariomycetes屬真菌最多，占比0.275。

表5 樣品中的真菌分門(mén)統(tǒng)計(jì)表

2.2.5 單樣品中特定物種分類(lèi)樹(shù)

樣品中的真菌，在分類(lèi)樹(shù)上聚為4大類(lèi)，子囊菌為最大的一類(lèi)，占52.238%，擔(dān)子菌為第2大類(lèi)，占6.508%，見(jiàn)圖2。

圖2 物種分類(lèi)樹(shù)

2.3 樣品的Alpha多樣性分析

采用Alpha多樣性指數(shù)中的香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)和Chao1指數(shù)對(duì)樣品序列進(jìn)行了分析。Chao1指數(shù)為277.7771，Shannon為5.6502。

3 結(jié)論

從野生藍(lán)莓根部土壤中分離出的真菌隸屬于3個(gè)門(mén)和4個(gè)潛在的菌門(mén)和其它未分類(lèi)菌門(mén)，分屬于165個(gè)屬。排位在前10的屬分別為Sordariomycetes，F(xiàn)usarium，Russula，Cephalotrichum，Trichoderma，Alternaria，Eupenicillium，Suillus，Un--s-fungal endophyte，Un--s-Ascomycota。

圖3 Chao1指數(shù)圖 圖4 Shannon指數(shù)圖

Alpha多樣性指數(shù)選擇香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)和Chao1指數(shù)對(duì)樣品序列進(jìn)行了分析。樣本的豐富度指數(shù)Chao1表明樣品中真菌豐富度水平較高，多樣性指數(shù)Shannon表明樣品中多樣性水平較高。

以DNA測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的新一代高通量測(cè)序技術(shù)使得對(duì)野生藍(lán)莓根際真菌群落的研究更全面直觀，比用傳統(tǒng)方法能探查到的真菌種類(lèi)多得多。這與之前學(xué)者研究結(jié)果相似，即使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法無(wú)法準(zhǔn)確反映土壤中真菌的真實(shí)情況[9]，傳統(tǒng)方法僅能反映占土壤真菌總量的1%的可培養(yǎng)真菌的狀況，常用的克隆文庫(kù)分析則存在耗時(shí)耗力、通量低、分辨率低等的不足[10]。相對(duì)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法以及克隆文庫(kù)等常規(guī)的分子生態(tài)學(xué)研究方法，高通量測(cè)序明顯擁有通量高、獲得信息豐富、快捷等優(yōu)勢(shì)[11]。

而且與筆者之前用傳統(tǒng)方法研究得出的結(jié)果相比較，本次從野生藍(lán)莓根際土壤中探查到165個(gè)屬的真菌，而傳統(tǒng)方法從野生藍(lán)莓根樣中分離得到的真菌分為6個(gè)類(lèi)群：膜盤(pán)菌屬(Hymenoscyphus)真菌，Phialocephala真菌，粒毛盤(pán)菌屬(Lachnum)真菌，Cadophora真菌，擔(dān)子菌小皮傘屬(Marasmius),擔(dān)子菌小菇屬(Mycena)[12]。

這165個(gè)屬的真菌哪些是與篤斯越桔菌根有密切關(guān)系的類(lèi)群，還需要進(jìn)一步的研究。