靈芝三萜生物合成的研究進(jìn)展

朱靜,師亮,任昂,劉銳,趙明文

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食用菌加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

食藥用菌自古被稱(chēng)為山珍,含有豐富的膳食纖維和活性成分,具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。靈芝,俗稱(chēng)赤芝,作為一種著名的大型藥用真菌,能產(chǎn)生大量的具有生物活性的化合物,具有極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值和經(jīng)濟(jì)發(fā)展前景。栽培過(guò)程中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及溫度、光照等環(huán)境因素,栽培基質(zhì)中碳源、氮源、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分,均能顯著影響靈芝的品質(zhì)形成。雖然目前通過(guò)改變環(huán)境條件和基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)能夠提高靈芝三萜的含量,但是其中的分子調(diào)控機(jī)制不清晰。靈芝三萜的生物合成是遺傳、基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、栽培環(huán)境三者相互作用的結(jié)果,從分子生物學(xué)角度解析基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和栽培環(huán)境調(diào)控靈芝三萜合成的機(jī)制,能夠?yàn)槔迷耘喹h(huán)境優(yōu)化和基因工程技術(shù),提高靈芝活性成分含量提供理論基礎(chǔ)。

1 靈芝的活性成分及藥用價(jià)值

靈芝最早記錄于我國(guó)東漢年間第一部藥物學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》,被認(rèn)為有“扶正固本”“滋補(bǔ)強(qiáng)身”的功效,在民間被譽(yù)為“不死草”“仙草”。靈芝為擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)傘菌綱(Agaricomycetes)多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌。作為重要的一種白腐真菌,靈芝在世界各地均有分布,其中絕大部分生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū),我國(guó)亦是靈芝資源分布廣泛的地區(qū)。靈芝子實(shí)體于夏、秋季單生、群生或叢生在闊葉樹(shù)和松科等木樁、根際或樹(shù)上,具有很強(qiáng)的降解纖維素和木質(zhì)素的能力[1]。

作為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材,靈芝具有極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。研究人員已經(jīng)從靈芝的子實(shí)體、孢子和菌絲等組織中分離得到約100種生物活性成分,主要包括多糖、三萜、蛋白質(zhì)、類(lèi)固醇、甾醇、核苷酸等,具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎、保肝等作用[2-3],其中三萜類(lèi)是目前靈芝中主要研究的生物活性物質(zhì)。靈芝三萜類(lèi)化合物由6個(gè)異戊二烯單元組成,主要有五環(huán)三萜和四環(huán)三萜2類(lèi),按分子所含碳原子數(shù)可分為C30、C27、C24三大類(lèi),相對(duì)分子質(zhì)量為400～600。靈芝三萜化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,本身高度氧化,常溫下為固體粉狀,難溶于水,多數(shù)具有苦、澀味。研究表明萜類(lèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除自由基和降低炎癥反應(yīng)的作用[4],可以直接抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[5],并通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的DNA結(jié)合活性來(lái)實(shí)現(xiàn)降低炎癥反應(yīng)[6],增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)以及延長(zhǎng)壽命[7]等功能。

2 靈芝三萜的生物合成途徑及其參與合成的基因

三萜類(lèi)化合物目前已分離出140余種,其分類(lèi)可以根據(jù)分子中所含碳原子數(shù),分為C30、C27以及C24三大類(lèi);也可根據(jù)官能團(tuán)和側(cè)鏈不同,分為靈芝酸、靈芝內(nèi)酯、赤靈酸、靈芝醇等十余種[8]。1992年,Shiao等[9]將5-13C標(biāo)記的甲羥戊酸加入發(fā)酵液培養(yǎng)基中,利用同位素示蹤技術(shù)在三萜產(chǎn)物中檢測(cè)到了13C標(biāo)記的3α和3β類(lèi)型的靈芝三萜,證明靈芝三萜通過(guò)甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA pathway)合成。其具體合成路徑見(jiàn)圖1。合成靈芝三萜的最初底物是乙酰輔酶A,由角鯊烯-2,3-環(huán)氧化經(jīng)環(huán)化產(chǎn)生原甾醇,原甾醇通過(guò)隨后的主鏈重排產(chǎn)生關(guān)鍵的中間代謝物羊毛甾醇。目前研究表明有11個(gè)酶參與了羊毛甾醇的合成[10],其中HMG-CoA還原酶(HMG-CoA reductase,HMGR)、鯊烯合酶(squalene synthase,SQS)、氧化鯊烯環(huán)化酶(oxidosqualene cyclase,OSC)被認(rèn)為是合成羊毛甾醇的限速酶[11]。靈芝三萜屬于高度氧化的羊毛甾醇衍生物,結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變。通過(guò)對(duì)靈芝的基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了大量的細(xì)胞色素P450,包括24個(gè)P450基因簇以及78個(gè)P750基因[1]。羊毛甾醇經(jīng)過(guò)不同的細(xì)胞色素氧化酶氧化、還原和?；确磻?yīng)生成結(jié)構(gòu)不同的靈芝三萜。

圖1 靈芝三萜生物合成途徑[9-10]Fig.1 The biosynthesis pathway of ganoderic acids[9-10]ACAT:乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶 Acetyl-CoA acetyltransferase;HMGS:3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase;HMGR:3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase;MVK:甲羥戊酸激酶 Mevalonate kinase;MVD:焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶 Pyrophosphomevalonate decarboxylase;IDI:異戊二烯焦磷酸異構(gòu)物酶 Isopentenyl diphosphate isomerase;FPS:法呢酯焦磷酸合酶 Farnesyl diphosphate synthase;SQS:鯊烯合酶 Squalene synthase;SE:鯊烯環(huán)氧化酶Squalene epoxidase;OSC:羊毛甾醇合酶 2,3-oxidosqualene-lanosterol cyclase;CYP51:甾醇-14α-去甲基酶 Sterol 14α-demethylase.

3 環(huán)境條件調(diào)控靈芝三萜的生物合成

由于靈芝液體發(fā)酵具有培養(yǎng)周期短,發(fā)酵條件容易控制,產(chǎn)量和質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),因此,用靈芝的發(fā)酵物開(kāi)發(fā)靈芝產(chǎn)品也是一個(gè)趨勢(shì)。針對(duì)靈芝液體發(fā)酵條件的研究,主要集中在發(fā)酵條件以及外源添加化合物方面。表1匯總了發(fā)酵條件及外源添加物對(duì)靈芝三萜合成的影響。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基的pH、碳氮源、溶氧量、光照、添加的化學(xué)試劑(如茉莉酸甲酯、水楊酸等),可以顯著影響靈芝三萜的合成。盡管這些優(yōu)化研究方案在應(yīng)用上具有一定的價(jià)值,但是在實(shí)際生產(chǎn)中培養(yǎng)基成分相對(duì)復(fù)雜且各成分之間存在交互作用,傳統(tǒng)的發(fā)酵條件并不利于開(kāi)展靈芝三萜生物合成機(jī)制的研究。

表1 影響靈芝三萜生物合成的條件Table 1 Conditions affecting ganoderic acid biosynthesis

4 參與靈芝三萜合成的相關(guān)蛋白對(duì)靈芝三萜合成的調(diào)控

2012年Chen等[1]首次報(bào)道了靈芝單核菌株260125的全基因組序列,其基因組大小約43.3 Mb,預(yù)測(cè)編碼了16 113個(gè)基因,其中含有大量的細(xì)胞色素P450家族基因及纖維素和木質(zhì)素降解基因,并且大部分屬于靈芝中特有的編碼基因。靈芝基因組測(cè)序的完成為靈芝功能基因組學(xué)研究提供了寶貴的序列信息,為研究靈芝三萜的生物合成及調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

4.1 直接參與靈芝三萜合成的關(guān)鍵蛋白對(duì)靈芝三萜合成的影響

許多研究對(duì)靈芝三萜生物合成途徑中的多個(gè)關(guān)鍵酶的基因進(jìn)行了克隆分析:包括鯊烯合酶[31]、羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶[32]、法呢酯焦磷酸合酶[33]、羊毛甾醇合酶[34]、羥甲基戊二酰輔酶A 合酶[35]和鯊烯單加氧酶、乙酰乙酰輔酶A 乙?；D(zhuǎn)移酶[36]、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸脫羧酶[37]以及細(xì)胞色素P450 還原酶基因等[38]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該途徑中基因的表達(dá)量與靈芝三萜含量密切相關(guān)。例如:利用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝菌絲時(shí),與液體培養(yǎng)相比,角鯊烯合酶(squalene synthase,SQS)和羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase,LS)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,胞內(nèi)靈芝三萜的含量也顯著升高[39]。此外,添加鈉離子或者錳離子也能夠顯著提高h(yuǎn)mgr、sqs和ls基因的轉(zhuǎn)錄水平,與未添加相比靈芝三萜含量分別提高了2.8和2.2倍[40]。乙烯的添加能夠顯著提高sqs、ls、hmgs以及cyp51的轉(zhuǎn)錄水平,靈芝三萜的含量提高約1.05倍[29],但是靈芝三萜含量與靈芝三萜合成途徑中的基因轉(zhuǎn)錄水平并不總是正相關(guān)。隨著遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立,通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)將這些基因(如甲羥戊酸脫羧酶[37]和靈芝甾醇14α-脫甲基酶[38])進(jìn)行過(guò)表達(dá)后,結(jié)果表明靈芝三萜含量分別提高了約1.0和1.6倍。

4.2 間接參與靈芝三萜合成的關(guān)鍵調(diào)控蛋白對(duì)靈芝三萜合成的影響

除了對(duì)直接參與靈芝三萜合成途徑的蛋白進(jìn)行研究分析之外,近年來(lái)針對(duì)靈芝三萜生物合成關(guān)鍵調(diào)控蛋白的研究也成為熱點(diǎn)。通過(guò)比較不同三萜合成水平下的靈芝轉(zhuǎn)錄組差異,篩選到一些調(diào)控蛋白,涉及多種酶類(lèi)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白以及一些轉(zhuǎn)錄因子等[29]。進(jìn)一步通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默單一基因后,發(fā)現(xiàn)交替氧化酶(AOX)[41]、NADPH氧化酶(NOX)[42]及多胺合成關(guān)鍵酶(ODC)[43]基因沉默后能夠通過(guò)影響胞內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)進(jìn)而參與調(diào)控靈芝三萜含量。在高溫處理靈芝菌絲后,發(fā)現(xiàn)磷脂酶D(PLD)和磷脂酸(PA)介導(dǎo)了靈芝三萜的生物合成[19,44]。此外,還發(fā)現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄因子參與靈芝三萜的生物合成,如響應(yīng)環(huán)境pH的轉(zhuǎn)錄因子PacC、APSES型轉(zhuǎn)錄因子Swi6、參與氮代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AreA和GCN4[14,16,45-47]。雖然現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵調(diào)控蛋白在靈芝三萜生物合成中具有重要作用,通過(guò)基因工程也能提高靈芝三萜含量,但采用單個(gè)基因調(diào)控的方式提高靈芝三萜含量已經(jīng)接近瓶頸,因此,為了進(jìn)一步提高靈芝三萜含量,通過(guò)深入解析具體調(diào)控機(jī)制,完善靈芝三萜生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已成為當(dāng)務(wù)之急。

5 信號(hào)分子參與調(diào)控的靈芝三萜的生物合成

許多信號(hào)分子在靈芝三萜生物合成的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)、鈣離子、一氧化氮(NO)以及環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)等信號(hào)。這些信號(hào)分子在植物和動(dòng)物中均參與各項(xiàng)生理活動(dòng),但在微生物中,特別是大型擔(dān)子菌中的研究近年來(lái)才剛起步。

5.1 ROS信號(hào)

活性氧包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基,它作為信號(hào)分子能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝等生理過(guò)程。在靈芝中,ROS可以誘導(dǎo)許多參與靈芝三萜生物合成的基因表達(dá),如hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs、osc、acat、se和cyp51,進(jìn)而調(diào)控三萜合成[48]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶以及線(xiàn)粒體是胞內(nèi)ROS的重要來(lái)源,它們通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)ROS的含量進(jìn)而影響靈芝三萜的合成[28,42]。參與清除胞內(nèi)活性氧的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶,能夠通過(guò)調(diào)控靈芝細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,進(jìn)而調(diào)控靈芝三萜的生物合成和菌絲分叉[49]。在前期對(duì)ROS產(chǎn)生及清除酶系的系統(tǒng)研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步解析了ROS信號(hào)通路對(duì)靈芝三萜生物合成的影響,發(fā)現(xiàn)可以采用乙酸提高胞內(nèi)的ROS水平,進(jìn)而提高靈芝三萜的生物合成。當(dāng)采用富氫水降低胞內(nèi)ROS水平后,胞內(nèi)靈芝三萜的生物合成降低。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),富氫水可以通過(guò)激活靈芝體內(nèi)的GPX活性以及提高細(xì)胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽含量來(lái)降低胞內(nèi)的ROS水平[50]。此外,某些功能蛋白如轉(zhuǎn)錄因子PacC、SKN7和slt2/MAPK等功能的缺失,也能夠調(diào)控靈芝胞內(nèi)ROS的含量[46,51]。大量研究表明,胞內(nèi)ROS含量的變化能夠顯著影響靈芝三萜的生物合成,但具體分子調(diào)控機(jī)制目前仍不清晰。

5.2 NO信號(hào)

NO是一種具有較高自由基活性的氣體分子,能作為信號(hào)分子在胞內(nèi)傳遞信號(hào),在生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。NO是影響細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的重要信號(hào)分子,能夠顯著影響人參皂苷、青蒿素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。雖然對(duì)NO生物學(xué)功能的研究大多集中在動(dòng)物和植物研究中,但是人們?cè)谡婢难芯恐幸仓饾u發(fā)現(xiàn)了NO具有重要的調(diào)控作用。在靈芝中胞內(nèi)NO能夠緩解由于熱脅迫造成的靈芝三萜含量的積累[20,52]。轉(zhuǎn)錄因子AreA能夠通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)NO含量抑制靈芝三萜的生物合成[14];而與之相反的是,茉莉酸甲酯的添加能夠激活硝酸還原酶的活性,進(jìn)而產(chǎn)生大量的NO促進(jìn)了靈芝三萜的生物合成[53]。這些結(jié)果顯示NO在不同條件下可能具有雙向調(diào)控作用。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)NO調(diào)控靈芝三萜合成的機(jī)制進(jìn)行深入研究,發(fā)現(xiàn)NO作為一種活躍的氣體信號(hào)分子,能夠通過(guò)S-亞硝基化和硝基化2種翻譯后修飾方式,影響靶蛋白結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、酶活等性質(zhì),從而參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能[54]。目前研究顯示,亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)是蛋白質(zhì)亞硝基化修飾所需亞硝基的主要來(lái)源之一。GSNOR介導(dǎo)的S-亞硝基化修飾能夠抑制靈芝三萜的生物合成[55]。胞內(nèi)NO還能與超氧陰離子生成過(guò)氧化亞硝酸鹽,而過(guò)氧化亞硝酸鹽可以在體內(nèi)或者體外使酪氨酸殘基酚環(huán)的3位發(fā)生蛋白酪氨酸硝基化。研究表明NO能夠通過(guò)硝基化修飾抑制靈芝谷氨酰胺合成酶的活性,進(jìn)而降低胞內(nèi)谷氨酰胺的含量,最終抑制靈芝菌絲的生長(zhǎng)及靈芝三萜的生物合成[56]。在靈芝中已經(jīng)開(kāi)展了對(duì)NO的2種翻譯后修飾的研究,但僅僅針對(duì)2種功能酶的研究,NO是否能夠通過(guò)翻譯后修飾調(diào)控靈芝三萜合成途徑中的關(guān)鍵酶,是否能夠通過(guò)更廣泛的調(diào)控,從而影響關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子或者其他信號(hào)通路影響靈芝三萜的生物合成,仍需深入研究。對(duì)這些調(diào)控機(jī)制的研究能豐富我們對(duì)NO與真菌次級(jí)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的認(rèn)識(shí)。

5.3 鈣離子信號(hào)

鈣離子作為胞內(nèi)重要的第二信使,能夠調(diào)節(jié)生物體的基因表達(dá)以及響應(yīng)生物和非生物脅迫過(guò)程[57]。胞內(nèi)鈣離子能夠通過(guò)影響鈣離子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力,激活鈣調(diào)蛋白(CaM)、鈣離子依賴(lài)蛋白激酶、CaM結(jié)合蛋白激酶、CaM激酶等,磷酸化或去磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而激活或抑制下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[58]。鈣信號(hào)對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控在植物和真菌中均有研究報(bào)道。例如:Ca2+/鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白DWF1對(duì)于油菜素內(nèi)酯的合成至關(guān)重要[59];在人參中,外源添加鈣離子是提高人參皂苷合成的一個(gè)有效的方法[60];鈣離子的添加雖然能夠促進(jìn)尾孢菌的菌絲生長(zhǎng),但是卻導(dǎo)致尾孢菌素含量下降[61]。在前期研究中發(fā)現(xiàn),在靈芝液體培養(yǎng)時(shí),外源添加10 mmol·L-1鈣離子能夠顯著提高靈芝三萜的生物合成水平;當(dāng)添加環(huán)孢素A或者氯丙嗪抑制鈣離子內(nèi)流后,hmgr、sqs和ls的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降[22]。在靈芝栽培試驗(yàn)中,添加鈣離子也提高了子實(shí)體中靈芝三萜的合成水平[62]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)熱脅迫能夠通過(guò)提高胞內(nèi)鈣離子的含量提高靈芝三萜的含量,并且在這一過(guò)程中鈣離子通道蛋白(CCH)、磷脂酶C(PLC)以及CaM發(fā)揮了重要的作用[63]。在大型真菌中,鈣離子信號(hào)對(duì)于次級(jí)代謝調(diào)控的研究報(bào)道較少。因此,研究鈣信號(hào)調(diào)控靈芝三萜的生物合成水平對(duì)提高靈芝附加值具有重要意義。

5.4 其他信號(hào)

研究發(fā)現(xiàn)除了上述信號(hào)分子參與靈芝的生長(zhǎng)及次級(jí)代謝外,越來(lái)越多的信號(hào)分子也被發(fā)現(xiàn)具有重要的生理功能,如H2S信號(hào)、cAMP信號(hào)、磷脂信號(hào)等。同時(shí),進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn)各個(gè)信號(hào)分子之間相互影響。外源添加H2S供體和清除劑,發(fā)現(xiàn)熱脅迫能夠提高胞內(nèi)H2S含量,升高的H2S能夠通過(guò)抑制胞內(nèi)鈣信號(hào),降低胞內(nèi)靈芝三萜的積累。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,進(jìn)一步揭示了H2S能夠影響胞內(nèi)ROS、NO、AMPK、磷脂等信號(hào)[64]。細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的增加會(huì)引起胞內(nèi)的氧化磷酸化復(fù)合蛋白過(guò)表達(dá),誘導(dǎo)靈芝三萜的產(chǎn)生[30]。Gu等[48]報(bào)道NO可以通過(guò)作用于ROS和MAPK的信號(hào),間接影響三萜合成基因的表達(dá);Liu等[20]報(bào)道發(fā)現(xiàn)外源添加NO供體能夠增加靈芝菌絲中Ca2+的含量,并且熱脅迫誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生也需要Ca2+信號(hào)參與。此外,NO也能夠通過(guò)抑制順烏頭酸酶活性降低線(xiàn)粒體中ROS含量,從而抑制靈芝三萜的積累[55]。磷脂酰肌醇(PI)能夠在磷脂酰肌醇激酶的催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?,5-二磷酸肌醇(PIP2),PIP2作為信號(hào)分子,促進(jìn)了胞內(nèi)鈣離子的增加[19]。當(dāng)添加阿司匹林誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后,發(fā)現(xiàn)靈芝三萜含量顯著升高了2.7倍,但是sqs和ls的轉(zhuǎn)錄水平卻下降[30]。對(duì)于不同信號(hào)參與及互作調(diào)控靈芝的生長(zhǎng)發(fā)育及次級(jí)代謝的機(jī)制研究,為今后利用相關(guān)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控靈芝三萜含量提供了技術(shù)手段。

6 環(huán)境因子通過(guò)調(diào)控功能基因及信號(hào)分子調(diào)控靈芝三萜的生物合成

環(huán)境因子對(duì)靈芝三萜生物合成的影響往往不是通過(guò)單一基因或單一信號(hào)分子調(diào)控的,而是多種調(diào)控基因及信號(hào)分子參與的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

6.1 高溫信號(hào)

高溫脅迫能夠影響幾乎所有生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和次生代謝等生理過(guò)程。高溫是靈芝栽培過(guò)程中最常遇到的脅迫,靈芝能夠激活多種信號(hào)通路或功能蛋白來(lái)感知響應(yīng)環(huán)境溫度的變化,通過(guò)對(duì)代謝及細(xì)胞功能的調(diào)控,防止過(guò)熱對(duì)細(xì)胞造成損傷或死亡,同時(shí)提高靈芝三萜的含量。在高溫條件下,靈芝GSNOR活性增強(qiáng),而由GSNOR介導(dǎo)的S-亞硝基化修飾抑制了順烏頭酸酶的活性,從而降低了線(xiàn)粒體內(nèi)的ROS含量,最終抑制了靈芝三萜的生物合成[55]。熱脅迫條件下增加的GSNOR酶活性能夠通過(guò)S-亞硝基化修飾過(guò)氧化氫酶的第401、642和653位的半胱氨酸位點(diǎn),抑制過(guò)氧化氫酶的活性,進(jìn)而抑制靈芝三萜的生物合成水平。高溫脅迫還可以提高靈芝胞內(nèi)Ca2+含量,調(diào)控菌絲分叉以及提高靈芝三萜生物合成[63];H2S能夠影響靈芝體內(nèi)多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,如通過(guò)負(fù)調(diào)控胞內(nèi)鈣信號(hào)來(lái)抑制由熱脅迫導(dǎo)致的靈芝三萜含量升高[64]。在高溫條件下,靈芝的細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng);當(dāng)采用化學(xué)試劑降低細(xì)胞膜流動(dòng)性時(shí),靈芝三萜的含量也隨之降低,說(shuō)明熱脅迫通過(guò)改變細(xì)胞膜流動(dòng)性來(lái)影響靈芝三萜的生物合成[44]。高溫也可以通過(guò)誘導(dǎo)熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)、提高Del-9脂肪酸脫氫酶活性等來(lái)提高靈芝菌絲對(duì)高溫脅迫的耐受性。Hu等[65]發(fā)現(xiàn)當(dāng)靈芝遭遇熱脅迫時(shí),靈芝snf1被迅速激活以及胞內(nèi)ROS迅速增加。激活的snf1通過(guò)對(duì)胞內(nèi)代謝流的重新分配,將呼吸轉(zhuǎn)向無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生大量的還原力,以抵御熱脅迫產(chǎn)生的ROS。這些研究結(jié)果表明高溫條件能夠通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路及功能基因,進(jìn)而提高靈芝三萜的生物合成。

6.2 營(yíng)養(yǎng)信號(hào)

碳源和氮源是靈芝生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要元素。改變培養(yǎng)環(huán)境中碳源和氮源的種類(lèi)和濃度能夠顯著影響靈芝三萜的生物合成,并且其對(duì)靈芝三萜生物合成的影響不同。與添加葡萄糖相比,添加微晶纖維素或D-半乳糖作為碳源時(shí),可以顯著增加三萜含量[13]。不同的氮源種類(lèi)以及濃度對(duì)靈芝的次級(jí)代謝也有顯著影響。如低濃度的硫酸銨、谷氨酰胺和天冬酰胺的培養(yǎng)條件有利于促進(jìn)靈芝三萜合成相關(guān)基因的表達(dá)[15]。與高濃度的天冬酰胺為唯一氮源相比,當(dāng)用低濃度的天冬酰胺培養(yǎng)時(shí),靈芝菌絲內(nèi)ROS顯著增加,有利于靈芝三萜的積累。此時(shí),全局性轉(zhuǎn)錄因子GCN4被激活,GCN4通過(guò)調(diào)控清除ROS相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄和活性水平,以防止胞內(nèi)ROS爆發(fā)對(duì)菌絲的傷害[16]。當(dāng)靈芝菌絲利用硝酸鹽為唯一氮源進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),轉(zhuǎn)錄因子AreA被激活,通過(guò)促進(jìn)硝酸還原酶的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)菌絲對(duì)硝酸鹽的吸收和利用以維持生長(zhǎng)[14]。但是在這一過(guò)程中產(chǎn)生的大量NO抑制靈芝三萜的合成,同時(shí)NO還通過(guò)翻譯后修飾抑制氮源吸收、利用過(guò)程中的谷氨酰氨合成酶活性,進(jìn)而抑制胞內(nèi)谷氨酰胺合成,最終抑制靈芝三萜的合成水平[56]。以上結(jié)果表明,在培養(yǎng)過(guò)程中使用初級(jí)碳源、次級(jí)氮源以及低濃度氮能夠促進(jìn)胞內(nèi)靈芝三萜的積累。

6.3 化合物信號(hào)

在靈芝培養(yǎng)中,通過(guò)添加植物激素和其他化合物,如水楊酸、茉莉酸甲酯、乙酸及阿司匹林等,能夠通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS信號(hào)、NO信號(hào)及線(xiàn)粒體功能等提高靈芝三萜的生物合成。使用200 mmol·L-1水楊酸處理后靈芝三萜的含量提高了約1.5倍[27]。水楊酸通過(guò)抑制線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅲ的活性,導(dǎo)致ROS過(guò)量產(chǎn)生,從而誘導(dǎo)靈芝三萜的生物合成[28]。茉莉酸甲酯處理靈芝菌絲會(huì)激活NADPH氧化酶,產(chǎn)生大量的ROS信號(hào),進(jìn)而促進(jìn)靈芝三萜的積累[66]。但是也有研究表明,茉莉酸甲酯處理能通過(guò)誘導(dǎo)硝酸還原酶活性的提高,產(chǎn)生NO信號(hào)分子,進(jìn)而促進(jìn)靈芝三萜的生物合成[53]。這些結(jié)果表明,多種信號(hào)分子及功能基因能夠相互作用,共同調(diào)控靈芝三萜的生物合成。

7 應(yīng)用與展望

萜烯類(lèi)化合物在許多中藥材中廣泛存在,并且具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,如靈芝三萜、人參皂甙、紫杉醇、青蒿素等。因此,對(duì)萜烯類(lèi)化合物生物合成機(jī)制的研究具有重要的意義。靈芝三萜是一種重要的藥用資源,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)它的研究主要集中在該類(lèi)化合物的分離和藥理特性上,而對(duì)其生物合成及其調(diào)控機(jī)制的研究較少。研究靈芝三萜生物合成及其調(diào)控機(jī)制,對(duì)提高其產(chǎn)量從而進(jìn)一步提高靈芝的藥用價(jià)值有著深遠(yuǎn)的影響。

基質(zhì)中碳源、氮源、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分,培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及環(huán)境脅迫如溫度、光照等環(huán)境因素均能影響靈芝三萜的生物合成。因此,通過(guò)改變營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件能夠提高靈芝三萜的含量,但是靈芝三萜的生物合成是遺傳、培養(yǎng)基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境三者相互作用的結(jié)果。從分子生物學(xué)角度解析靈芝三萜合成的機(jī)制,利用環(huán)境優(yōu)化和基因工程手段,可為提高靈芝活性成分含量提供研究基礎(chǔ)。靈芝有異核菌絲,生活史特殊,而對(duì)其遺傳及生理研究的平臺(tái)缺乏,相關(guān)基礎(chǔ)理論研究匱乏,因此研究難度較大,且分子技術(shù)創(chuàng)新受到嚴(yán)重制約。闡明靈芝優(yōu)良品質(zhì)形成的調(diào)控途徑,能夠?yàn)楦咂焚|(zhì)靈芝生產(chǎn)提供創(chuàng)新的理論依據(jù)和路徑指導(dǎo),形成優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)的新技術(shù)、新方法,使靈芝的生產(chǎn)逐漸從經(jīng)驗(yàn)化走向科學(xué)化,對(duì)提高我國(guó)藥用真菌產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

目前,對(duì)靈芝的研究主要圍繞著靈芝的主要藥用成分(靈芝三萜)的生物合成機(jī)制上,并開(kāi)展了環(huán)境調(diào)控靈芝三萜生物合成的研究工作。雖然越來(lái)越多的化學(xué)信號(hào)、物理刺激以及營(yíng)養(yǎng)條件被證明參與了靈芝三萜的生物合成調(diào)控,其中存在的分子機(jī)制也逐漸被認(rèn)識(shí)[67],但是在實(shí)際培養(yǎng)靈芝過(guò)程中的應(yīng)用卻較少。目前發(fā)現(xiàn)通過(guò)在子實(shí)體生長(zhǎng)過(guò)程中外源噴灑水楊酸和乙酸,或者添加適當(dāng)?shù)拟}離子,能夠顯著促進(jìn)靈芝子實(shí)體生長(zhǎng)并提高靈芝三萜的含量[62]。這些研究為生產(chǎn)中提高靈芝三萜的含量提供了有效的技術(shù)手段。今后應(yīng)進(jìn)一步將理論和應(yīng)用相結(jié)合,通過(guò)精準(zhǔn)調(diào)控培養(yǎng)過(guò)程中靈芝三萜的含量,為提高靈芝品質(zhì)開(kāi)發(fā)新技術(shù)。

雖然近年來(lái)已建立了簡(jiǎn)便易行的靈芝遺傳操作體系,如靈芝的過(guò)表達(dá)體系、RNA干擾技術(shù),但是現(xiàn)階段仍未有如模式生物一樣的研究平臺(tái),有關(guān)靈芝的遺傳操作體系也相對(duì)較少。因此,今后要建立新的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記技術(shù),例如營(yíng)養(yǎng)缺陷性和草甘膦抗性,并建立基因敲除技術(shù)(如CRISPR技術(shù))。通過(guò)完善遺傳操作體系并結(jié)合生理學(xué)研究,使靈芝成為潛在的研究藥用真菌次級(jí)代謝的模式菌種,為進(jìn)一步提高靈芝品質(zhì)提供理論基礎(chǔ),并為其他藥用真菌次級(jí)代謝的調(diào)控提供技術(shù)支撐。